安醫(yī)大生殖醫(yī)學課件04胚胎的培養(yǎng)

胚胎的培養(yǎng)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心經(jīng)典圖片

---配子/合子精子圖片人未成熟卵母細胞（GV/MI)兩性配子的比較精子卵子形成時間8-10周12-50年大小(微米)5*25140貢獻僅提供子代細胞核DNA遺傳信息卵子同時提供細胞核和線粒體DNA遺傳信息受影響環(huán)節(jié)干細胞損傷環(huán)節(jié)-環(huán)境影響紡錘絲存在老化-年齡因素精子、卵子的遺傳差異精子的形成過程精子與卵的形成過程受精過程視fertilization.flv頻精子(sperm)與卵子(ovum)結(jié)合形成受精卵(zygote)的過程，稱為受精(fertilization)。受精定義正常受精時間：排卵后24小時內(nèi)。正常受精部位：輸卵管壺腹部。正常受精的前提：卵巢正常排卵輸卵管傘拾卵必須有精子參與精子獲能及發(fā)生頂體反應(yīng)卵子發(fā)生皮層反應(yīng)精、卵﹙兩性﹚原核形成及融合受精卵子受精的過程受精精子獲能spermcapacitation精子頂體表面糖蛋白被女性生殖道分泌物中的α、β淀粉酶降解;頂體膜結(jié)構(gòu)中膽固醇和磷脂比率與膜電位發(fā)生改變;共同作用下使頂體膜穩(wěn)定性降低，具有受精潛能；主要部位是子宮和輸卵管。受精頂體反應(yīng)acrosomereaction獲能的精子與次級卵母細胞放射冠接觸，精子頭部外膜和頂體前膜融合、破裂，釋放頂體酶，溶解放射冠和透明帶，稱為頂體反應(yīng)；精子穿越放射冠和透明帶受精卵子的皮層反應(yīng)一旦精子穿過透明帶與次級卵母細胞質(zhì)膜融合→次級卵母細胞放出第Ⅱ極體完成減數(shù)分裂(Ⅱ)→卵原核;次級卵母細胞膜內(nèi)側(cè)的皮質(zhì)顆粒釋放→溶酶體酶→水解透明帶的ZP3﹙zoneprotein3:透明帶上存在的種族特異性精子受體﹚→透明帶反應(yīng)(變性)→屏蔽其它精子;皮質(zhì)顆粒的膜與卵細胞膜融合→次級卵母細胞及其外側(cè)糖蛋白層結(jié)構(gòu)改變→細胞表面負電↑→制止精子質(zhì)膜與卵膜的融合。皮層反應(yīng)模式圖透明帶精子已獲能并發(fā)生頂體反應(yīng)次級卵母細胞及其皮質(zhì)顆粒精子已穿透透明帶進入卵周間隙精子質(zhì)膜與卵膜融合、皮質(zhì)顆粒釋放第二極體釋出精子頭部進入精子尾部斷裂在卵膜外兩性原核形成透明帶反應(yīng)屏蔽其他精子進入合子形成及個體形成過程精子與卵子結(jié)合過程受精卵受精卵（1天）2-細胞期胚胎4-細胞期胚胎早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)胚胎體外培養(yǎng)

是胚胎操作的一項基礎(chǔ)技術(shù)，在體外受精、胚胎分割、細胞核移植、胚胎運輸、胚胎發(fā)育研究和胚胎轉(zhuǎn)基因操作等一切與胚胎生物技術(shù)有關(guān)的研究或操作中被廣泛應(yīng)用。早期胚胎的代謝特點

不同物種代謝具有差異性，是不同物種胚胎培養(yǎng)基不同的根本大原因。早期胚胎所利用的物質(zhì)隨胚齡增長而改變，胚胎代謝在晚桑葚胚到早囊胚時期發(fā)生改變，從利用丙酮酸到主要利用葡萄糖。發(fā)育阻斷

體外培養(yǎng)條件下，每種動物都有特殊的阻斷時期，即發(fā)育階段特異性阻斷：小鼠，2-細胞；大鼠，2和8細胞；兔，桑葚胚；人，4和8細胞階段等。影響胚胎體外發(fā)育的因素營養(yǎng)因素：葡萄糖、乳酸鹽和丙酮酸鹽、蛋白質(zhì)、氨基酸、肌醇和磷脂酰肌醇環(huán)境條件：培養(yǎng)液體積、滲透壓和離子濃度變化、氧氣含量變化、含氧基對胚胎發(fā)育的影響、維生素、肌醇和磷脂酰肌醇體系、胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/亞硒酸鈉體系及二巰基乙醇胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)

胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)液、溫度、氣相等。不同動物的培養(yǎng)液不同。培養(yǎng)液分為簡單培養(yǎng)液與復(fù)合培養(yǎng)液，復(fù)合培養(yǎng)液中除含簡單培養(yǎng)液的成分外，還含有氨基酸、維生素及微量元素。另處，有些動物的胚胎培養(yǎng)還需要與體細胞如膜細胞、滋養(yǎng)層細胞以及胎兒成纖維細胞等進行共培養(yǎng)（co-culture).胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)液：簡單化學特定培養(yǎng)液／復(fù)合培養(yǎng)液溫度：不同物種溫度不同(37～38.5℃)氣相氧氣：高氧或低氧CO2：5%或6%簡單化學特定培液

簡單化學特定培液是指無機物與有機物，按一定要求配制而成的培養(yǎng)液：TCM199,Earle’sMedium等。復(fù)合培養(yǎng)液（含肽類生長因子培養(yǎng)系統(tǒng)）

在化學特定培養(yǎng)液中添加外源生長因子：胰島素樣生長因子（IGFS）表皮生長因子（EGF）集落刺激因子-1（CSF-1）白血病抑制因子（LIF）轉(zhuǎn)化生長因子-a（TGF-a）

課件:2008/1/30共同培養(yǎng)系統(tǒng)

是將胚胎與其它組織細胞一起培養(yǎng)，組織細胞產(chǎn)生的物質(zhì)供胚胎發(fā)育所需要，克服發(fā)育阻斷：輸卵管上皮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)子宮粘膜上皮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)卵泡顆粒細胞培養(yǎng)系統(tǒng)卵丘細胞培養(yǎng)系統(tǒng)水牛大鼠肝細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

課件:2008/1/30共同培養(yǎng)系統(tǒng)的建立免輸卵管上皮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)卵泡顆粒細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

課件:2008/1/30免輸卵管上皮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)上皮細胞獲?。喝⊥幂斅压?，除去輸卵管表面脂肪，用PBS+10%FBS沖洗2-4遍，剪開輸管并剪成小段。在4℃條件下，用2ml0.02%膠原酶-II消化45min，用TCM199+10%FBS收集輸卵管上皮細胞，離心洗滌三次，獲取上皮細胞。細胞培養(yǎng)：TCM199+10%FBS為培養(yǎng)液，細胞接種到24孔培養(yǎng)板，密度5×105/ml,在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)，24h后細胞開始貼壁增殖，每48h換液一次，培養(yǎng)60h后（貼壁率達80%以上），即可共培養(yǎng)。

課件:2008/1/30卵泡顆粒細胞培養(yǎng)系統(tǒng)卵泡顆粒細胞獲?。河冕橆^從兔卵巢中分離卵泡，再從卵胞腔周圍得到顆粒細胞，然后放入PBS+10%FBS，用離心機離心兩次，每次10min，最后收集顆粒細胞；細胞培養(yǎng)：將沉淀物用TCM199+10%FBS懸浮，用24孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)，細胞密度4×105/ml，培養(yǎng)60h后，開始貼壁，72h達到80%，用于胚胎共培養(yǎng)。

課件:2008/1/30體內(nèi)培養(yǎng)系統(tǒng)兔輸卵管培養(yǎng)系統(tǒng)羊輸卵管培養(yǎng)系統(tǒng)離體小鼠輸卵管培養(yǎng)系統(tǒng)（IMOS）雞胚培養(yǎng)系統(tǒng)

課件:2008/1/30胚胎培養(yǎng)案單胚胎培養(yǎng)每個液滴僅放1枚胚胎進行培養(yǎng)優(yōu)點：便于觀察記錄不足：背離了細胞特性（細胞社會性），操作繁瑣，費力，費財。

課件:2008/1/30胚胎集合培養(yǎng)多個胚胎放入同1個液滴行共同培養(yǎng)優(yōu)點：迎合了細胞自身特性（社會性），促進優(yōu)質(zhì)胚胎的獲取不足：不便于觀察記錄

課件:2008/1