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文檔簡介
SDS測量
蛋白質(zhì)分子量EXPERIMENT7
實驗目的學習聚丙烯酰胺凝膠聚合原理;學習不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠分離原理;掌握垂直板電泳的操作方法;學習SDS測蛋白分子量原理并測定。聚丙烯酰胺凝膠電泳—PAGE(Polyacryamidegelelectrophoresis)支持介質(zhì)-聚丙烯酰胺凝膠聚合原理:單體丙烯酰胺Acr交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學聚合光聚合引發(fā)劑(NH4)2S2O8
(NH4)2S2O8
核黃素
加速劑TEMEDDMAPNTEMED注:(NH4)2S2O8
過硫酸胺在凝膠形成中提供始自由基,通過自由基的傳遞,使丙烯酰胺成為自由基,發(fā)動聚合反應
TEMEDN,N,N,N-四甲基乙二胺DMAPNβ-二甲基胺基丙晴影響聚合因素大氣中氧能淬滅自由基,使聚合反應終止,所以在聚合過程中要使反應液與空氣隔絕。某些材料如有機玻璃,能抑制聚合反應。某些化學藥物可以減慢反應速度,如赤血鹽。溫度高聚合快,溫度低聚合慢。堿性條件下凝膠易聚合,其聚合速度與AP濃度的平方根成正比。聚丙烯酰胺凝膠優(yōu)點
化學性質(zhì)穩(wěn)定;凝膠孔徑可調(diào);重復性好;分辨率高;靈敏度高,可以測定10-6濃度的樣品。凝膠濃度的計算聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個重要參數(shù)T和C,T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關的交聯(lián)百分濃度。T與C的計算公式是:上式中a為丙烯酰胺的克數(shù),b為甲叉雙丙烯酰胺的克數(shù),m為水或緩沖液體積(ml)。式中a與b的比例很重要。富有彈性,且完全透明的凝膠,a與b的重量比應在30左右。)分子量范圍與凝膠濃度的關系物質(zhì)分子量范圍適用的凝膠濃度(%)蛋白質(zhì)<104
1-4×104
4×104-1×105
1-5×105
>5×10520-3015-2010-155-102-5核酸<104
104-105
105-2×10610-205-10
2-2.55%10%15%294566972002945669720029456697200
不連續(xù)凝膠電泳(disc)的分離原理(一).原理不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)具有與一般電泳的①電荷效應分離外,還具有②濃縮效應與③分子篩效應,因而,能提高電泳的分辨率;使電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別的分子得以分離;或分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密度有差別的分子可以分離;或電荷性質(zhì)、分子量大小相近,但構(gòu)型不同時亦可分離。不連續(xù)凝膠電泳洗脫堿性不連續(xù)-分離酸性樣品酸性不連續(xù)-分離堿性樣品大多數(shù)蛋白質(zhì)分子呈酸性或中性,適合用堿性系統(tǒng)進行電泳分離。②分子篩效應移動界面到達濃縮膠和分離膠界面時,凝膠的PH變化明顯,緩沖液中甘氨酸的解離迅速增加,直至完全解離出gly-,其分子量小,遷移超過蛋白質(zhì)分子。而喪失夾擊的作用;同時,凝膠的孔徑變小,降低了蛋白質(zhì)的遷移率。故蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和PH值中泳動,依其分子量的大小而分開。③電荷效應緩沖液系統(tǒng)濃縮凝膠緩沖液0.5mol/LTris-HCl,PH6.8分離凝膠緩沖液1.5mol/LTris-HCl,PH8.8電極緩沖液系統(tǒng)0.025mol/LTris(三羥甲基氨基甲烷)0.2mol/Gly(甘氨酸)PH8.3樣品緩沖液0.1mol/LTris-HCl,PH6.8,40%甘油、0.05mg/ml溴酚藍樣品緩沖液的要求:選擇合適的PH與離子強度,以保證樣品的溶解性、穩(wěn)定性、生物活性。并加入便于觀察電泳前沿的指示劑。標準蛋白質(zhì)樣品標準蛋白質(zhì)樣品:是一組(5~7種)已知的合適的分子量范圍的、構(gòu)形相近的一套蛋白質(zhì),溶解在樣品緩沖液中備用。樣品的濃度分析目的、檢測方法和樣品的組成是關鍵;未知樣品濃度:0.1~20mg/ml考瑪斯亮籃染色:1~2mg/ml銀染色:0.02~0.2mg/ml高純度樣品:0.5~2mg/ml加樣電泳
光吸收檢測考瑪斯亮籃染色染色銀染色SDS測蛋白質(zhì)分子量SDS是在PAG系統(tǒng)中引進SDS(十二烷基硫酸鈉),SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵,破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu),強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂,蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中,與SDS分子按比例結(jié)合,形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復合物,這種復合物由于結(jié)合大量的SDS,使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊,從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異,由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的,因此在進行電泳時,蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時,蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW為分子量,X為遷移率,k、b均為常數(shù),若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖,可獲得一條標準曲線,未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳,根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。
SDS電泳的成功關鍵之一是電泳過程中,待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。影響結(jié)合的因素主要有三個:溶液中SDS單體的濃度。當單體濃度大于1mmol/L時大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4,如果單體濃度降到0.5mmol/L以下時,兩者的結(jié)合比僅為1:0.4。這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別;為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合,它們的重量比應該為1:4或1:3;樣品緩沖液的離子強度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低,通常是10~100mmol/L;二硫鍵是否完全被還原。采用SDS測蛋白質(zhì)MW時,只有完全打開二硫鍵,蛋白質(zhì)分子才能被解聚,SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關系。因此在用SDS處理樣品同時常用巰基乙醇處理,巰基乙醇是強還原劑,可使被還原的二硫鍵不易再氧化,從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有許多蛋白質(zhì)是由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上肽鏈(如胰凝乳蛋白酶)組成的,它們在SDS和巰基乙醇作用下,解離成亞基或單條肽鏈,因此這一類蛋白質(zhì),測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異?;驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì),帶有較大輔基的蛋白質(zhì)(某些糖蛋白)以及一些結(jié)構(gòu)蛋白,如膠原蛋白等。一般至少采用兩種方法測定未知樣品的分子量,互相驗證。2.實驗試劑
(1)30%丙烯酰胺(Acr):稱Acr30g,甲叉雙丙烯酰胺
(Bis)0.8g,加蒸餾水至100ml,過濾后置棕色瓶中,
4℃貯存可用1-2月。
(2)10%SDS(十二烷基硫酸鈉)
(3)1.5mol/LpH8.8Tris-HCl分離膠緩沖液:稱取
Tris18.2g加入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.9,最
后用蒸餾水定容至100ml。
(4)1.0mol/LpH6.8Tris-HCl濃縮膠緩沖液:稱取
Tris12.1g,加入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8,
最后用蒸餾水定容至100ml。
(5)0.05mol/LpH6.8Tris-HCl樣品溶解緩沖液:稱取
Tris0.6g,加入50ml水,用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8,最
后用蒸餾水容至100ml。
(7)10%過硫酸銨(AP)
(8)TEMED(四甲基乙二胺)
(9)樣品溶解液:SDS(100mg)+巰基乙醇(0.1ml)+
溴酚藍(2mg)+甘油(2g)+0.05mol/LpH8.3Tris-
HCl(2ml),最后定容至10ml。
(10)固定液:取50%甲醇454ml,冰乙酸46ml混勻。
(11)染色液:稱取考馬斯亮藍R2500.125g,加上述固定液
250ml,過濾后備用。
(12)脫色液:冰乙酸75ml,甲醇50ml,加蒸餾水定容至1000ml。
(13)電極緩沖液(內(nèi)含0.1%SDS,0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3):稱Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加入SDS1g,加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。
2.實驗試劑分離膠(10%15ml)濃縮膠(5%5ml)ddH2O5.4ml3.2ml30%Acr5.0ml0.85mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl3.8ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl0.65ml10%SDS150μl50μl10%Ap150μl50μlTEMED500μl200μl
配膠
3.樣品及MW標準參照物溶液的制備樣品溶液和上樣緩沖液混勻,使用前在100℃水浴1min,以除去可能出現(xiàn)的亞穩(wěn)態(tài)聚合物。4.上樣。15μl/孔5.電泳上槽接負極,下槽接正極,打開電泳儀開關,開始時將電流調(diào)至10mA,待樣品進入分離膠時,將電流調(diào)至20-30mA。待指示劑染料靠遷移至下沿1~1.5cm處停止電泳,需2~3h。6.凝膠板剝離與染色:電泳結(jié)束后,撬開玻璃板,將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi),將凝膠放入0.05%考馬斯亮藍R250(內(nèi)含20%磺基水楊酸)染色液中,使染色液沒過膠板,染色30min左右。注意事項丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大暴露量不超過0.5μg/kg,皮膚接觸可致中毒,癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動作機能失調(diào)、四肢無力等。丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑,可以透過皮膚,不要接觸皮膚,戴手套、口罩操作。一定要催化充分,使之完全聚合。沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近。集中處理,實驗中全部的膠由專門受過訓練的人收集到一起,在一個特殊標明的容器中保存,并進一步催化使之反應完全,最后送交學校危險品倉庫,統(tǒng)一處理。Forexample:MarkersProetinsABA+B200kD116kD
66kD45kD31kD21.5kD14.4kD6.5kD12%SeparatingGel思考題1.簡述聚丙烯酰胺凝膠聚合的原理,如何調(diào)節(jié)凝膠的孔徑?2.為什么樣品會在濃縮膠中被壓縮成層?3.上樣緩沖液中蔗糖及溴酚藍各有何用途?4.上下兩槽電泳緩沖液電泳后,能否混合存放?為什么?4
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