氨基酸和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)

氨基酸和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)1.1蛋白質(zhì)是由二十種不同的氨基酸構(gòu)成的

蛋白質(zhì)是由氨基酸構(gòu)成的聚合物，所有生物都是利用這20種氨基酸作為構(gòu)件組裝成各種蛋白質(zhì)分子的。因此這20種氨基酸被認(rèn)為是通用的或是標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸。盡管氨基酸的種類有限，但由于氨基酸在蛋白質(zhì)中連接的次序以及氨基酸數(shù)目的不同，所以可以組裝成幾乎無限的不同種類的蛋白質(zhì)。20種氨基酸都被稱之-氨基酸，因?yàn)?氨基酸分子中的-碳（分子中第2個碳，C）結(jié)合著一個氨基和一個酸性的羧基，此外C還結(jié)合著一個H原子和一個側(cè)鏈基團(tuán)（用R表示）。每一種氨基酸的R都是不同的，側(cè)鏈上的碳依次按字母命名為、、和碳，分別指的是第3、4、5和6位碳。

表1.120種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的英文名稱及簡寫符號1.1.120種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可以按其側(cè)鏈分類

20種氨基酸按照它們的側(cè)鏈基團(tuán)可以分為：6種脂肪族、3種芳香族、2種含硫、2種羥基、3種堿性、2種酸性和2種酰胺氨基酸。1、R為脂肪族基團(tuán)的氨基酸甘氨酸的結(jié)構(gòu)在20種氨基酸中最簡單，因?yàn)樗膫?cè)鏈?zhǔn)莻€氫原子，所以甘氨酸的-碳不是手性碳。丙氨酸（-氨基丙酸）的側(cè)鏈?zhǔn)且粋€簡單的甲基；纈氨酸（-氨基異戊酸）的側(cè)鏈?zhǔn)且粋€含有支鏈的3碳側(cè)鏈；亮氨酸（-氨基異己酸）和異亮氨酸（-氨基-β-甲基戊酸）都是含有支鏈的4碳側(cè)鏈。要注意的是，異亮氨酸分子中的-碳和-碳都是不對稱碳。所以異亮氨酸存在著4種可能的立體異構(gòu)體：L-異亮氨酸，D-異亮氨酸，L-別構(gòu)異亮氨酸，和D-別構(gòu)異亮氨酸（別構(gòu)是指一個異構(gòu)形式），脯氨酸（β-吡咯烷基--羧酸）明顯地不同于其它19種氨基酸，它有一個環(huán)形的飽和烴側(cè)鏈，結(jié)合在-氨基的氮和-碳上。所以嚴(yán)格地講，脯氨酸是一個亞氨基酸，因?yàn)樗幸粋€二級氨基，而不是一級氨基。不過在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的脯氨酸也象其它氨基酸一樣，它的-碳也是手性碳。脯氨酸的雜環(huán)吡咯烷環(huán)限制多肽的幾何構(gòu)型，有時會在多肽鏈中引進(jìn)一個轉(zhuǎn)折的變化。2、R為芳香族基團(tuán)的氨基酸

苯丙氨酸（-氨基-β-苯丙酸）是一個含有苯基的氨基酸。酪氨酸（-氨基-β-對羥基苯丙酸）的結(jié)構(gòu)類似于苯丙氨酸，稱之對羥基苯丙氨酸。酚是個比較弱的酸，所以酪氨酸側(cè)鏈的pKa值為10.5。色氨酸（β-吲哚--氨基丙酸）的側(cè)鏈帶有一個雙環(huán)的吲哚基，所以色氨酸又稱之吲哚丙氨酸。三種芳香族氨基酸都吸收紫外光，在中性pH條件下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280nm，而苯丙氨酸的在260nm，大多數(shù)蛋白質(zhì)中都含有色氨酸和酪氨酸或其中的一種，所以溶液中280nm吸收的測量常用來估算蛋白質(zhì)的濃度。3、R為含硫基團(tuán)的氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸是兩個含硫氨基酸。蛋氨酸（-氨基-γ-甲硫基丁酸）是個疏水氨基酸，它的側(cè)鏈上帶有一個非極性的甲基硫醚基，不過其中的硫原子是親核的。半胱氨酸（-氨基-β-巰基丙酸）側(cè)鏈上含有一個巰基（-SH），所以又稱之巰基丙氨酸。雖然半胱氨酸的側(cè)鏈顯得有點(diǎn)疏水性，但-SH也是一個高反應(yīng)性的基團(tuán)。4、R為含醇基基團(tuán)的氨基酸絲氨酸和蘇氨酸是兩個側(cè)鏈含有-羥基的不帶電荷的氨基酸：蘇氨酸（-氨基-β-羥基丙酸）、絲氨酸（-氨基-β-羥基丁酸）。盡管絲氨酸的羥甲基（-CH2OH）在水溶液看不出離子化，但這個醇可以參與很多酶的活性部位反應(yīng)，就象已被離子化了一樣。要注意，蘇氨酸也象異亮氨酸一樣，具有兩個手性碳原子，即-碳和-碳原子，通常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)中的L-蘇氨酸只是4種立體異構(gòu)體中的一種，5、R為堿性基團(tuán)的氨基酸有5種氨基酸在pH7時它們的側(cè)鏈基團(tuán)帶有電荷，其中有3種是帶正電荷的堿性R基團(tuán)，另外2種是帶負(fù)電荷的酸性R基團(tuán)。組氨酸、賴氨酸和精氨酸它們都帶有親水性的含氮堿基R基團(tuán)。組氨酸（-氨基-β-咪唑基丙酸）的側(cè)鏈有一個咪唑環(huán)，所以又稱之咪唑丙氨酸。咪唑基是可以離子化的（pKa＝6.0）。賴氨酸（,-二氨基己酸）是一個雙氨基酸，含有-和-氨基。在中性pH，-氨基是以堿性氨離子（-CH2-NH3＋）形式存在的，在蛋白質(zhì)中通常帶正電荷。精氨酸（-氨基-δ-胍基戊酸）是20種氨基酸中堿性最強(qiáng)的氨基酸，它的側(cè)鏈胍基離子的pKa值最高（pKa＝12.5）。6、R為酸性基團(tuán)的氨基酸天冬氨酸（-氨基丁二酸）和谷氨酸（-氨基戊二酸）是二羧基氨基酸，除了含有-羧基外，天冬氨酸還含有-羧基，谷氨酸還含有-羧基。由于兩個氨基酸的側(cè)鏈在pH7時都離子化了，所以在蛋白質(zhì)中是帶負(fù)電荷的，這兩個氨基酸經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子表面上，谷氨酸的單鈉鹽是調(diào)味品味精。7、R為含酰胺基團(tuán)的氨基酸天冬酰胺（β-氨基-β-羧基丙酰胺）和谷氨酰胺（γ-氨基-γ-羧基丁酰胺）分別是天冬氨酸和谷氨酸的酰胺化產(chǎn)物。盡管這兩個氨基酸的側(cè)鏈?zhǔn)遣粠щ姾傻?，但它們的極性很強(qiáng)，也經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子的表面，它們可以和水相互作用。另外這兩種氨基酸的酰胺基可以與其它的極性氨基酸的側(cè)鏈上的原子形成氫鍵。必需和非必需氨基酸：以上氨基酸分類完全是根據(jù)側(cè)鏈的性質(zhì)分類的，從營養(yǎng)學(xué)角度又可將氨基酸分為必需和非必需氨基酸。必需氨基酸包括賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸和精氨酸，其中組氨酸和精氨酸，人雖然能合成，但效率低，尤其在嬰幼兒時期，需要由外界供給。非必需氨基酸是其余的10種氨基酸：甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和丙氨酸。5678氨基酸的離子狀態(tài)取決于環(huán)境的pH

表1.2給出了25℃下游離氨基酸的酸性和堿性基團(tuán)的pKa值和氨基酸的等電點(diǎn)（pI）。氨基酸的-COOH基是個弱酸，利用Henderson-Hasselbalch方程可以計(jì)算任何pH下離子化基團(tuán)的比例。

〖共軛堿〗pH＝pKaα＋log－－－－－－－

〖弱酸〗從表1.2可以看出，游離氨基酸的-COOH的pKa值的范圍是1.8至2.5。對于一個典型的氨基酸它的-COOH的pKa值大約是2，羧酸鹽對羧酸的比是100000:1，所以在中性pH條件下，占優(yōu)勢的成分是羧酸鹽離子。

〖RCOO－〗7.0＝2.0＋log－－－－―――〖RCOOH〗-氨基的pKa值的范圍是8.7至10.7。它的共軛堿（游離的胺-NH2）對共軛酸（質(zhì)子化的胺-NH3＋）的比，在pH7時為1:1000。計(jì)算表明，在中性pH條件下，游離氨基酸主要是以兼性離子形式存在的。所以將一個氨基酸畫成帶有-COOH和-NH2基團(tuán)的形式是不合適的。因?yàn)椴淮嬖谶@樣一種pH，即在這一pH下，-COOH和-NH2都占優(yōu)勢。脯氨酸的氨基（pKa＝10.6）在中性pH條件下也是質(zhì)子化的堿基形式，雖然側(cè)鏈與-氨基結(jié)合，脯氨酸在pH7時仍是一種兼性離子。

通過氨基酸的滴定曲線可以確定氨基酸的各個解離基團(tuán)的pKa值。圖1.4給出了丙氨酸和組氨酸的滴定曲線。丙氨酸有兩個可解離基團(tuán)，-COOH和-NH3＋，它們的pKa值分別是2.4和9.9，每一個值都是位于滴定曲線緩沖區(qū)的中心。組氨酸有3個可解離基團(tuán)，即-COOH、-NH3＋和側(cè)鏈基團(tuán)咪唑基，pKa值分別是1.8、6.0和9.3，也都是處于緩沖區(qū)的中心。1.1.3使用離子交換層析可將各種氨基酸分開

層析（chromatography）也稱之色譜（來自Chroma），其基本原理是分析樣品作為流動相流過固相時，樣品中的各個成分與固相進(jìn)行著不同程度的相互作用，使得樣品中的各個成分在固相中的遷移率產(chǎn)生了差別，從而達(dá)到分離樣品的目的。根據(jù)固相與樣品中各個成分之間相互作用的種類的不同，又有離子交換層析、分子篩層析和吸附層析等各種層析方法。通常都是將固相裝到一個柱子里，然后使流動相流過柱子（有時需要加壓力），這樣的層析方法叫做柱層析（columnchromatography）。

如果被分離的樣品中各個成分受溶液pH的影響，有時帶正電荷，有時帶負(fù)電荷，此時就可利用離子交換層析方法進(jìn)行樣品的分離。離子交換層析的固相是離子交換體，其中有離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。通常是以樹脂、或是纖維素、或是葡聚糖作為基質(zhì)，這些基質(zhì)具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將帶電基團(tuán)引入到基質(zhì)上托緯閃死胱詠換皇髦８菀氳拇緇挪煌址治衾胱詠換惶搴鴕趵胱詠換惶濉引入SO3－Na＋或COO－H＋基團(tuán)的叫做陽離子交換體；引入N＋（C2H5）Cl－基團(tuán)的叫做陰離子交換體。

分離氨基酸常用的是帶有耐酸性非常強(qiáng)的磺酸根SO3－Na＋（以鹽的形式出現(xiàn)）的強(qiáng)陽離子交換樹脂。首先將這種樹脂填充到柱子中，然后注入含有樣品的流動相，樣品中含有陽離子成分X＋，通過靜電吸引，與樹脂中的帶電基團(tuán)相互作用，結(jié)果X＋與Na＋交換，即發(fā)生陽離子交換后，形成SO3－X＋。1.1.4氨基酸可進(jìn)行特征的化學(xué)反應(yīng)氨基酸的-氨基、-羧基以及氨基酸的各種側(cè)鏈基團(tuán)可進(jìn)行很多種化學(xué)反應(yīng)。氨基酸與茚三酮（ninhydrin）的反應(yīng)是一個檢測和定量氨基酸和蛋白質(zhì)的重要反應(yīng)。茚三酮在弱酸性溶液中與氨基酸共熱，所有具有游離氨基的氨基酸都生成紫色化合物（470）（圖1.7）。然而由于脯氨酸是一個亞氨基酸，所以與茚三酮反應(yīng)生成的是黃色化合物（440）。

有幾種與氨基酸的氨基反應(yīng)的試劑常用來鑒定蛋白質(zhì)和多肽的N-末端氨基酸殘基。

2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB）也叫做Sanger試劑。DNFB在弱堿性溶液中與氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，生成黃色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitrophenylaminoacid,DNP氨基酸）（圖1.8a）。丹磺酰氯（dansylchloride）是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯（5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonylchloride）的簡稱。丹磺酰氯與氨基酸反應(yīng)生成熒光性質(zhì)強(qiáng)和穩(wěn)定的磺胺衍生物（圖1.8b），也常用于多肽鏈的N末端氨基酸的鑒定。

苯異硫氰酸酯（phenylisothiocyanate,PITC）在弱堿性條件下，與氨基酸反應(yīng)生成苯乙內(nèi)酰硫脲（phenylthiohydantoin,PTH）衍生物，即PTH-氨基酸（圖1.8c），此反應(yīng)又稱之Edman反應(yīng)，該反應(yīng)是蛋白質(zhì)或多肽氨基酸序列測定常用的反應(yīng)。1.2蛋白質(zhì)中的氨基酸是通過肽鍵連接的

一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基縮合，通過形成的酰胺鍵將兩個氨基酸連接在一起，這個酰胺鍵稱之肽鍵（peptidebond）（圖1.9），氨基酸縮合生成的產(chǎn)物稱之肽（peptide）。1.3肽可以化學(xué)合成

多肽合成的基本過程是本世紀(jì)初由EmilFischer設(shè)計(jì)的，稱為液相合成法，肽鏈從N端向C端方向延伸。首先一個氨基酸的羧基和另一個氨基酸的氨基被保護(hù)基團(tuán)封閉，然后參與肽鍵形成的羧基被激活，如形成脂酰氯，或酸酐。激活的羧酸受到游離氨基的親電攻擊形成一個封閉的二肽（圖1.11）。最后通過水解有選擇地除去保護(hù)基團(tuán)而留下一個完整的肽鍵。1.4蛋白質(zhì)可以通過各種生物化學(xué)技術(shù)純化利用蛋白質(zhì)的溶解度、凈電荷、大小以及與配體結(jié)合特異性上的微小差異。有透析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、電泳（垂直板電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳）等分離純化方法。透析離子交換層析

離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。凝膠過濾層析（Gel-filtrationchromatography）

凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。單個凝膠珠本身象個“篩子”。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。C親和層析（Affinitychromatography）這是一種最有選擇性的柱層析，其原理是依賴于蛋白質(zhì)和它的配體（ligand）之間的相互作用來分離的。配體通常指的是能與另一個分子或原子結(jié)合（一般是非共價結(jié)合）的分子、基團(tuán)、離子、或原子。但在親和層析中，配體是通過共價鍵先與基質(zhì)結(jié)合，配體可以是酶結(jié)合的一個反應(yīng)物或產(chǎn)物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過裝有連接了配體的基質(zhì)的親和層析柱時，只有靶蛋白可以特異地與基質(zhì)結(jié)合，而其它沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。特異結(jié)合在基質(zhì)上的靶蛋白最后可以用含有高濃度的自由配體的溶劑。所以有時只用親和層析就可使蛋白質(zhì)的純化提高1000至10000倍。電泳分離蛋白質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)在電場中的遷移率電泳分離蛋白質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)在電場中的遷移的差別達(dá)到分離目的的。蛋白質(zhì)樣品加到一塊預(yù)先制好的凝膠介質(zhì)上，只要在凝膠的兩端加上電場，就可以達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（gelelectrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（starchgel）、瓊脂糖凝膠（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）。一般凝膠介質(zhì)中的pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數(shù)蛋白質(zhì)都帶有負(fù)電荷，這樣它們可以向陽極遷移。蛋白質(zhì)的遷移與蛋白質(zhì)的質(zhì)量和帶電荷的多少有關(guān)，我們介紹其中常用的幾種主要的電泳技術(shù)。ASDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）

使用含有一種去污劑十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行處理（一般煮沸3～5分鐘），通過加熱和SDS可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。同時還原劑可以切斷蛋白質(zhì)中的任何一個二硫鍵（使二硫鍵還原）。經(jīng)過這樣處理的樣品中的肽鏈都是處于無二硫鍵連接的，分離的狀態(tài)。由于SDS是帶有負(fù)電荷的分子，同時它有一個長的疏水尾巴，SDS通過疏水尾巴與肽鏈中的氨基酸的疏水側(cè)鏈結(jié)合，結(jié)合SDS的比率大約是一個蛋白質(zhì)分子中每兩個氨基酸殘基結(jié)合一分子的SDS。B等電聚焦電泳（Isoelectricfocusingelectrophoresis,IFE）等電聚焦電泳是一種電泳的改進(jìn)技術(shù)，實(shí)際上是利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場作用下在凝膠內(nèi)沿電場方向制造一個pH梯度。所用的緩沖液是低分子量的有機(jī)酸和堿的混合物，該混合物稱之兩性電解質(zhì)（ampholytes）。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品在這樣的凝膠上電泳時，每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI相一致的pH處（圖1.18），具有不同pI的各種蛋白質(zhì)最后都遷移至凝膠中相應(yīng)的pH處，達(dá)到分離的目的。C雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis）如果將等電聚焦電泳與SDS結(jié)合起來，就是分辨率更高的一種雙向電泳了（圖1.19）。雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直方向反映出它們在分子量上的差別。所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)以及等電點(diǎn)相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開。1.5蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)就是它的氨基酸序列

從1953年Sanger測定了胰島素的全部氨基酸序列。每一種蛋白質(zhì)都具有唯一的氨基酸序列。實(shí)際上蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由DNA決定的。測定蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有重要意義，第一，測定蛋白質(zhì)的氨基酸序列是闡明蛋白質(zhì)生物活性的分子基礎(chǔ)。其次，研究表明蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定它的空間結(jié)構(gòu)