選修3 動物的克隆優(yōu)秀課件

第三節(jié)動物的克隆動物克隆的技術(shù)基礎(chǔ)：動物的細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)植物克隆的技術(shù)基礎(chǔ)：植物組織培養(yǎng)第三節(jié)動物的克隆動物克隆的技術(shù)基礎(chǔ)：動物的細(xì)胞培養(yǎng)植物克1動物細(xì)胞的培養(yǎng)和克隆形成動物細(xì)胞的培養(yǎng)和21、動物細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞將動物體內(nèi)的一部分組織取出分散成單個細(xì)胞放在適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞得以生存并保持生命活動現(xiàn)象生存、生長、分裂乃至接觸抑制和有規(guī)律的衰老、死亡性能等一、動物細(xì)胞的培養(yǎng)和克隆形成機(jī)械消化或胰酶消化（1）定義為什么要分散成單個細(xì)胞培養(yǎng)？1、動物細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞將動物體內(nèi)的一部分組織取出分散3正常細(xì)胞癌細(xì)胞接觸抑制正常細(xì)胞癌細(xì)胞接觸抑制4（2）動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1）離體2）營養(yǎng)物質(zhì)：無機(jī)鹽、葡萄糖、氨基酸、維生素、

動物血清3）恒溫和pH，無需光照4）無菌無毒的環(huán)境保證細(xì)胞順利的生長增殖（2）動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1）離體保證細(xì)胞順利的生長增殖51.培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、糖類、維生素、無機(jī)鹽、激素、其他成分（生長因子【添加動物血清】）培養(yǎng)條件：2.氣體：CO2

O2【CO2

培養(yǎng)箱：5%CO2和95%的空氣

，培養(yǎng)時培養(yǎng)瓶的蓋子處于擰松狀態(tài)】CO2的作用：調(diào)節(jié)PH

3.理化條件：PH【5%CO2調(diào)節(jié)PH

，培養(yǎng)基中加入PH緩沖劑，培養(yǎng)過程中細(xì)胞代謝產(chǎn)生很多酸性物質(zhì)，PH發(fā)生改變，為了實(shí)時監(jiān)控培養(yǎng)基中PH的變化，一般在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若培養(yǎng)基顏色變化超過一定程度，即使細(xì)胞密度不大，也要更換培養(yǎng)基?！?、滲透壓、溫度、濕度【CO2

培養(yǎng)箱：37℃，濕度很高】4.無菌條件5.大部分細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，需要一個可貼附的表面【細(xì)胞培養(yǎng)瓶或卡氏瓶的壁，培養(yǎng)皿的壁】，會接觸抑制，培養(yǎng)密度不能過大。少部分細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞的密度可遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于貼壁細(xì)胞，因此利用動物細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)一些藥物時，最好使用懸浮細(xì)胞。1.培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、糖類、維生素、無機(jī)鹽、激素、其6（3）動物細(xì)胞的培養(yǎng)過程

取動物胚胎或幼齡動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個細(xì)胞因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)分解組織中的膠原纖維和細(xì)胞外的其他成分（3）動物細(xì)胞的培養(yǎng)過程取動物胚胎剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞7（4）動物細(xì)胞生長特點(diǎn)：（5）動物細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果：

不能最終培養(yǎng)成生物體,而是細(xì)胞群。1）貼壁生長：培養(yǎng)瓶中的懸浮液細(xì)胞，緊貼培養(yǎng)瓶內(nèi)壁才能生長；2）接觸抑制：當(dāng)培養(yǎng)瓶中貼壁生長細(xì)胞彼此緊密接觸時，細(xì)胞不再分裂；3）細(xì)胞只分裂不分化。（4）動物細(xì)胞生長特點(diǎn)：（5）動物細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果：1）貼壁生8思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細(xì)胞培養(yǎng)材料？1、動物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？3、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個細(xì)胞？4、動物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動物血清等。獨(dú)特之處有：a、液體培養(yǎng)基b、成分中有動物血清等因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)不能，動物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細(xì)胞95、培養(yǎng)的細(xì)胞為什么會貼壁生長？

大多數(shù)組織細(xì)胞不適應(yīng)懸浮生長，他們必須在固體的表面上生長和分裂。

貼壁生長后隨細(xì)胞數(shù)目的增多，會出現(xiàn)接觸性抑制的現(xiàn)象。要定期要胰蛋白酶處理使細(xì)胞從瓶壁脫離，配成懸浮液，分裝多瓶再培養(yǎng)7、若一直在卡氏瓶中持續(xù)培養(yǎng)會出現(xiàn)什么情況？分解膠原纖維等蛋白6、用胰蛋白酶處理動物胚胎或幼齡動物的組織、器官？貼壁生長以及接觸抑制生長的細(xì)胞就會因細(xì)胞密度過大和代謝消耗引起營養(yǎng)枯竭，不能正常生長。5、培養(yǎng)的細(xì)胞為什么會貼壁生長？大多數(shù)組織細(xì)10從機(jī)體分離細(xì)胞：1.血液中的細(xì)胞：容易分離得到【收集血液，離心，棄上清】。血液中的細(xì)胞一般是懸浮細(xì)胞，不貼壁。2.實(shí)體組織中的細(xì)胞：機(jī)械消化、胰蛋白酶消化【消化組織中的膠原纖維和細(xì)胞外的其他成分】，制成單細(xì)胞懸液，然后貼壁培養(yǎng)。3.直接將組織塊放在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞從組織塊中生長遷移出來，形成生長暈并增大后，就適合進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)了，這種方法稱為外植體培養(yǎng)法。原代培養(yǎng)：除了來源于腫瘤組織外，大部分原代培養(yǎng)物的壽命是有限的，一定時間后會停止分裂、衰老死亡。連續(xù)細(xì)胞系：能夠無限增殖的原因有的是其基因發(fā)生了的突變，有的是其基因被人為改造了。目前已經(jīng)建立了很多連續(xù)細(xì)胞系，用于科研和藥物生產(chǎn)等【用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞一般是連續(xù)細(xì)胞系，如單抗生產(chǎn)】。從機(jī)體分離細(xì)胞：1.血液中的細(xì)胞：容易分離得到【收集血液，11（二）動物組織培養(yǎng)1.概念：動物組織在體外及人工條件下維持生活狀態(tài)或生長特性。

動物組織培養(yǎng)過程中可以伴隨組織分化。不管采用什么手段和培養(yǎng)條件，組織培養(yǎng)中主要生命活動成分仍然以細(xì)胞為單位的。2.結(jié)果：由于細(xì)胞的運(yùn)動、變化，使得培養(yǎng)物的組織成分也發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能變異，結(jié)果長期的培養(yǎng)經(jīng)常只能使單一類型的細(xì)胞保存下來，最終成了簡單的細(xì)胞培養(yǎng)。（二）動物組織培養(yǎng)1.概念：動物組織在體外及人工條件下維持生123.動物細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的聯(lián)系

兩者在一定程度上可看作是同義語，統(tǒng)稱為組織培養(yǎng)（組培），即代表各種生物體結(jié)構(gòu)成分的體外培養(yǎng)。

廣義的組織培養(yǎng)還包括器官培養(yǎng)，即器官的原基、器官的一部分或整個器官在體外和人工控制的條件下得以保存、生長，在此過程中保持器官的結(jié)構(gòu)、功能及分化能力。3.動物細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的聯(lián)系兩者在一定程度13動物細(xì)胞培養(yǎng)：體外培養(yǎng)分散后的單個細(xì)胞，使其得以生存，并保持生命活動現(xiàn)象。像體內(nèi)一樣呈現(xiàn)一定的組織特性。動物組織培養(yǎng)：體外培養(yǎng)動物組織，使其維持生活狀態(tài)或生長特性。可以伴隨組織分化，但最終成為細(xì)胞培養(yǎng)。動物器官培養(yǎng)：體外培養(yǎng)動物器官原基、部分或整個器官，使之得以保存、生長。保持器官的結(jié)構(gòu)、功能及分化能力。

組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)：體外培養(yǎng)分散后的單個細(xì)胞，使其得以生存，并保持147.1951年，海拉細(xì)胞系的建成。6.1950年，人工培養(yǎng)液“199”研制成功1.1885年，雞神經(jīng)板在生理鹽水中培養(yǎng)成活。2.1903年，皮膚及白細(xì)胞在腹水及血清中存活一個月，且觀察到細(xì)胞分裂。3.1907年，蛙胚神經(jīng)管在蛙淋巴液中懸浮培養(yǎng)，成功看到神經(jīng)末端的阿米巴運(yùn)動。4.1912年，雞胚浸出液對雞胚心臟組織塊進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。5.1943年，獲得長期培養(yǎng)細(xì)胞系（可連續(xù)傳代）和細(xì)胞克隆?！敖M織培養(yǎng)”一詞產(chǎn)生真正的組織培養(yǎng)開始；創(chuàng)立了懸浮培養(yǎng)法成功進(jìn)行了傳代培養(yǎng)；發(fā)明了卡氏瓶；標(biāo)志著組織培養(yǎng)工作進(jìn)入全新階段（三）動物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展7.1951年，海拉細(xì)胞系的建成。6.1950年，人工培養(yǎng)液15原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)從機(jī)體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞、組織培養(yǎng)原代培養(yǎng)細(xì)胞分成若干份，接種到若干份培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)生長，增殖?！?/p>

二氧化碳培養(yǎng)箱

通過在培養(yǎng)箱內(nèi)模擬形成一個類似細(xì)胞或組織在生物體內(nèi)的生長環(huán)境，如恒定的pH值（7.2-7.4）、穩(wěn)定的溫度（37°C）、較高的相對濕度（95%）、穩(wěn)定的CO2水平（5%），來對細(xì)胞或組織進(jìn)行體外培養(yǎng)的一種裝置。

原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)從機(jī)體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞、組織培養(yǎng)原代培養(yǎng)16從動物胚胎或幼齡動物組織切片中取小片樣品轉(zhuǎn)入特殊培養(yǎng)液原代培養(yǎng)分裝到多個卡氏瓶中傳代培養(yǎng)單個細(xì)胞懸浮液CO2培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)細(xì)胞系機(jī)械消化或胰酶消化（胰蛋白酶）

小結(jié)：培養(yǎng)過程

動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的膠原纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。原代培養(yǎng)物選擇或純化選擇或純化細(xì)胞株細(xì)胞株問題：為什么要從原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)向傳代培養(yǎng)？

原代培養(yǎng)的細(xì)胞，到一定時期時，貼壁生長以及接觸抑制生長的細(xì)胞就會因細(xì)胞密度過大和代謝消耗引起營養(yǎng)枯竭，不能正常生長。從動物胚胎或幼齡動物組織切片中取小片樣品轉(zhuǎn)入特殊培養(yǎng)液分裝到17動物細(xì)胞培養(yǎng)中卡氏瓶為什么要放在5%CO2培養(yǎng)箱，明明有蓋子？放入二氧化碳培養(yǎng)箱時，瓶口不是完全封死的。（對大多數(shù)以碳酸鹽作為pH緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)液而言，以為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)箱中的二氧化碳需要維持在5%左右，以保持培養(yǎng)液中溶解的二氧化碳的濃度。同時細(xì)胞培養(yǎng)的器皿需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。）動物細(xì)胞培養(yǎng)中卡氏瓶為什么要放在5%CO2培養(yǎng)箱，明明有蓋子18細(xì)胞系—有關(guān)概念:（2）連續(xù)細(xì)胞系:（1）有限細(xì)胞系：連續(xù)細(xì)胞株有限細(xì)胞株細(xì)胞株-可連續(xù)傳代的細(xì)胞不能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系大多數(shù)具有異倍體核型，有的是惡性細(xì)胞系，具有異體致瘤性，有的獲得不死性（保留接觸抑制，不致癌）例：二倍體細(xì)胞通過一定的選擇或純化方法，從原代培養(yǎng)或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)的細(xì)胞具有恒定的染色體組型、同工酶類型、病毒敏感性和生化特性。細(xì)胞系—有關(guān)概念:（2）連續(xù)細(xì)胞系:（1）有限細(xì)胞系：連續(xù)細(xì)19（四）克隆培養(yǎng)法把一個單細(xì)胞從群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之繁衍成一個新的細(xì)胞群體的技術(shù)1.定義：未經(jīng)克隆的異質(zhì)性細(xì)胞系純系：克隆經(jīng)克隆以后的細(xì)胞的后裔細(xì)胞群，來源于一個共同的祖細(xì)胞。2.產(chǎn)物:遺傳性狀均一、表現(xiàn)的性狀相似的純系3.細(xì)胞克隆的基本要求:必須保證所建成的克隆來源于單個細(xì)胞（四）克隆培養(yǎng)法把一個單細(xì)胞從群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之繁204.適合于克隆的細(xì)胞：

對環(huán)境有較大適應(yīng)范圍和具有較強(qiáng)獨(dú)立生存能力的細(xì)胞5.提高細(xì)胞克隆形成率的措施：選擇適宜的培養(yǎng)基添加血清（胎牛血清）

(能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和貼附)以滋養(yǎng)細(xì)胞支持生長（經(jīng)射線照射的小鼠成纖維細(xì)胞）激素刺激（胰島素等）使用CO2培養(yǎng)箱，調(diào)節(jié)PH

群體細(xì)胞>單細(xì)胞無限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化或腫瘤細(xì)胞>原代細(xì)胞、有限細(xì)胞系6.細(xì)胞克隆的主要用途：

從普通細(xì)胞系中分離出缺乏特殊基因的突變細(xì)胞系。

用于研究細(xì)胞的遺傳規(guī)律和生理特性。4.適合于克隆的細(xì)胞：5.提高細(xì)胞克隆形成率的措施：選擇適宜21CC22（2014浙江高考，3）下列關(guān)于動物細(xì)胞培養(yǎng)的敘述，正確的是A．連續(xù)細(xì)胞系的細(xì)胞大多具有二倍體核型B．某些癌細(xì)胞在合適條件下能逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞C．由多個祖細(xì)胞培養(yǎng)形成的細(xì)胞群為一個克隆D．未經(jīng)克隆化培養(yǎng)的細(xì)胞系細(xì)胞具有相同的性狀B（2014浙江高考，3）下列關(guān)于動物細(xì)胞培養(yǎng)的敘述，正確的是23植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素葡萄糖動物血清植物體細(xì)胞株、細(xì)胞系快速繁殖、培育無病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞24動物的細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用動物的細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用25動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞融合26細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞滅活的病毒物理法化學(xué)法仙臺病毒細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞滅活的病毒物理法仙臺病毒27用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核28誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì)：誘導(dǎo)劑：滅活的仙臺病毒、聚乙二醇

因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。思考討論：1.為什么細(xì)胞融合過程需要使用滅活的病毒？2.細(xì)胞融合過程中使用的病毒不滅活，行嗎？不滅活的話會感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì)：誘導(dǎo)劑：滅活的仙臺病毒、聚乙二醇294.細(xì)胞融合技術(shù)應(yīng)用于哪些方面？細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)及制備單克隆抗體。3.細(xì)胞融合就是細(xì)胞雜交嗎？細(xì)胞融合是可以要基因型相同或不同的細(xì)胞間進(jìn)行，其中基因型不同的細(xì)胞間的融合叫細(xì)胞雜交4.細(xì)胞融合技術(shù)應(yīng)用于哪些方面？細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)及制備30單克隆抗體1.什么是抗體？

效應(yīng)B細(xì)胞2.什么細(xì)胞可產(chǎn)生分泌型抗體？抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。單克隆抗體1.什么是抗體？效應(yīng)B細(xì)胞2.什么細(xì)胞可313.B淋巴細(xì)胞與抗體的關(guān)系a.B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。b.動物體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。c.每一個淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體。所以傳統(tǒng)的抗體的生產(chǎn)方法及缺陷是什么？怎樣解決這個問題？3.B淋巴細(xì)胞與抗體的關(guān)系a.B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)32單克隆抗體

由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。

特點(diǎn)：化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)、靈敏度高

單克隆抗體由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基33如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞如何篩選？融合方式？如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能如何篩選？34促進(jìn)融合的技術(shù)手段，那種融合方法是動物細(xì)胞融合特有的？融合后培養(yǎng)體系中的細(xì)胞種類有幾種？篩選雜交細(xì)胞的方法？促進(jìn)融合的技術(shù)手段，那種融合方法是動物細(xì)胞融合特有的？融合后35①首先用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞：篩選的目的：獲得雜交瘤細(xì)胞。篩選的方法：用選擇性培養(yǎng)基來完成，即HAT培養(yǎng)基。①首先用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞：36選擇的瘤細(xì)胞是有遺傳缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（TK－）或者次黃嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（HGPRT－）缺陷。篩選的方法：用選擇性培養(yǎng)基來完成，即HAT培養(yǎng)基。加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的培養(yǎng)基稱HAT培養(yǎng)基。其中，氨基喋呤可阻斷DNA合成的主要途徑。主要途徑阻斷后，依靠應(yīng)急途徑即在HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黃嘌呤合成DNA，缺少其中一種，DNA合成不能發(fā)生。用于雜交的骨髓瘤細(xì)胞系均由經(jīng)有毒藥物誘導(dǎo)而成選擇產(chǎn)生的代謝缺陷型細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)均無TK或HGPRT，所以單個或融合骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中將死亡。B細(xì)胞雖然有HGPRT和TK，但在體外通常培養(yǎng)條件下，尤其是在單個細(xì)胞環(huán)境下難于長期存活和增殖傳代。因此，只有雜交瘤細(xì)胞才能在HAT培養(yǎng)液中生長繁殖。選擇的瘤細(xì)胞是有遺傳缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（TK－）37淋巴細(xì)胞：不能生長，5到7天死亡；DNA的主要合成途徑被A阻斷。骨髓瘤細(xì)胞：不能生長，5到7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的旁路途經(jīng)受阻。骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，可長期生長繁殖。利用淋巴細(xì)胞的HGRT將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA。從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息，從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力。淋巴細(xì)胞：不能生長，5到7天死亡；DNA的主要合成途徑被A阻38通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，再由這些單細(xì)胞克隆生長，然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。②再篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞篩選產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋39陽性孔方法——抗原-抗體雜交法陽性孔方法——抗原-抗體雜交法40接下來就要進(jìn)行第二次“抗體檢驗(yàn)”，結(jié)果為陽性的細(xì)胞就是能分泌目標(biāo)抗體的單克隆細(xì)胞，這些細(xì)胞就可以進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)。教材中提到可能要進(jìn)行二次“抗體檢驗(yàn)”，是因?yàn)檫M(jìn)行一次有限稀釋法可能得到的不是單克隆細(xì)胞，要進(jìn)行第三次甚至更多次的有限稀釋和克隆化培養(yǎng)，還要再進(jìn)行第三次甚至更多次“專一抗體檢驗(yàn)”在克隆培養(yǎng)過程中有可能會出現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞的突變無法產(chǎn)生抗體;染色體丟失導(dǎo)致雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體等;由于不同的雜交瘤細(xì)胞的抗體生成率有差異,選擇效率更高的雜交瘤細(xì)胞等,因此第二次抗體檢測可以更好的選擇出符合生產(chǎn)要求的雜交瘤細(xì)胞。接下來就要進(jìn)行第二次“抗體檢驗(yàn)”，結(jié)果為陽性的細(xì)胞就是能分泌41（2019江蘇單科，23）如圖為雜交瘤細(xì)胞制備示意圖。骨髓瘤細(xì)胞由于缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT－），在HAT篩選培養(yǎng)液中不能正常合成DNA，無法生長。下列敘述錯誤的是A．可用滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合B．兩兩融合的細(xì)胞都能在HAT培養(yǎng)液中生長C．雜交瘤細(xì)胞需進(jìn)一步篩選才能用于生產(chǎn)D．細(xì)胞膜的流動性是細(xì)胞融合的基礎(chǔ)B（2019江蘇單科，23）如圖為雜交瘤細(xì)胞制備示意圖。骨髓瘤42如何得到大量的單克隆抗體？

體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)單克隆抗體——化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)、靈敏度高如何得到大量的單克隆抗體？43選修3動物的克隆優(yōu)秀課件44單克隆抗體二次篩選并克隆雜交細(xì)胞雜交（瘤）細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選雜交細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株提取經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞動物細(xì)胞融合技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備過程：特點(diǎn)：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點(diǎn)：化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)、靈敏度高注射抗原免疫單克隆抗體二次篩選并克隆雜交細(xì)胞雜交（瘤）細(xì)胞體外或體內(nèi)篩選45經(jīng)研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中的TOP2A蛋白大量表達(dá)，因此成為抗腫瘤的研究靶點(diǎn)，某科研單位制作了TOP2A蛋白的單克隆抗體。請回答：（2）TOP2A蛋白單克隆抗體的制備：將TOP2A蛋白反復(fù)多次注射到小鼠體內(nèi)，使其發(fā)生

，取經(jīng)過免疫的小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在物質(zhì)

介導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞。并將各雜交瘤細(xì)胞單獨(dú)分裝培養(yǎng)，經(jīng)篩選、

后，獲得能產(chǎn)生單一抗體的

（A.連續(xù)細(xì)胞系B.有限細(xì)胞系C.連續(xù)細(xì)胞株D.有限細(xì)胞株）。免疫反應(yīng)聚乙二醇克隆培養(yǎng)C經(jīng)研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中的TOP2A蛋白大量表達(dá)，因此成46請回答雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體制備的有關(guān)問題。（1）雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體時，利用一定的物質(zhì)，如生物誘導(dǎo)劑_____________________作介導(dǎo)，使經(jīng)免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出融合的細(xì)胞再進(jìn)行細(xì)胞的_____________培養(yǎng)，獲得純系細(xì)胞，同時還要進(jìn)行______________檢驗(yàn)，以保證獲得的是所需的特定雜交瘤細(xì)胞。（2）獲得雜交瘤細(xì)胞后，在體外培養(yǎng)時需要特別加入的天然成分是___________。（3）有關(guān)雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的敘述，正確的是_________A.用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)B.用滋養(yǎng)層細(xì)胞支持生長C.能進(jìn)行傳代培養(yǎng)D.需要對細(xì)胞進(jìn)行研磨破碎獲得產(chǎn)物滅活的（仙臺）病毒克隆抗體動物血清C請回答雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體制備的有關(guān)問題。（1）雜交瘤技術(shù)47（二）（1）免疫小鼠的脾臟（2）細(xì)胞融合基因型不同（3）多次（兩次）抗體檢驗(yàn)組織培養(yǎng)（4）必須保證分離出來的細(xì)胞是一個（合理即可）（二）（1）免疫小鼠的脾臟（2）細(xì)胞融合基因型不同48單克隆抗體的制備1、怎樣獲得能分泌專一抗體的B淋巴細(xì)胞？2、從何處獲得較多的B淋巴細(xì)胞？3、用什么方法可以使B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合？4、怎樣篩選出雜交瘤細(xì)胞？5、篩選出的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體都一樣嗎？6、怎樣獲得只產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞？反復(fù)注射特定的抗原，免疫小鼠。小鼠的脾臟PEG、滅活的病毒、電融合等利用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選否用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，稀釋度要保證每個孔內(nèi)不多于一個細(xì)胞?？乖贵w雜交法檢測——呈陽性反應(yīng)單克隆抗體的制備1、怎樣獲得能分泌專一抗體的B淋巴細(xì)胞？反復(fù)498、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理利用效應(yīng)B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的功能。利用骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的特性。利用動物細(xì)胞融合將兩種細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞。利用動物細(xì)胞培養(yǎng)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞9、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體7、怎樣獲得大量的單一抗體？體內(nèi)或體外大量培養(yǎng)特異的雜交瘤細(xì)胞，從中提取單一抗體。8、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培50單克隆抗體的應(yīng)用與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。應(yīng)用主要有：1、臨床診斷（利用抗原抗體反應(yīng)）2、作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤單克隆抗體的應(yīng)用與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體化學(xué)性質(zhì)單一，特異51結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈單抗放射性同位素結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈單抗放射性同位素52植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜的流動性、細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞融合的方法去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動物53小結(jié)兩個過程動物細(xì)胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法－－滅活病毒一個新細(xì)胞－－雜交瘤細(xì)胞一個優(yōu)勢－－單克隆抗體化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢小結(jié)兩個過程動物細(xì)胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個54動物的克隆繁殖動物的克隆繁殖55一、動物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度桑椹胚八分裂球受精卵二分裂球四分裂球囊胚原腸胚幼體組織、器官1、動物的受精卵，卵裂球含有2-8個細(xì)胞時，每個細(xì)胞具有全能性。P422、隨著胚胎發(fā)育的繼續(xù)，有的細(xì)胞只具有分化出各種組織細(xì)胞的潛能，這樣的細(xì)胞叫多能干細(xì)胞。3、有的細(xì)胞只能分化為一種細(xì)胞，叫單能干細(xì)胞。一、動物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度桑椹胚八分受精卵二分四分囊胚原腸56受精卵>胚胎干細(xì)胞>多能干細(xì)胞>單能干細(xì)胞>體細(xì)胞2.低等動物細(xì)胞：全能性一般容易體現(xiàn)。1.高等動物細(xì)胞3.癌細(xì)胞：仍能逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞。

無論分化還是癌變，變化的都是表現(xiàn)型，基因組成的完整性可以保留。一、動物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度為什么動物細(xì)胞很難表現(xiàn)出全能性？受精卵>胚胎干細(xì)胞>多能干細(xì)胞>單能干細(xì)胞>體細(xì)胞2.低等動57二、動物難以克隆的根本原因

基因的選擇性表達(dá)（差異表達(dá)），使得細(xì)胞中合成了專一的蛋白質(zhì)，即動物細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了分化。分化的細(xì)胞，其基因組中的基因不同時進(jìn)行活動。動物基因組一類基因：維持生存，各種細(xì)胞中都處于活動狀態(tài)一類基因：隨著組織器官和發(fā)育階段不同而選擇性表達(dá)。二、動物難以克隆的根本原因基因的選擇性表達(dá)（差異表達(dá)58三、核移植和動物的克隆繁殖去核注核重組細(xì)胞1.核移植：

利用一個細(xì)胞的細(xì)胞核（供體核）,來取代另一細(xì)胞中的細(xì)胞核，形成一個重建的“合子”（重組細(xì)胞），使發(fā)育成一個新的個體。三、核移植和動物的克隆繁殖去核注核重組細(xì)胞1.核移植59

胚胎細(xì)胞克?。菏褂玫墓w核來自胚胎

體細(xì)胞克?。菏褂玫墓w核來自體細(xì)胞1952年，羅伯特.布里格斯：

豹蛙→囊胚細(xì)胞核+去核的卵母細(xì)胞→發(fā)育成個體1978年，童第周：

黑斑蛙→成體紅細(xì)胞核→去核的卵細(xì)胞中→發(fā)育成蝌蚪2.動物克隆繁殖：胚胎細(xì)胞克?。菏褂玫墓w核來自胚胎體細(xì)胞克?。菏褂玫墓w60胚胎細(xì)胞核移植成功率遠(yuǎn)高于成體細(xì)胞核移植。胚胎細(xì)胞核移植成功率遠(yuǎn)高于成體細(xì)胞核移植。61克隆羊培育過程黑面綿羊去核卵細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植重組細(xì)胞電脈沖刺激早期胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利體細(xì)胞核移植技術(shù)實(shí)例2克隆羊培育過程黑面綿羊去核卵細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植62體細(xì)胞克隆羊成功的分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理：1.核移植前對乳腺細(xì)胞的營養(yǎng)限制性培養(yǎng)（通過調(diào)節(jié)牛血清濃度，使細(xì)胞周期同步化）和電脈沖細(xì)胞融合技術(shù)，有利于核的變化和細(xì)胞融合后基因表達(dá)分子開關(guān)啟動。2.重組卵細(xì)胞最初分裂時，轉(zhuǎn)錄并未開始。3.重組卵細(xì)胞的供體核DNA丟失了來源于乳腺細(xì)胞的阻止核基因表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白。4.開始第三次分裂時，原乳腺細(xì)胞的調(diào)節(jié)蛋白全部被卵細(xì)胞質(zhì)中的蛋白因子替換了，核DNA被重新編排，胚細(xì)胞開始表達(dá)自己的基因。體細(xì)胞克隆羊成功的分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理：1.核移植前對乳腺細(xì)胞63體細(xì)胞克隆羊的培育成功，證明了什么？

高度分化細(xì)胞經(jīng)一定技術(shù)處理，也可回復(fù)到類似受精卵時期的功能。在胚胎和個體發(fā)育中，細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核（包括異源的細(xì)胞核）發(fā)育的作用。（核質(zhì)互作）體細(xì)胞克隆羊的培育成功，證明了什么？645.動物克隆成功的條件：（1）具有包含本物種完整基因組的細(xì)胞核的活細(xì)胞如：乳腺上皮細(xì)胞；（2）能有效調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)如：去核卵的細(xì)胞質(zhì)；（3）完成胚胎發(fā)育的必要的環(huán)境條件如：誘導(dǎo)重組細(xì)胞生長、分化的實(shí)驗(yàn)條件和懷胎母體的子宮環(huán)境5.動物克隆成功的條件：（1）具有包含本物種完整基因組的細(xì)65選修3動物的克隆優(yōu)秀課件66例題：下列關(guān)于細(xì)胞全能性的敘述，錯誤的是例題：下列關(guān)于細(xì)胞全能性的敘述，錯誤的是67選修3動物的克隆優(yōu)秀課件68例題：下圖為植物細(xì)胞融合及組織培養(yǎng)過程示意圖。相關(guān)說法錯誤的是關(guān)于植物組織培養(yǎng)的敘述，錯誤的是例題：下圖為植物細(xì)胞融合及組織培養(yǎng)過程示意圖。相關(guān)說法錯誤的69例題：下列沒有應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)的是例題：下列沒有應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)的是70選修3動物的克隆優(yōu)秀課件71例題：下列關(guān)于植物組織培養(yǎng)的敘述，錯誤的是例題：下列關(guān)于植物組織培養(yǎng)的敘述，錯誤的是72選修3動物的克隆優(yōu)秀課件73選修3動物的克隆優(yōu)秀課件74選修3動物的克隆優(yōu)秀課件75用微笑告訴別人，今天的我，比昨天更強(qiáng)。瀑布跨過險(xiǎn)峻陡壁時，才顯得格外雄偉壯觀。勤奮可以彌補(bǔ)聰明的不足，但聰明無法彌補(bǔ)懶惰的缺陷。孤獨(dú)是每個強(qiáng)者必須經(jīng)歷的坎。有時候，堅(jiān)持了你最不想干的事情之后，會得到你最想要的東西。生命太過短暫，今天放棄了明天不一定能得到。只有經(jīng)歷人生的種種磨難，才能悟出人生的價(jià)值。沒有比人更高的山，沒有比腳更長的路學(xué)會堅(jiān)強(qiáng)，做一只沙漠中永不哭泣的駱駝！一個人沒有錢并不一定就窮，但沒有夢想那就窮定了。困難像彈簧，你強(qiáng)它就弱，你弱它就強(qiáng)。炫麗的彩虹，永遠(yuǎn)都在雨過天晴后。沒有人能令你失望，除了你自己人生舞臺的大幕隨時都可能拉開，關(guān)鍵是你愿意表演，還是選擇躲避。能把在面前行走的機(jī)會抓住的人，十有八九都會成功。再長的路，一步步也能走完，再短的路，不邁開雙腳也無法到達(dá)。有志者自有千計(jì)萬計(jì)，無志者只感千難萬難。我成功因?yàn)槲抑驹诔晒?！再冷的石頭，坐上三年也會暖。平凡的腳步也可以走完偉大的行程。有福之人是那些抱有美好的企盼從而靈魂得到真正滿足的人。如果我們都去做自己能力做得到的事，我們真會叫自己大吃一驚。只有不斷找尋機(jī)會的人才會及時把握機(jī)會。人之所以平凡，在于無法超越自己。無論才能知識多么卓著，如果缺乏熱情，則無異紙上畫餅充饑，無補(bǔ)于事。你可以選擇這樣的“三心二意”：信心恒心決心；創(chuàng)意樂意。駕馭命運(yùn)的舵是奮斗。不抱有一絲幻想，不放棄一點(diǎn)機(jī)會，不停止一日努力。如果一個人不知道他要駛向哪個碼頭，那么任何風(fēng)都不會是順風(fēng)。行動是理想最高貴的表達(dá)。你既然認(rèn)準(zhǔn)一條道路，何必去打聽要走多久。勇氣是控制恐懼心理，而不是心里毫無恐懼。不舉步，越不過柵欄；不邁腿，登不上高山。不知道明天干什么的人是不幸的！智者的夢再美，也不如愚人實(shí)干的腳印不要讓安逸盜取我們的生命力。別人只能給你指路，而不能幫你走路，自己的人生路，還需要自己走。勤奮可以彌補(bǔ)聰明的不足，但聰明無法彌補(bǔ)懶惰的缺陷。后悔是一種耗費(fèi)精神的情緒，后悔是比損失更大的損失，比錯誤更大的錯誤，所以，不要后悔！復(fù)雜的事情要簡單做，簡單的事情要認(rèn)真做，認(rèn)真的事情要重復(fù)做，重復(fù)的事情要創(chuàng)造性地做。只有那些能耐心把簡單事做得完美的人，才能獲得做好困難事的本領(lǐng)。生活就像在飆車，越快越刺激，相反，越慢越枯燥無味。人生的含義是什么，是奮斗。奮斗的動力是什么，是成功。決不能放棄，世界上沒有失敗，只有放棄。未跌過未識做人，不會哭未算幸運(yùn)。人生就像賽跑，不在乎你是否第一個到達(dá)終點(diǎn)，而在乎你有沒有跑完全程。累了，就要休息，休息好了之后，把所的都忘掉，重新開始！人生苦短，行走在人生路上，總會有許多得失和起落。人生離不開選擇，少不了抉擇，但選是累人的，擇是費(fèi)人的。坦然接受生活給你的饋贈吧，不管是好的還是壞的?，F(xiàn)在很痛苦，等過陣子回頭看看，會發(fā)現(xiàn)其實(shí)那都不算事。要先把手放開，才抓得住精彩旳未來?？梢詯?，可以恨，不可以漫不經(jīng)心。我比別人知道得多，不過是我知道自己的無知。你若不想做，會找一個或無數(shù)個借口；你若想做，會想一個或無數(shù)個辦法。見時間的離開，我在某年某月醒過來，飛過一片時間海，我們也常在愛情里受傷害。1、只有在開水里，茶葉才能展開生命濃郁的香氣。人生就像奔騰的江水，沒有島嶼與暗礁，就難以激起美麗的浪花。別人能做到的事，我一定也能做到。不要浪費(fèi)你的生命，在你一定會后悔的地方上。逆境中，力挽狂瀾使強(qiáng)者更強(qiáng)，隨波逐流使弱者更弱。涼風(fēng)把楓葉吹紅，冷言讓強(qiáng)者成熟。努力不不一定成功，不努力一定不成功。永遠(yuǎn)不抱怨，一切靠自己。人生最大的改變就是去做自己害怕的事情。每一個成功者都有一個開始。勇于開始，才能找到成功的路。社會上要想分出層次，只有一個辦法，那就是競爭，你必須努力，否則結(jié)局就是被壓在社會的底層。后悔是一種耗費(fèi)精神的情緒后悔是比損失更大的損失，比錯誤更大的錯誤所以不要后悔。每個人都有潛在的能量，只是很容易:被習(xí)慣所掩蓋，被時間所迷離,被惰性所消磨。與其臨淵羨魚，不如退而結(jié)網(wǎng)。生命之燈因熱情而點(diǎn)燃，生命之舟因拼搏而前行。世界會向那些有目標(biāo)和遠(yuǎn)見的人讓路。不積跬步，無以至千里；不積小流，無以成江海。騏驥一躍，不能十步；駑馬十駕，功在不舍。鍥而舍之，朽木不折；鍥而不舍，金石可鏤。若不給自己設(shè)限，則人生中就沒有限制你發(fā)揮的藩籬。賺錢之道很多，但是找不到賺錢的種子，便成不了事業(yè)家。最有效的資本是我們的信譽(yù)，它小時不停為我們工作。銷售世界上第一號的產(chǎn)品——不是汽車，而是自己。在你成功地把自己推銷給別人之前，你必須百分之百的把自己推銷給自己。即使爬到最高的山上，一次也只能腳踏實(shí)地地邁一步。用微笑告訴別人，今天的我，比昨天更強(qiáng)。瀑布跨過險(xiǎn)峻陡壁時，才76第三節(jié)動物的克隆動物克隆的技術(shù)基礎(chǔ)：動物的細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)植物克隆的技術(shù)基礎(chǔ)：植物組織培養(yǎng)第三節(jié)動物的克隆動物克隆的技術(shù)基礎(chǔ)：動物的細(xì)胞培養(yǎng)植物克77動物細(xì)胞的培養(yǎng)和克隆形成動物細(xì)胞的培養(yǎng)和781、動物細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞將動物體內(nèi)的一部分組織取出分散成單個細(xì)胞放在適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞得以生存并保持生命活動現(xiàn)象生存、生長、分裂乃至接觸抑制和有規(guī)律的衰老、死亡性能等一、動物細(xì)胞的培養(yǎng)和克隆形成機(jī)械消化或胰酶消化（1）定義為什么要分散成單個細(xì)胞培養(yǎng)？1、動物細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞將動物體內(nèi)的一部分組織取出分散79正常細(xì)胞癌細(xì)胞接觸抑制正常細(xì)胞癌細(xì)胞接觸抑制80（2）動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1）離體2）營養(yǎng)物質(zhì)：無機(jī)鹽、葡萄糖、氨基酸、維生素、

動物血清3）恒溫和pH，無需光照4）無菌無毒的環(huán)境保證細(xì)胞順利的生長增殖（2）動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1）離體保證細(xì)胞順利的生長增殖811.培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、糖類、維生素、無機(jī)鹽、激素、其他成分（生長因子【添加動物血清】）培養(yǎng)條件：2.氣體：CO2

O2【CO2

培養(yǎng)箱：5%CO2和95%的空氣

，培養(yǎng)時培養(yǎng)瓶的蓋子處于擰松狀態(tài)】CO2的作用：調(diào)節(jié)PH

3.理化條件：PH【5%CO2調(diào)節(jié)PH

，培養(yǎng)基中加入PH緩沖劑，培養(yǎng)過程中細(xì)胞代謝產(chǎn)生很多酸性物質(zhì)，PH發(fā)生改變，為了實(shí)時監(jiān)控培養(yǎng)基中PH的變化，一般在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若培養(yǎng)基顏色變化超過一定程度，即使細(xì)胞密度不大，也要更換培養(yǎng)基?！?、滲透壓、溫度、濕度【CO2

培養(yǎng)箱：37℃，濕度很高】4.無菌條件5.大部分細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，需要一個可貼附的表面【細(xì)胞培養(yǎng)瓶或卡氏瓶的壁，培養(yǎng)皿的壁】，會接觸抑制，培養(yǎng)密度不能過大。少部分細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞的密度可遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于貼壁細(xì)胞，因此利用動物細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)一些藥物時，最好使用懸浮細(xì)胞。1.培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、糖類、維生素、無機(jī)鹽、激素、其82（3）動物細(xì)胞的培養(yǎng)過程

取動物胚胎或幼齡動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個細(xì)胞因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)分解組織中的膠原纖維和細(xì)胞外的其他成分（3）動物細(xì)胞的培養(yǎng)過程取動物胚胎剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞83（4）動物細(xì)胞生長特點(diǎn)：（5）動物細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果：

不能最終培養(yǎng)成生物體,而是細(xì)胞群。1）貼壁生長：培養(yǎng)瓶中的懸浮液細(xì)胞，緊貼培養(yǎng)瓶內(nèi)壁才能生長；2）接觸抑制：當(dāng)培養(yǎng)瓶中貼壁生長細(xì)胞彼此緊密接觸時，細(xì)胞不再分裂；3）細(xì)胞只分裂不分化。（4）動物細(xì)胞生長特點(diǎn)：（5）動物細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果：1）貼壁生84思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細(xì)胞培養(yǎng)材料？1、動物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？3、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個細(xì)胞？4、動物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動物血清等。獨(dú)特之處有：a、液體培養(yǎng)基b、成分中有動物血清等因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)不能，動物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細(xì)胞855、培養(yǎng)的細(xì)胞為什么會貼壁生長？

大多數(shù)組織細(xì)胞不適應(yīng)懸浮生長，他們必須在固體的表面上生長和分裂。

貼壁生長后隨細(xì)胞數(shù)目的增多，會出現(xiàn)接觸性抑制的現(xiàn)象。要定期要胰蛋白酶處理使細(xì)胞從瓶壁脫離，配成懸浮液，分裝多瓶再培養(yǎng)7、若一直在卡氏瓶中持續(xù)培養(yǎng)會出現(xiàn)什么情況？分解膠原纖維等蛋白6、用胰蛋白酶處理動物胚胎或幼齡動物的組織、器官？貼壁生長以及接觸抑制生長的細(xì)胞就會因細(xì)胞密度過大和代謝消耗引起營養(yǎng)枯竭，不能正常生長。5、培養(yǎng)的細(xì)胞為什么會貼壁生長？大多數(shù)組織細(xì)86從機(jī)體分離細(xì)胞：1.血液中的細(xì)胞：容易分離得到【收集血液，離心，棄上清】。血液中的細(xì)胞一般是懸浮細(xì)胞，不貼壁。2.實(shí)體組織中的細(xì)胞：機(jī)械消化、胰蛋白酶消化【消化組織中的膠原纖維和細(xì)胞外的其他成分】，制成單細(xì)胞懸液，然后貼壁培養(yǎng)。3.直接將組織塊放在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞從組織塊中生長遷移出來，形成生長暈并增大后，就適合進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)了，這種方法稱為外植體培養(yǎng)法。原代培養(yǎng)：除了來源于腫瘤組織外，大部分原代培養(yǎng)物的壽命是有限的，一定時間后會停止分裂、衰老死亡。連續(xù)細(xì)胞系：能夠無限增殖的原因有的是其基因發(fā)生了的突變，有的是其基因被人為改造了。目前已經(jīng)建立了很多連續(xù)細(xì)胞系，用于科研和藥物生產(chǎn)等【用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞一般是連續(xù)細(xì)胞系，如單抗生產(chǎn)】。從機(jī)體分離細(xì)胞：1.血液中的細(xì)胞：容易分離得到【收集血液，87（二）動物組織培養(yǎng)1.概念：動物組織在體外及人工條件下維持生活狀態(tài)或生長特性。

動物組織培養(yǎng)過程中可以伴隨組織分化。不管采用什么手段和培養(yǎng)條件，組織培養(yǎng)中主要生命活動成分仍然以細(xì)胞為單位的。2.結(jié)果：由于細(xì)胞的運(yùn)動、變化，使得培養(yǎng)物的組織成分也發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能變異，結(jié)果長期的培養(yǎng)經(jīng)常只能使單一類型的細(xì)胞保存下來，最終成了簡單的細(xì)胞培養(yǎng)。（二）動物組織培養(yǎng)1.概念：動物組織在體外及人工條件下維持生883.動物細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的聯(lián)系

兩者在一定程度上可看作是同義語，統(tǒng)稱為組織培養(yǎng)（組培），即代表各種生物體結(jié)構(gòu)成分的體外培養(yǎng)。

廣義的組織培養(yǎng)還包括器官培養(yǎng)，即器官的原基、器官的一部分或整個器官在體外和人工控制的條件下得以保存、生長，在此過程中保持器官的結(jié)構(gòu)、功能及分化能力。3.動物細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的聯(lián)系兩者在一定程度89動物細(xì)胞培養(yǎng)：體外培養(yǎng)分散后的單個細(xì)胞，使其得以生存，并保持生命活動現(xiàn)象。像體內(nèi)一樣呈現(xiàn)一定的組織特性。動物組織培養(yǎng)：體外培養(yǎng)動物組織，使其維持生活狀態(tài)或生長特性?？梢园殡S組織分化，但最終成為細(xì)胞培養(yǎng)。動物器官培養(yǎng)：體外培養(yǎng)動物器官原基、部分或整個器官，使之得以保存、生長。保持器官的結(jié)構(gòu)、功能及分化能力。

組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)：體外培養(yǎng)分散后的單個細(xì)胞，使其得以生存，并保持907.1951年，海拉細(xì)胞系的建成。6.1950年，人工培養(yǎng)液“199”研制成功1.1885年，雞神經(jīng)板在生理鹽水中培養(yǎng)成活。2.1903年，皮膚及白細(xì)胞在腹水及血清中存活一個月，且觀察到細(xì)胞分裂。3.1907年，蛙胚神經(jīng)管在蛙淋巴液中懸浮培養(yǎng)，成功看到神經(jīng)末端的阿米巴運(yùn)動。4.1912年，雞胚浸出液對雞胚心臟組織塊進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。5.1943年，獲得長期培養(yǎng)細(xì)胞系（可連續(xù)傳代）和細(xì)胞克隆。“組織培養(yǎng)”一詞產(chǎn)生真正的組織培養(yǎng)開始；創(chuàng)立了懸浮培養(yǎng)法成功進(jìn)行了傳代培養(yǎng)；發(fā)明了卡氏瓶；標(biāo)志著組織培養(yǎng)工作進(jìn)入全新階段（三）動物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展7.1951年，海拉細(xì)胞系的建成。6.1950年，人工培養(yǎng)液91原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)從機(jī)體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞、組織培養(yǎng)原代培養(yǎng)細(xì)胞分成若干份，接種到若干份培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)生長，增殖。…………

二氧化碳培養(yǎng)箱

通過在培養(yǎng)箱內(nèi)模擬形成一個類似細(xì)胞或組織在生物體內(nèi)的生長環(huán)境，如恒定的pH值（7.2-7.4）、穩(wěn)定的溫度（37°C）、較高的相對濕度（95%）、穩(wěn)定的CO2水平（5%），來對細(xì)胞或組織進(jìn)行體外培養(yǎng)的一種裝置。

原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)從機(jī)體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞、組織培養(yǎng)原代培養(yǎng)92從動物胚胎或幼齡動物組織切片中取小片樣品轉(zhuǎn)入特殊培養(yǎng)液原代培養(yǎng)分裝到多個卡氏瓶中傳代培養(yǎng)單個細(xì)胞懸浮液CO2培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)細(xì)胞系機(jī)械消化或胰酶消化（胰蛋白酶）

小結(jié)：培養(yǎng)過程

動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的膠原纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。原代培養(yǎng)物選擇或純化選擇或純化細(xì)胞株細(xì)胞株問題：為什么要從原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)向傳代培養(yǎng)？

原代培養(yǎng)的細(xì)胞，到一定時期時，貼壁生長以及接觸抑制生長的細(xì)胞就會因細(xì)胞密度過大和代謝消耗引起營養(yǎng)枯竭，不能正常生長。從動物胚胎或幼齡動物組織切片中取小片樣品轉(zhuǎn)入特殊培養(yǎng)液分裝到93動物細(xì)胞培養(yǎng)中卡氏瓶為什么要放在5%CO2培養(yǎng)箱，明明有蓋子？放入二氧化碳培養(yǎng)箱時，瓶口不是完全封死的。（對大多數(shù)以碳酸鹽作為pH緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)液而言，以為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)箱中的二氧化碳需要維持在5%左右，以保持培養(yǎng)液中溶解的二氧化碳的濃度。同時細(xì)胞培養(yǎng)的器皿需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。）動物細(xì)胞培養(yǎng)中卡氏瓶為什么要放在5%CO2培養(yǎng)箱，明明有蓋子94細(xì)胞系—有關(guān)概念:（2）連續(xù)細(xì)胞系:（1）有限細(xì)胞系：連續(xù)細(xì)胞株有限細(xì)胞株細(xì)胞株-可連續(xù)傳代的細(xì)胞不能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系能連續(xù)培養(yǎng)下去的細(xì)胞系大多數(shù)具有異倍體核型，有的是惡性細(xì)胞系，具有異體致瘤性，有的獲得不死性（保留接觸抑制，不致癌）例：二倍體細(xì)胞通過一定的選擇或純化方法，從原代培養(yǎng)或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)的細(xì)胞具有恒定的染色體組型、同工酶類型、病毒敏感性和生化特性。細(xì)胞系—有關(guān)概念:（2）連續(xù)細(xì)胞系:（1）有限細(xì)胞系：連續(xù)細(xì)95（四）克隆培養(yǎng)法把一個單細(xì)胞從群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之繁衍成一個新的細(xì)胞群體的技術(shù)1.定義：未經(jīng)克隆的異質(zhì)性細(xì)胞系純系：克隆經(jīng)克隆以后的細(xì)胞的后裔細(xì)胞群，來源于一個共同的祖細(xì)胞。2.產(chǎn)物:遺傳性狀均一、表現(xiàn)的性狀相似的純系3.細(xì)胞克隆的基本要求:必須保證所建成的克隆來源于單個細(xì)胞（四）克隆培養(yǎng)法把一個單細(xì)胞從群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之繁964.適合于克隆的細(xì)胞：

對環(huán)境有較大適應(yīng)范圍和具有較強(qiáng)獨(dú)立生存能力的細(xì)胞5.提高細(xì)胞克隆形成率的措施：選擇適宜的培養(yǎng)基添加血清（胎牛血清）

(能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和貼附)以滋養(yǎng)細(xì)胞支持生長（經(jīng)射線照射的小鼠成纖維細(xì)胞）激素刺激（胰島素等）使用CO2培養(yǎng)箱，調(diào)節(jié)PH

群體細(xì)胞>單細(xì)胞無限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化或腫瘤細(xì)胞>原代細(xì)胞、有限細(xì)胞系6.細(xì)胞克隆的主要用途：

從普通細(xì)胞系中分離出缺乏特殊基因的突變細(xì)胞系。

用于研究細(xì)胞的遺傳規(guī)律和生理特性。4.適合于克隆的細(xì)胞：5.提高細(xì)胞克隆形成率的措施：選擇適宜97CC98（2014浙江高考，3）下列關(guān)于動物細(xì)胞培養(yǎng)的敘述，正確的是A．連續(xù)細(xì)胞系的細(xì)胞大多具有二倍體核型B．某些癌細(xì)胞在合適條件下能逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞C．由多個祖細(xì)胞培養(yǎng)形成的細(xì)胞群為一個克隆D．未經(jīng)克隆化培養(yǎng)的細(xì)胞系細(xì)胞具有相同的性狀B（2014浙江高考，3）下列關(guān)于動物細(xì)胞培養(yǎng)的敘述，正確的是99植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素葡萄糖動物血清植物體細(xì)胞株、細(xì)胞系快速繁殖、培育無病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞100動物的細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用動物的細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用101動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞融合102細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞滅活的病毒物理法化學(xué)法仙臺病毒細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞滅活的病毒物理法仙臺病毒103用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核104誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì)：誘導(dǎo)劑：滅活的仙臺病毒、聚乙二醇

因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。思考討論：1.為什么細(xì)胞融合過程需要使用滅活的病毒？2.細(xì)胞融合過程中使用的病毒不滅活，行嗎？不滅活的話會感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì)：誘導(dǎo)劑：滅活的仙臺病毒、聚乙二醇1054.細(xì)胞融合技術(shù)應(yīng)用于哪些方面？細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)及制備單克隆抗體。3.細(xì)胞融合就是細(xì)胞雜交嗎？細(xì)胞融合是可以要基因型相同或不同的細(xì)胞間進(jìn)行，其中基因型不同的細(xì)胞間的融合叫細(xì)胞雜交4.細(xì)胞融合技術(shù)應(yīng)用于哪些方面？細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)及制備106單克隆抗體1.什么是抗體？

效應(yīng)B細(xì)胞2.什么細(xì)胞可產(chǎn)生分泌型抗體？抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。單克隆抗體1.什么是抗體？效應(yīng)B細(xì)胞2.什么細(xì)胞可1073.B淋巴細(xì)胞與抗體的關(guān)系a.B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。b.動物體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。c.每一個淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體。所以傳統(tǒng)的抗體的生產(chǎn)方法及缺陷是什么？怎樣解決這個問題？3.B淋巴細(xì)胞與抗體的關(guān)系a.B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)108單克隆抗體

由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。

特點(diǎn)：化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)、靈敏度高

單克隆抗體由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克隆），形成基109如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞如何篩選？融合方式？如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能如何篩選？110促進(jìn)融合的技術(shù)手段，那種融合方法是動物細(xì)胞融合特有的？融合后培養(yǎng)體系中的細(xì)胞種類有幾種？篩選雜交細(xì)胞的方法？促進(jìn)融合的技術(shù)手段，那種融合方法是動物細(xì)胞融合特有的？融合后111①首先用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞：篩選的目的：獲得雜交瘤細(xì)胞。篩選的方法：用選擇性培養(yǎng)基來完成，即HAT培養(yǎng)基。①首先用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞：112選擇的瘤細(xì)胞是有遺傳缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（TK－）或者次黃嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（HGPRT－）缺陷。篩選的方法：用選擇性培養(yǎng)基來完成，即HAT培養(yǎng)基。加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的培養(yǎng)基稱HAT培養(yǎng)基。其中，氨基喋呤可阻斷DNA合成的主要途徑。主要途徑阻斷后，依靠應(yīng)急途徑即在HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黃嘌呤合成DNA，缺少其中一種，DNA合成不能發(fā)生。用于雜交的骨髓瘤細(xì)胞系均由經(jīng)有毒藥物誘導(dǎo)而成選擇產(chǎn)生的代謝缺陷型細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)均無TK或HGPRT，所以單個或融合骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中將死亡。B細(xì)胞雖然有HGPRT和TK，但在體外通常培養(yǎng)條件下，尤其是在單個細(xì)胞環(huán)境下難于長期存活和增殖傳代。因此，只有雜交瘤細(xì)胞才能在HAT培養(yǎng)液中生長繁殖。選擇的瘤細(xì)胞是有遺傳缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（TK－）113淋巴細(xì)胞：不能生長，5到7天死亡；DNA的主要合成途徑被A阻斷。骨髓瘤細(xì)胞：不能生長，5到7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的旁路途經(jīng)受阻。骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，可長期生長繁殖。利用淋巴細(xì)胞的HGRT將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA。從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息，從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力。淋巴細(xì)胞：不能生長，5到7天死亡；DNA的主要合成途徑被A阻114通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，再由這些單細(xì)胞克隆生長，然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。②再篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞篩選產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋115陽性孔方法——抗原-抗體雜交法陽性孔方法——抗原-抗體雜交法116接下來就要進(jìn)行第二次“抗體檢驗(yàn)”，結(jié)果為陽性的細(xì)胞就是能分泌目標(biāo)抗體的單克隆細(xì)胞，這些細(xì)胞就可以進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)。教材中提到可能要進(jìn)行二次“抗體檢驗(yàn)”，是因?yàn)檫M(jìn)行一次有限稀釋法可能得到的不是單克隆細(xì)胞，要進(jìn)行第三次甚至更多次的有限稀釋和克隆化培養(yǎng)，還要再進(jìn)行第三次甚至更多次“專一抗體檢驗(yàn)”在克隆培養(yǎng)過程中有可能會出現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞的突變無法產(chǎn)生抗體;染色體丟失導(dǎo)致雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體等;由于不同的雜交瘤細(xì)胞的抗體生成率有差異,選擇效率更高的雜交瘤細(xì)胞等,因此第二次抗體檢測可以更好的選擇出符合生產(chǎn)要求的雜交瘤細(xì)胞。接下來就要進(jìn)行第二次“抗體檢驗(yàn)”，結(jié)果為陽性的細(xì)胞就是能分泌117（2019江蘇單科，23）如圖為雜交瘤細(xì)胞制備示意圖。骨髓瘤細(xì)胞由于缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT－），在HAT篩選培養(yǎng)液中不能正常合成DNA，無法生長。下列敘述錯誤的是A．可用滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合B．兩兩融合的細(xì)胞都能在HAT培養(yǎng)液中生長C．雜交瘤細(xì)胞需進(jìn)一步篩選才能用于生產(chǎn)D．細(xì)胞膜的流動性是細(xì)胞融合的基礎(chǔ)B（2019江蘇單科，23）如圖為雜交瘤細(xì)胞制備示意圖。骨髓瘤118如何得到大量的單克隆抗體？

體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)單克隆抗體——化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)、靈敏度高如何得到大量的單克隆抗體？119選修3動物的克隆優(yōu)秀課件120單克隆抗體二次篩選并克隆雜交細(xì)胞雜交（瘤）細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選雜交細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株提取經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞動物細(xì)胞融合技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備過程：特點(diǎn)：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點(diǎn)：化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)、靈敏度高注射抗原免疫單克隆抗體二次篩選并克隆雜交細(xì)胞雜交（瘤）細(xì)胞體外或體內(nèi)篩選121經(jīng)研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中的TOP2A蛋白大量表達(dá)，因此成為抗腫瘤的研究靶點(diǎn)，某科研單位制作了TOP2A蛋白的單克隆抗體。請回答：（2）TOP2A蛋白單克隆抗體的制備：將TOP2A蛋白反復(fù)多次注射到小鼠體內(nèi)，使其發(fā)生

，取經(jīng)過免疫的小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在物質(zhì)

介導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞。并將各雜交瘤細(xì)胞單獨(dú)分裝培養(yǎng)，經(jīng)篩選、

后，獲得能產(chǎn)生單一抗體的

（A.連續(xù)細(xì)胞系B.有限細(xì)胞系C.連續(xù)細(xì)胞株D.有限細(xì)胞株）。免疫反應(yīng)聚乙二醇克隆培養(yǎng)C經(jīng)研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中的TOP2A蛋白大量表達(dá)，因此成122請回答雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體制備的有關(guān)問題。（1）雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體時，利用一定的物質(zhì)，如生物誘導(dǎo)劑_____________________作介導(dǎo)，使經(jīng)免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出融合的細(xì)胞再進(jìn)行細(xì)胞的_____________培養(yǎng)，獲得純系細(xì)胞，同時還要進(jìn)行______________檢驗(yàn)，以保證獲得的是所需的特定雜交瘤細(xì)胞。（2）獲得雜交瘤細(xì)胞后，在體外培養(yǎng)時需要特別加入的天然成分是___________。（3）有關(guān)雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的敘述，正確的是_________A.用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)B.用滋養(yǎng)層細(xì)胞支持生長C.能進(jìn)行傳代培養(yǎng)D.需要對細(xì)胞進(jìn)行研磨破碎獲得產(chǎn)物滅活的（仙臺）病毒克隆抗體動物血清C請回答雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體制備的有關(guān)問題。（1）雜交瘤技術(shù)123（二）（1）免疫小鼠的脾臟（2）細(xì)胞融合基因型不同（3）多次（兩次）抗體檢驗(yàn)組織培養(yǎng)（4）必須保證分離出來的細(xì)胞是一個（合理即可）（二）（1）免疫小鼠的脾臟（2）細(xì)胞融合基因型不同124單克隆抗體的制備1、怎樣獲得能分泌專一抗體的B淋巴細(xì)胞？2、從何處獲得較多的B淋巴細(xì)胞？3、用什么方法可以使B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合？4、怎樣篩選出雜交瘤細(xì)胞？5、篩選出的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體都一樣嗎？6、怎樣獲得只產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞？反復(fù)注射特定的抗原，免疫小鼠。小鼠的脾臟PEG、滅活的病毒、電融合等利用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選否用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，稀釋度要保證每個孔內(nèi)不多于一個細(xì)胞?？乖贵w雜交法檢測——呈陽性反應(yīng)單克隆抗體的制備1、怎樣獲得能分泌專一抗體的B淋巴細(xì)胞？反復(fù)1258、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理利用效應(yīng)B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的功能。利用骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的特性。利用動物細(xì)胞融合將兩種細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞。利用動物細(xì)胞培養(yǎng)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞9、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體7、怎樣獲得大量的單一抗體？體內(nèi)或體外大量培養(yǎng)特異的雜交瘤細(xì)胞，從中提取單一抗體。8、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培126單克隆抗體的應(yīng)用與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。應(yīng)用主要有：1、臨床診斷（利用抗原抗體反應(yīng)）2、作為載體，運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤單克隆抗體的應(yīng)用與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體化學(xué)性質(zhì)單一，特異127結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈單抗放射性同位素結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈單抗放射性同位素128植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜的流動性、細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞融合的方法去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動物129小結(jié)兩個過程動物細(xì)胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法－－滅活病毒一個新細(xì)胞－－雜交瘤細(xì)胞一個優(yōu)勢－－單克隆抗體化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢小結(jié)兩個過程動物細(xì)胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個130動物的克隆繁殖動物的克隆繁殖131一、動物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度桑椹胚八分裂球受精卵二分裂球四分裂球囊胚原腸胚幼體組織、器官1、動物的受精卵，卵裂球含有2-8個細(xì)胞時，每個細(xì)胞具有全能性。P422、隨著胚胎發(fā)育的繼續(xù)，有的細(xì)胞只具有分化出各種組織細(xì)胞的潛能，這樣的細(xì)胞叫多能干細(xì)胞。3、有的細(xì)胞只能分化為一種細(xì)胞，叫單能干細(xì)胞。一、動物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度桑椹胚八分受精卵二分四分囊胚原腸132受精卵>胚胎干細(xì)胞>多能干細(xì)胞>單能干細(xì)胞>體細(xì)胞2.低等動物細(xì)胞：全能性一般容易體現(xiàn)。1.高等動物細(xì)胞3.癌細(xì)胞：仍能逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞。

無論分化還是癌變，變化的都是表現(xiàn)型，基因組成的完整性可以保留。一、動物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度為什么動物細(xì)胞很難表現(xiàn)出全能性？受精卵>胚胎干細(xì)胞>多能干細(xì)胞>單能干細(xì)胞>體細(xì)胞2.低等動133二、動物難以克隆的根本原因

基因的選擇性表達(dá)（差異表達(dá)），使得細(xì)胞中合成了專一的蛋白質(zhì)，即動物細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了分化。分化的細(xì)胞，其基因組中的基因不同時進(jìn)行活動。動物基因組一類基因：維持生存，各種細(xì)胞中都處于活動狀態(tài)一類基因：隨著組織器官和發(fā)育階段不同而選擇性表達(dá)。二、動物難以克隆的根本原因基因的選擇性表達(dá)（差異表達(dá)134三、核移植和動物的克隆繁殖去核注核重組細(xì)胞1.核移植：

利用一個細(xì)胞的細(xì)胞核（供體核）,來取代另一細(xì)胞中的細(xì)胞核，形成一個重建的“合子”（重組細(xì)胞），使發(fā)育成一個新的個體。三、核移植和動物的克隆繁殖去核注核重組細(xì)胞1.核移植135

胚胎細(xì)胞克?。菏褂玫墓w核來自胚胎

體細(xì)胞克?。菏褂玫墓w核來自體細(xì)胞1952年，羅伯特.布里格斯：

豹蛙→囊胚細(xì)胞核+去核的卵母細(xì)胞→發(fā)育成個體1978年，童第周：

黑斑蛙→成體紅細(xì)胞核→去核的卵細(xì)胞中→發(fā)育成蝌蚪2.動物克隆繁殖：胚胎細(xì)胞克隆：使用的供體核來自胚胎體細(xì)胞克?。菏褂玫墓w136胚胎細(xì)胞核移植成功率遠(yuǎn)高于成體細(xì)胞核移植。胚胎細(xì)胞核移植成功率遠(yuǎn)高于成體細(xì)胞核移植。137克隆羊培育過程黑面綿羊去核卵細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植重組細(xì)胞電脈沖刺激早期胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利體細(xì)胞核移植技術(shù)實(shí)例2克隆羊培育過程黑面綿羊去核卵細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植138體細(xì)胞克隆羊成功的分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理：