安醫(yī)大生殖醫(yī)學(xué)課件01轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)

Geneticallymodifiedanimals

概念轉(zhuǎn)基因(transgene)是指以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因在其染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代。外源基因隨細(xì)胞分裂分配到所有子細(xì)胞中并遺傳給后代，這種動(dòng)物叫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。嚴(yán)格說(shuō)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有別于嵌合體。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的意義進(jìn)行功能基因組學(xué)研究，研究外源基因在動(dòng)物整體水平的表達(dá)、調(diào)控及基因之間的相互作用建立動(dòng)物疾病模型，進(jìn)行發(fā)病學(xué)和治療性研究改變動(dòng)物基因，使其表現(xiàn)型更適合人類(lèi)需要生產(chǎn)人類(lèi)所需的生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是動(dòng)物基因工程在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中的突出成果。近十年來(lái)，為分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、腫瘤研究及優(yōu)良經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的開(kāi)發(fā)研究等多方面做出了很大的貢獻(xiàn)。與嵌合體的區(qū)別嵌合體只有部分組織細(xì)胞的基因組中整合有外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法制備動(dòng)物第一代均為嵌合體。雄原核顯微注射法制備的動(dòng)物第一代中1-10%為嵌合體（延遲整合）發(fā)展簡(jiǎn)史1972年，Gordon等人首次試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因小鼠，將含有HSV和SV40DNA片段的重組質(zhì)粒DNA以顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核1982年P(guān)almiter等運(yùn)用此法得到的所謂“超級(jí)巨鼠”,曾引起整個(gè)生物學(xué)界的轟動(dòng)相繼獲得轉(zhuǎn)基因魚(yú)、鼠、羊、豬、兔、牛等動(dòng)物從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所獲得的資料幾乎涉及醫(yī)學(xué)遺傳、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等的基因研究，還涉及生物藥物的研究，基因治療的開(kāi)發(fā)研究

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法受精卵雄原核顯微注射法胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法體細(xì)胞核移植法精子載體法YAC法1、雄原核顯微注射法

以單細(xì)胞受精卵為靶細(xì)胞，利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的載體DNA直接注射入受精卵的原核，再將接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續(xù)發(fā)育獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體。目前應(yīng)用較廣泛,最早最經(jīng)典的方法技術(shù)序：準(zhǔn)備假孕母鼠（養(yǎng)母）受精卵的準(zhǔn)備基因?qū)肱咛ヒ浦矊?duì)幼鼠的鑒定ExpressionofExogenousGenes整合率的高低主要取決于受精卵和胚胎發(fā)育的時(shí)間?；虻恼鲜请S機(jī)的，多數(shù)插入單一染色體位點(diǎn)中。外源基因的插入會(huì)引起宿主基因的DNA序列重排，缺失，重復(fù)或易位。外源基因也可不插入呈游離狀態(tài)，以質(zhì)粒形式存在表達(dá)功能并傳給子代。其詳細(xì)機(jī)理現(xiàn)在也不是很清楚。優(yōu)點(diǎn)：外源DNA大小基本不受限制(1-50kb)導(dǎo)入過(guò)程直觀整合率高缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴、環(huán)節(jié)較多

對(duì)操作人員有較高的技術(shù)要求

低效率（尤其是大家畜）

對(duì)卵子傷害大，胚胎存活率低基因整合隨機(jī)性轉(zhuǎn)基因沉默2、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法將攜帶有外源基因的ES細(xì)胞注入到動(dòng)物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在ES細(xì)胞上的基因操作：可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、脂質(zhì)體介導(dǎo)、電穿孔、磷酸鈣共沉淀等方法將外源基因?qū)隕S細(xì)胞。借用ES細(xì)胞系可將人們企望的某種不完整的、無(wú)功能基因直接引入到ES細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞增殖、篩選可得到喪失了某種基因功能的動(dòng)物后代。InjectionofEScellsintoblastocysts優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高?？深A(yù)先在細(xì)胞水平檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便。缺點(diǎn)：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體目前，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動(dòng)物上應(yīng)用較晚。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前后的胚胎（也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)以達(dá)到感染目的),獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。優(yōu)點(diǎn)：受精卵攜帶外源基因的陽(yáng)性率高外源基因多單拷貝整合操作簡(jiǎn)單，避免注射法對(duì)卵子的損害宿主范圍廣可同時(shí)感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高缺點(diǎn)：潛在的致癌性載體構(gòu)建較復(fù)雜容納大小有限整合率不高重組逆轉(zhuǎn)錄病毒不穩(wěn)定，可能干擾外源基因的表達(dá)胚胎的自我保護(hù)機(jī)制對(duì)其有抗性

方式顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒法DNA長(zhǎng)度＜50kb＜10-15kb時(shí)相

單細(xì)胞卵4-6細(xì)胞卵移卵部位輸卵管子宮整合方式隨機(jī)，多拷貝隨機(jī)，單拷貝表達(dá)受宿主旁側(cè)DNA影響受LTR影響易缺失傳代可以有時(shí)不，子代嵌合體機(jī)率高4、體細(xì)胞核移植法

將外源基因?qū)氲襟w細(xì)胞中，再將該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，用這種細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植，克隆轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在理論上應(yīng)該全部為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，而且外源基因的表達(dá)穩(wěn)定，外源基因的整合率可達(dá)100%1997年，英國(guó)克隆羊Dolly1999年,中國(guó)陳大元利用兔的卵母細(xì)胞獲得種間核移植的大熊貓胚胎2000年，美國(guó)轉(zhuǎn)基因牛優(yōu)點(diǎn)：對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行基因改造后，用于核移植可以提高轉(zhuǎn)基因的效率，不僅具有“ES細(xì)胞途徑”的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，且物種適用面廣，無(wú)需經(jīng)過(guò)嵌合體育種就可獲得純合個(gè)體，周期短，效率高。缺點(diǎn)：技術(shù)上難度，成功率極低，胚胎死亡率高，非一般實(shí)驗(yàn)室可以開(kāi)展。5、精子載體法直接以精子為載體的轉(zhuǎn)基因方法。將成熟精子與外源ＤＮＡ共培養(yǎng)，將成熟的精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之后，使精子有能力攜帶外源DNA進(jìn)入卵子中，使之受精，并使外源DNA整合到染色體中。優(yōu)點(diǎn)：注射針口徑大100倍能處理兆及亞兆堿基級(jí)的基因構(gòu)建提高外源基因的整合及表達(dá)水平大型動(dòng)物合子不透明，原核注射差，單精子注射可避免缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定重復(fù)性差6YAC法利用酵母人工染色體(YAC)作為載體制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。YAC載體是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型載體,能克隆百萬(wàn)對(duì)堿基的大片段DNA。優(yōu)點(diǎn)：保證大片段ＤＮＡ的完整性。

保證較長(zhǎng)外源片段在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中的整合率提高

保證了目的基因上下游的側(cè)翼序列的完整性，因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應(yīng)。因此ＹＡＣ介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有廣闊的應(yīng)用前景。除上述幾種常用的轉(zhuǎn)基因方法外，人們?yōu)榱诉m應(yīng)于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。如畸胎瘤細(xì)胞介導(dǎo)法，高效微彈法等，但這些方法都不太成熟，應(yīng)用也較少。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的特性整合拷貝數(shù)1-100左右，多拷貝常以首尾相連接的形式存在整合是隨機(jī)的整合是穩(wěn)定的，可以傳給子代外源基因可以在一種組織或多種組織中表達(dá)少數(shù)外源基因兩側(cè)序列有重排現(xiàn)象基因表達(dá)強(qiáng)弱與拷貝數(shù)無(wú)關(guān)，與“位置效應(yīng)”有關(guān)1、制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率低這是制約這項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。以顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為例，小鼠、大鼠、兔、牛、豬、綿羊轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率分別為26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。2、基因在宿主基因組中的行為難以控制轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合于動(dòng)物的基因組中，很有可能引起宿主細(xì)胞染色體的插入突變，還可造成插入位點(diǎn)的基因片段的丟失及插入位點(diǎn)的基因的位移，同時(shí)也可能激活正常情況下處于關(guān)閉的基因。其結(jié)果導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體出現(xiàn)不育、胚胎死亡、流產(chǎn)、畸形等異常現(xiàn)象。3、轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平低許多轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平受到宿主染色體上整合位點(diǎn)的影響，往往出現(xiàn)異位表達(dá)，影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)能力，從而使大部分轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平較低,極少部分表達(dá)水平過(guò)高。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究出現(xiàn)的問(wèn)題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用

人類(lèi)疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白有2種技術(shù)路線：將目的基因在同源組織中表達(dá)蛋白質(zhì)將目的的基因構(gòu)建成雜合基因，轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎，通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分泌器官收集并提純藥用蛋白1．乳腺生物反應(yīng)器將所需目的基因構(gòu)建入載體，加上適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的乳汁中含有所需藥用蛋白。牛、羊是理想動(dòng)物：對(duì)蛋白進(jìn)行后加工，使之具有較高的生物活性產(chǎn)奶量大，易于大規(guī)模生產(chǎn)從出生到第一次泌乳，豬、羊、牛各需12、14、16個(gè)月只有雌性動(dòng)物泌乳泌乳不連續(xù)，豬、羊、牛一般可持續(xù)2、6、10個(gè)月（1）轉(zhuǎn)基因奶牛轉(zhuǎn)基因奶?？梢猿蔀樯a(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的經(jīng)濟(jì)有效的“工廠”：每只奶牛每年能產(chǎn)1000L以上的牛奶，平均每千克牛奶含35g蛋白質(zhì)（2）轉(zhuǎn)基因羊?qū)d羊、山羊所進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因研究大多集中于利用乳腺作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白。（3）轉(zhuǎn)基因鼠早期的動(dòng)物生物反應(yīng)器研究以小鼠為主乳清酸性蛋白啟動(dòng)子也由小鼠分離得到用轉(zhuǎn)基因小鼠將囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白（CFTR）表達(dá)于其分泌的乳汁中，CFTR對(duì)囊性纖維化疾病具有治療價(jià)值這為以后其他的乳腺反應(yīng)器發(fā)展奠定了基礎(chǔ)小鼠乳汁收集極為困難，該反應(yīng)器目前并無(wú)大的生產(chǎn)價(jià)值（4）轉(zhuǎn)基因家兔家兔作為乳腺生物反應(yīng)器比小鼠更具實(shí)際意義。不但家兔的乳汁較易收集，而且家兔移植妊娠率和產(chǎn)仔率均高于小鼠。3．血液表達(dá)系統(tǒng)在豬的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中，以轉(zhuǎn)化人的血紅蛋白基因最為成功。檢測(cè)表明，它們與天然的人α珠蛋白性質(zhì)完全相同。

4．動(dòng)物反應(yīng)器利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器已生產(chǎn)出許多種藥用蛋白：

抗凝血酶Ⅲ：第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)物。將半乳糖β酪蛋白的啟動(dòng)子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相連，轉(zhuǎn)入綿羊胚胎細(xì)胞，在轉(zhuǎn)基因綿羊的乳液中得到有生物活性的蛋白，產(chǎn)量可達(dá)7g/L。β乳球蛋白紅細(xì)胞生成素（EPO）α1抗胰蛋白酶（AAT）因子IX因子Ⅷ（FⅧ）單克隆抗體C蛋白

動(dòng)物乳腺生產(chǎn)醫(yī)用蛋白實(shí)例基因名稱(chēng)受體動(dòng)物表達(dá)水平(g/L)開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀抗凝血酶(AT-III)山羊6III期臨床抗胰蛋白酶(AAT)綿羊35III期臨床葡萄糖苷酶家兔10III期臨床蛋白C豬1III期臨床tPA(組織型纖溶酶原激活劑)山羊6II期臨床乳轉(zhuǎn)鐵蛋白奶牛3.5II期臨床第八因子(F-VIII)豬3?

5．移植器官利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造異種來(lái)源器官的遺傳性狀，使之能適應(yīng)于人體器官或組織的移植。Xenotransplantation美1997年開(kāi)始重組移植體臨床試驗(yàn)，利用遺傳改良的豬肝作為嚴(yán)重肝臟病患者的離體生命支持物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全問(wèn)題作者:

來(lái)源:香港中通社

發(fā)布者:亦云

類(lèi)別:新聞掃描

日期:2006-04-22

今日/總瀏覽:21/232006年12月26日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉忠華，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因”的克隆豬抑制基因“老”鼠換“童顏”2007年11月29日，美國(guó)斯坦福大學(xué)皮膚學(xué)副教授霍華德.張博士一只轉(zhuǎn)基因老鼠的NF-eB基因被抑制活動(dòng)兩周后，老鼠的衰老皮膚變得宛若新生。12月15日美國(guó)《基因與發(fā)育》。傳統(tǒng)方法：極端，如絕食；把一個(gè)年輕動(dòng)物與一個(gè)年老動(dòng)物的血液循環(huán)系統(tǒng)相連2007年11月23日，美國(guó)俄亥俄州凱斯西儲(chǔ)大學(xué)生物化學(xué)教授理查德·汗森造出轉(zhuǎn)基因“超級(jí)老鼠”可不吃喝跑4小時(shí)轉(zhuǎn)改基因動(dòng)物明星貝茲維爾豬：將人生長(zhǎng)激素基因注入豬，出現(xiàn)了嚴(yán)重的骨骼和關(guān)節(jié)問(wèn)題蜘蛛絲山羊：將蜘蛛絲蛋白基因注入山羊體內(nèi)，從羊奶中提取蛋白質(zhì)抽成絲后堅(jiān)如鋼鐵菠菜豬：有菠菜基因的豬，稱(chēng)這種豬肥肉更少，食用健康改基因牛：把人類(lèi)基因移植到牛身上，以從牛奶中提煉藥用蛋白環(huán)保豬：將一種細(xì)菌基因注入豬體內(nèi)，降低它們糞便的污染2007年10月10日美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院《人類(lèi)分子遺傳學(xué)》，培育出轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型，可以用于研究老年人中常見(jiàn)的眼疾——老年性黃斑變性。黃斑變性是由于視網(wǎng)膜色素上皮和基底膜之間出現(xiàn)沉積物造成的。沉積物從初始形態(tài)開(kāi)始慢慢演變成為細(xì)胞外的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)堆積物，最終會(huì)