疾病相關(guān)基因的鑒定與基因功能研究課件

第二十四章

疾病相關(guān)基因的鑒定與基因功能研究生物化學(xué)與分子生物學(xué)第二十四章生物化學(xué)與分子生物學(xué)疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，因?yàn)閹缀跛械募膊《寂c基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)變化有關(guān)，都是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。疾病相關(guān)基因

致病基因：一種疾病的表型和一個(gè)基因型呈直接對(duì)應(yīng)的因果關(guān)系，即該基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)的異常是導(dǎo)致該病發(fā)生的直接原因疾病易感基因：環(huán)境因素和遺傳因素均起著一定作用，表現(xiàn)為2個(gè)以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因間的相互作用，而單一基因變異僅增加對(duì)疾病的易感性疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，因?yàn)閹缀跛械募膊〉谝还?jié)

鑒定疾病相關(guān)基因的原則

第一節(jié)一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的實(shí)質(zhì)聯(lián)系正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件

確定疾病的遺傳因素，即通過(guò)孿生子分析，領(lǐng)養(yǎng)分析和同胞罹患率分析等確定遺傳因素是否在疾病發(fā)病中的作用及其作用程度。

一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的實(shí)質(zhì)聯(lián)系正二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需要多學(xué)科多途徑的綜合策略疾病相關(guān)基因鑒定克隆策略示意圖二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需要多學(xué)科多途徑的綜合策略疾病相關(guān)基三、確定候選基因是多種克隆疾病相關(guān)基因方法的交匯有許多途經(jīng)能夠達(dá)到最終鑒定疾病相關(guān)基因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。一旦候選基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因的突變。候選基因可不依賴其在染色體位置而予以鑒定，但常用的策略仍然是首先找出候選染色體區(qū)域，然后在此區(qū)域內(nèi)鑒定候選基因。

三、確定候選基因是多種克隆疾病相關(guān)基因方法的交匯有許多途經(jīng)能第二節(jié)

疾病相關(guān)基因克隆的策略和方法第二節(jié)一、不依賴染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略

不依賴染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位點(diǎn)非依賴的DNA序列信息和動(dòng)物模型來(lái)鑒定和克隆疾病基因。一、不依賴染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略不依（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)出發(fā)克隆疾病基因功能克?。╢unctionalcloning）采用的是從蛋白質(zhì)到DNA的研究路線，針對(duì)的是一些對(duì)影響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病1．依據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關(guān)基因

2．用蛋白質(zhì)的特異性抗體鑒定疾病基因

（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)出發(fā)克隆疾病基因功能克?。╢u（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因表型克?。╬henotypecloning）基于對(duì)疾病表型和基因結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)的特征聯(lián)系已經(jīng)有所認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上來(lái)分離鑒定疾病相關(guān)基因（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因表型克?。╬hen1.從疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因組DNA的不同，直接對(duì)產(chǎn)生變異的DNA片段進(jìn)行克隆，而不需要基因的染色體位置或基因產(chǎn)物的其他信息。

2.針對(duì)已知基因。如果高度懷疑某種疾病是由于某個(gè)特殊的已知基因所致，可通過(guò)比較患者和正常對(duì)照間該基因表達(dá)的差異來(lái)確定該基因是否為該疾病相關(guān)基因。3.針對(duì)未知基因的，可通過(guò)比較疾病和正常組織中的所有mRNA的表達(dá)種類和含量間的差異，從而克隆疾病相關(guān)基因。這種差異可能源于基因結(jié)構(gòu)改變，也可能源于表達(dá)調(diào)控機(jī)制的改變。依據(jù)DNA或mRNA的改變與疾病表型的關(guān)系，可有幾種策略：

1.從疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因組D針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有mRNA差異顯示（mRNAdifferentialdisplay，mRNA-DD）抑制消減雜交（suppressivesubstractivehybridization，SSH）基因表達(dá)系列分析（SAGE）

cDNA微陣列（cDNAmicroarray）基因鑒定集成法（integratedprocedureforgeneidentification）針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有mRNA差異顯示（mRNAdiffRDA技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖RDA技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖mRNA-DD技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖mRNA-DD技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖（三）采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因人類的部分疾病，已經(jīng)有相應(yīng)的動(dòng)物模型。如果動(dòng)物某種表型的突變基因定位于染色體的某一部位,而具有相似人類疾病表型的基因很有可能存在于人染色體的同源部位。另外，當(dāng)疾病基因在動(dòng)物模型上已完成鑒定，還可以采用熒光原位雜交來(lái)定位分離人的同源基因。

（三）采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因人類的部分疾病，已經(jīng)有二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的經(jīng)典方法定位克?。╬ositionalcloning）：僅根據(jù)疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定克隆疾病相關(guān)基因。定位克隆的起點(diǎn)是基因定位，即確定疾病相關(guān)基因在染色體上的位置，然后根據(jù)這一位置信息，應(yīng)用DNA標(biāo)記將經(jīng)典的遺傳學(xué)信息轉(zhuǎn)換為遺傳標(biāo)記所代表的特定基因組區(qū)域，再以相關(guān)基因組區(qū)域的相連重疊群（contig）篩選候選基因，最后比較患者和正常人這些基因的差異，確定基因和疾病的關(guān)系。二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的經(jīng)典方法定位克隆（posit（一）基因定位的方法1．體細(xì)胞雜交法通過(guò)融合細(xì)胞的篩查定位基因2．染色體原位雜交是在細(xì)胞水平定位基因的常用方法3.染色體異常有時(shí)可提供疾病基因定位的替代方法4．連鎖分析是定位疾病未知基因的常用方法（一）基因定位的方法1．體細(xì)胞雜交法通過(guò)融合細(xì)胞的篩查定位基（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的候選區(qū)域2．構(gòu)建目的區(qū)域的物理圖譜3.疾病相關(guān)基因的確定（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的（三）假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，根據(jù)患病女性X染色體與第21號(hào)常染色體的易位，以及男患兒發(fā)生小的Xp21.2缺失并伴發(fā)三種其他X連鎖隱性遺傳病，再運(yùn)用RFLP連鎖分析將DMD基因定位于Xp21。然后，分別克隆得到了基因的2個(gè)不同的片段，分別命名為XJ系列探針和pERT87系列探針，根據(jù)兩片段的比較，證明DMD基因約為2300kb，占X染色體的1%以上，該基因編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（dystrophin），影響橫紋肌和心肌的結(jié)構(gòu)和收縮功能。假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）（三）假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，三、確定常見(jiàn)病的基因需要全基因組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序全基因組的關(guān)聯(lián)研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）全外顯子測(cè)序（wholeexonsequencing）三、確定常見(jiàn)病的基因需要全基因組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序全基因四、生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)貯藏豐富的疾病相關(guān)基因信息人類基因組計(jì)劃和多種模式生物基因組測(cè)序的完成,生物信息學(xué)的發(fā)展,計(jì)算機(jī)軟件的開發(fā)應(yīng)用和互聯(lián)網(wǎng)的普及，人們通過(guò)已獲得的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中核酸序列及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性比較，或?qū)?shù)據(jù)庫(kù)中不同物種間的序列比較分析、拼接，預(yù)測(cè)新的全長(zhǎng)基因等，進(jìn)而通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從組織細(xì)胞中克隆該基因，這就是所謂的電子克?。╥nsilicocloning）。四、生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)貯藏豐富的疾病相關(guān)基因信息人類基因組計(jì)劃和第三節(jié)

疾病相關(guān)基因的功能研究第三節(jié)基因的功能實(shí)際是基因產(chǎn)物的功能，也就是編碼基因的蛋白質(zhì)功能和非編碼基因RNA的功能，前者是本節(jié)討論的重點(diǎn)。基因產(chǎn)物之一蛋白質(zhì)的功能可以從三個(gè)不同水平來(lái)描述：①生物化學(xué)水平，主要描述基因產(chǎn)物參與了何種生化過(guò)程，如屬于激酶、轉(zhuǎn)錄因子等；②細(xì)胞水平,主要論述基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位和參與的生物學(xué)途徑，例如，某蛋白質(zhì)定位于核內(nèi)，參與DNA的修復(fù)過(guò)程，有可能并不了解確切的生物化學(xué)功能；③整體水平,主要包括基團(tuán)表達(dá)的時(shí)空性及基因在疾病中的作用?；虻墓δ軐?shí)際是基因產(chǎn)物的功能，也就是編碼基因的蛋白質(zhì)功能和一、基因比對(duì)及功能詮釋常用的兩大雙序列比對(duì)工具是BLAST和FASTA,分別由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學(xué)研究所（EBI）開發(fā)和維護(hù)。NCBI的主頁(yè)是/；EBI的主頁(yè)是http://www.ebi.ac.uk/。

一、基因比對(duì)及功能詮釋常用的兩大雙序列比對(duì)工具是BLAST二、利用工程細(xì)胞研究基因功能

（一）采用基因重組技術(shù)建立基因高表達(dá)工程細(xì)胞系（二）基因沉默技術(shù)抑制特異基因的表達(dá)二、利用工程細(xì)胞研究基因功能（一）采用基因重組技術(shù)建立基因三、研究生物大分子間的相互作用可確定基因功能

在一些情況下,即使對(duì)基因的序列、結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式有清楚的認(rèn)識(shí)，但仍然難以闡明基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能。此時(shí)通過(guò)研究該蛋白質(zhì)與已知功能蛋白質(zhì)的相互作用，無(wú)疑將非常有助于對(duì)該蛋白質(zhì)功能的了解。常用的高通量篩查蛋白質(zhì)間相互作用的方法是酵母雙雜交技術(shù)（見(jiàn)第二十章）和噬菌體展示技術(shù)。三、研究生物大分子間的相互作用可確定基因功能在一些情況下,四、利用基因修飾動(dòng)物整體研究基因功能

盡管在體外對(duì)基因功能的研究可提供大量信息，但是只有在整體內(nèi)的研究才能真實(shí)反映該基因在體內(nèi)的真正作用。通過(guò)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，持別是小鼠體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)的基因操作，獲得基因修飾動(dòng)物品系，已成為在體研究基因功能的重要手段，常用的有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因敲除動(dòng)物。

四、利用基因修飾動(dòng)物整體研究基因功能盡管在體外對(duì)基因功能的第二十四章

疾病相關(guān)基因的鑒定與基因功能研究生物化學(xué)與分子生物學(xué)第二十四章生物化學(xué)與分子生物學(xué)疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，因?yàn)閹缀跛械募膊《寂c基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)變化有關(guān)，都是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。疾病相關(guān)基因

致病基因：一種疾病的表型和一個(gè)基因型呈直接對(duì)應(yīng)的因果關(guān)系，即該基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)的異常是導(dǎo)致該病發(fā)生的直接原因疾病易感基因：環(huán)境因素和遺傳因素均起著一定作用，表現(xiàn)為2個(gè)以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因間的相互作用，而單一基因變異僅增加對(duì)疾病的易感性疾病相關(guān)基因是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的領(lǐng)域，因?yàn)閹缀跛械募膊〉谝还?jié)

鑒定疾病相關(guān)基因的原則

第一節(jié)一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的實(shí)質(zhì)聯(lián)系正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件

確定疾病的遺傳因素，即通過(guò)孿生子分析，領(lǐng)養(yǎng)分析和同胞罹患率分析等確定遺傳因素是否在疾病發(fā)病中的作用及其作用程度。

一、鑒定疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵是確定疾病表型和基因間的實(shí)質(zhì)聯(lián)系正二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需要多學(xué)科多途徑的綜合策略疾病相關(guān)基因鑒定克隆策略示意圖二、鑒定克隆疾病相關(guān)基因需要多學(xué)科多途徑的綜合策略疾病相關(guān)基三、確定候選基因是多種克隆疾病相關(guān)基因方法的交匯有許多途經(jīng)能夠達(dá)到最終鑒定疾病相關(guān)基因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。一旦候選基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因的突變。候選基因可不依賴其在染色體位置而予以鑒定，但常用的策略仍然是首先找出候選染色體區(qū)域，然后在此區(qū)域內(nèi)鑒定候選基因。

三、確定候選基因是多種克隆疾病相關(guān)基因方法的交匯有許多途經(jīng)能第二節(jié)

疾病相關(guān)基因克隆的策略和方法第二節(jié)一、不依賴染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略

不依賴染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位點(diǎn)非依賴的DNA序列信息和動(dòng)物模型來(lái)鑒定和克隆疾病基因。一、不依賴染色體定位的疾病相關(guān)基因克隆策略不依（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)出發(fā)克隆疾病基因功能克?。╢unctionalcloning）采用的是從蛋白質(zhì)到DNA的研究路線，針對(duì)的是一些對(duì)影響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病1．依據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關(guān)基因

2．用蛋白質(zhì)的特異性抗體鑒定疾病基因

（一）從已知蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)出發(fā)克隆疾病基因功能克?。╢u（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因表型克隆（phenotypecloning）基于對(duì)疾病表型和基因結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)的特征聯(lián)系已經(jīng)有所認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上來(lái)分離鑒定疾病相關(guān)基因（二）從疾病的表型差異出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因表型克?。╬hen1.從疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因組DNA的不同，直接對(duì)產(chǎn)生變異的DNA片段進(jìn)行克隆，而不需要基因的染色體位置或基因產(chǎn)物的其他信息。

2.針對(duì)已知基因。如果高度懷疑某種疾病是由于某個(gè)特殊的已知基因所致，可通過(guò)比較患者和正常對(duì)照間該基因表達(dá)的差異來(lái)確定該基因是否為該疾病相關(guān)基因。3.針對(duì)未知基因的，可通過(guò)比較疾病和正常組織中的所有mRNA的表達(dá)種類和含量間的差異，從而克隆疾病相關(guān)基因。這種差異可能源于基因結(jié)構(gòu)改變，也可能源于表達(dá)調(diào)控機(jī)制的改變。依據(jù)DNA或mRNA的改變與疾病表型的關(guān)系，可有幾種策略：

1.從疾病的表型出發(fā)，比較患者基因組DNA與正常人基因組D針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有mRNA差異顯示（mRNAdifferentialdisplay，mRNA-DD）抑制消減雜交（suppressivesubstractivehybridization，SSH）基因表達(dá)系列分析（SAGE）

cDNA微陣列（cDNAmicroarray）基因鑒定集成法（integratedprocedureforgeneidentification）針對(duì)未知基因常用的技術(shù)有mRNA差異顯示（mRNAdiffRDA技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖RDA技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖mRNA-DD技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖mRNA-DD技術(shù)原理和基本過(guò)程示意圖（三）采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因人類的部分疾病，已經(jīng)有相應(yīng)的動(dòng)物模型。如果動(dòng)物某種表型的突變基因定位于染色體的某一部位,而具有相似人類疾病表型的基因很有可能存在于人染色體的同源部位。另外，當(dāng)疾病基因在動(dòng)物模型上已完成鑒定，還可以采用熒光原位雜交來(lái)定位分離人的同源基因。

（三）采用動(dòng)物模型鑒定克隆疾病相關(guān)基因人類的部分疾病，已經(jīng)有二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的經(jīng)典方法定位克隆（positionalcloning）：僅根據(jù)疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定克隆疾病相關(guān)基因。定位克隆的起點(diǎn)是基因定位，即確定疾病相關(guān)基因在染色體上的位置，然后根據(jù)這一位置信息，應(yīng)用DNA標(biāo)記將經(jīng)典的遺傳學(xué)信息轉(zhuǎn)換為遺傳標(biāo)記所代表的特定基因組區(qū)域，再以相關(guān)基因組區(qū)域的相連重疊群（contig）篩選候選基因，最后比較患者和正常人這些基因的差異，確定基因和疾病的關(guān)系。二、定位克隆是鑒定疾病相關(guān)基因的經(jīng)典方法定位克?。╬osit（一）基因定位的方法1．體細(xì)胞雜交法通過(guò)融合細(xì)胞的篩查定位基因2．染色體原位雜交是在細(xì)胞水平定位基因的常用方法3.染色體異常有時(shí)可提供疾病基因定位的替代方法4．連鎖分析是定位疾病未知基因的常用方法（一）基因定位的方法1．體細(xì)胞雜交法通過(guò)融合細(xì)胞的篩查定位基（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的候選區(qū)域2．構(gòu)建目的區(qū)域的物理圖譜3.疾病相關(guān)基因的確定（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的（三）假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，根據(jù)患病女性X染色體與第21號(hào)常染色體的易位，以及男患兒發(fā)生小的Xp21.2缺失并伴發(fā)三種其他X連鎖隱性遺傳病，再運(yùn)用RFLP連鎖分析將DMD基因定位于Xp21。然后，分別克隆得到了基因的2個(gè)不同的片段，分別命名為XJ系列探針和pERT87系列探針，根據(jù)兩片段的比較，證明DMD基因約為2300kb，占X染色體的1%以上，該基因編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（dystrophin），影響橫紋肌和心肌的結(jié)構(gòu)和收縮功能。假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）（三）假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，三、確定常見(jiàn)病的基因需要全基因組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序全基因組的關(guān)聯(lián)研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）全外顯子測(cè)序（wholeexonsequencing）三、確定常見(jiàn)病的基因需要全基因組關(guān)聯(lián)分析和全外顯子測(cè)序全基因四、生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)貯藏豐富的疾病相關(guān)基因信息人類基因組計(jì)劃和多種模式生物基因組測(cè)序的完成,生物信息學(xué)的發(fā)展,計(jì)算機(jī)軟件的開發(fā)應(yīng)用和互聯(lián)網(wǎng)的普及，人們通過(guò)已獲得的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中核酸序列及蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性比較，或?qū)?shù)據(jù)庫(kù)中不同物種間的序列比較分析、拼接，預(yù)測(cè)新的全長(zhǎng)基因等，進(jìn)而通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從組織細(xì)胞中克隆該基因，這就是所謂的電子克?。╥nsilicocloning）。四、生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)貯藏豐富的疾病相關(guān)基因信息人類基因組計(jì)劃和第三節(jié)

疾病相關(guān)基因的功能研究第三節(jié)基因的功能實(shí)際是基因產(chǎn)物的功能，也就是編碼基因的蛋白質(zhì)功能和非編碼基因RNA的功能，前者是本節(jié)討論的重點(diǎn)?；虍a(chǎn)物之一蛋白質(zhì)的功能可以從三個(gè)不同水平來(lái)描述：①生物化