乙肝表面抗原定量測定的方法學(xué)驗證分析

精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)專心---專注---專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗證姓名ZP學(xué)號班級09級醫(yī)學(xué)檢驗本科二班指導(dǎo)老師沈富兵二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量測定的方法學(xué)驗證作者：ZP（成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院09級醫(yī)學(xué)檢驗本科二班，）【摘要】

目的用福州藍(lán)圖生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒對乙肝表面抗原定量測定的方法進(jìn)行驗證，以判斷是否能用于教學(xué)以及臨床分析。方法運(yùn)用ELLISA法定量測定乙肝表面抗原，應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)從濃度為8ng/ml的2倍稀釋的6個濃度梯度，根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線再計算相對回收率和板內(nèi)和板間精密度，通過資料數(shù)據(jù)綜合分析。結(jié)果HBsAg線性較好，其準(zhǔn)確度、精密度、LOD值均在正常范內(nèi)。結(jié)論ELISA法定量檢測HBsAg能較準(zhǔn)確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情況，可以用于教學(xué)以及臨床分析?！娟P(guān)鍵詞】

乙肝表面抗原方法學(xué)驗證標(biāo)準(zhǔn)曲線精密度ELLISA病毒性肝炎中乙型肝炎的危害較大，我國是病毒性乙型肝炎的高發(fā)流行區(qū)，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染率接近60％，約占世界HBV攜帶者的1/3。乙型肝炎病毒的病原體不僅具有傳染性，還可能導(dǎo)致發(fā)展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、準(zhǔn)確、定量檢測對乙型肝炎臨床診斷、療效觀察及預(yù)防具有重要的意義。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗體最常用的檢測技術(shù)，其方法簡便、價廉，適合一般實驗室推廣，其中酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)目前應(yīng)用最為廣泛，它常用聚苯乙烯為固相載體，使其與待測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，然后加酶標(biāo)記的抗原或抗體，再加底物顯色，最后根據(jù)色澤深淺來推算待測抗原或抗體的含量。此方法特異性高，有效測定范圍可達(dá)到20500ng/ml，且酶免疫法有標(biāo)記的試劑比較穩(wěn)定并且無放射線危害等優(yōu)點(diǎn)。我們采用對已知抗體濃度的樣品進(jìn)行ELISA的定量檢測，通過對其數(shù)據(jù)的分析來驗證ELISA法最乙肝表面抗原定量檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，以衡量其實用性。1材料與方法1.1材料1.1.1試劑盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，福州藍(lán)圖生物工程有限公司出品。1.1.2儀器及酶標(biāo)板酶標(biāo)儀：Bio-Rad680；洗板機(jī)：Bio-Rad1575；超純水系統(tǒng)：MilliporeElix；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052):上海精宏實驗設(shè)備有限公司。1.1.3溶液配制=1\*GB2⑴0.01MpH7.4的PBS緩沖液：稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。=2\*GB2⑵質(zhì)控品：用PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品配制成6、3、1.5ng/ml三個質(zhì)控品，每質(zhì)控品1ml。首先取450μl的8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品到C1號EP管中再向其中加入150μl的PBS緩沖液，即配制成了6ng/ml的質(zhì)控品，再取300μlC1號EP管內(nèi)的溶液到C2號EP管內(nèi)，再向C2號管內(nèi)加入300μl的緩沖液混勻。即配制成了3ng/ml的質(zhì)控品。接著取300μlC2號管內(nèi)的液體到C3號EP管內(nèi)，再加入300μl的緩沖液混勻，即配制成了1.5ng/ml的質(zhì)控品。具體方法如下圖1C23C23ng/mlC1C16ng/mlC31.5ng/ml圖11.2檢測方法1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度的配制=1\*GB2⑴用PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。=2\*GB2⑵先取6個EP管分別標(biāo)記為對應(yīng)的濃度。=3\*GB2⑶取400μl標(biāo)準(zhǔn)品于標(biāo)記為的EP管中，再取200μl號管內(nèi)液體于號管內(nèi)再向號管中加入200μl的緩沖液混勻，即配制成了濃度為4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。=4\*GB2⑷再從號管內(nèi)取200μl的液體到號管內(nèi)，接著取200μl的緩沖液到號管內(nèi)混勻，即配制成了2ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。=5\*GB2⑸從號管內(nèi)取200μl的標(biāo)準(zhǔn)品到④號管內(nèi)，再向④號管內(nèi)加入200μl的緩沖液混勻，即配制成了1ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。=6\*GB2⑹用同樣的方法，配制好濃度分別為0.5ng/ml、0.25ng/ml.的標(biāo)準(zhǔn)品體積分別為200μl、200μl、400μl備用。具體方法如下圖2S60.25ng/mlS50.5ng/mlSS60.25ng/mlS50.5ng/mlS41ng/mlS32ng/mlS24ng/mlS18ng/ml圖21.2.2測定方法=1\*GB2⑴取出試劑盒中已包被酶標(biāo)板，取出板條，在相應(yīng)孔中加入已配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及空白對照；88631.5EQ\o\ac(○,-)44631.5EQ\o\ac(○,-)22631.5EQ\o\ac(○,-)11631.5EQ\o\ac(○,-)0.50.5631.5EQ\o\ac(○,-)0.250.25EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)EQ\o\ac(○,-)圖3注：雙線框區(qū)域為標(biāo)準(zhǔn)品,濃度依次為8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三線框區(qū)域為質(zhì)控品，濃度依次為6、3、1.5ng/ml，粗框區(qū)域為空白對照加入的是PBS緩沖液，每個孔內(nèi)加入的均是50μl。=2\*GB2⑵37℃溫育30min，洗板4次；=3\*GB2⑶加入酶標(biāo)抗體，生物素二抗，50μl/孔；=4\*GB2⑷37℃溫育30min，洗板4次；=5\*GB2⑸加入A、B液，50μl/孔，37℃溫育15分鐘；=6\*GB2⑹加入終止液，50μl/孔。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及結(jié)果計算=1\*GB2⑴酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，蓋上蓋子；=2\*GB2⑵在電腦上打開MicroplateManager5.2軟件；=3\*GB2⑶選擇450nm波長（參照波長630nm），設(shè)置LAYOUT和報告模式，測定各孔吸收值；=4\*GB2⑷輸入標(biāo)準(zhǔn)品各濃度值，以雙對數(shù)法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取各孔的濃度值，打印標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和計算結(jié)果。1.4統(tǒng)計學(xué)方法用MicrosoftExcel處理實驗數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1測得的OD值如下表1.73901.63801.08500.69200.33800.01500.88400.88801.21700.67400.35300.00900.53600.50901.21800.65600.33800.01000.27200.26001.23300.67400.34700.00900.14900.13801.24800.69600.34300.01200.06200.07100.00900.01200.00200.00900.00900.01100.00900.01100.0100圖4注：圖4與圖3相對應(yīng)2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5由上圖可得出如下結(jié)論：標(biāo)準(zhǔn)曲線以濃度為橫坐標(biāo)，以測得的OD值為縱坐標(biāo)。由對應(yīng)濃度和OD值得出的散點(diǎn)連成一條直線后，散點(diǎn)基本都在直線上，說明散點(diǎn)的線性非常好。在以后檢測乙肝表面抗原濃度的時候可以根據(jù)測出的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)的濃度。2.3準(zhǔn)確度（回收率）計算各質(zhì)控品高中低三個濃度平均回收率分別為92.59%、100.887%、93.68%都在正常范圍內(nèi)如表1所示。ELISA法檢測VEGFR2-Fc的回收率準(zhǔn)確度（回收率）計算VEGFR2-Fc(ng/ml)測定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率RR(%)SD(%)64.99883.392.595.3065.63793.9565.64294.03365.71595.2565.78796.4533.093103.1100.8872.6033.005100.16732.91897.26733.005100.16733.112103.7331.51.37791.893.682.071.51.45096.6671.51.37791.81.51.42194.7331.51.40193.4表12.4精密度計算2.4.1板內(nèi)精密度板內(nèi)精密度質(zhì)控品各濃度組的RSD都小于15%，精密度良好，如表2所示。板內(nèi)精密度VEGFR2-Fc（ng/ml）測定值1測定值2測定值3測定值4測定值5RSD(%)64.9985.6375.6425.7155.7875.694±0.3185.58533.0933.0052.9183.0053.1123.027±0.0782.5771.51.3771.4501.3771.4211.4011.405±0.0312.210表22.4.2板間精密度板間各組濃度質(zhì)控品RSD都小于15%，說明板間精密度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。如表3所示。板間精密度VEGFR2-Fc（ng/ml）測定值測定值測定值測定值測定值RSD(%)64.9985.6375.6425.7155.7875.694±0.3185.58565.4715.4235.6745.3235.7465.5274±0.1773.20265.7735.6745.7825.5475.6675.689±0.0961.68733.0933.0052.9183.0053.1123.027±0.0782.57732.8153.3353.1873.2212.9333.098±0.2166.97232.8863.3443.1183.2342.9973.116±0.1825.8411.51.3771.4501.3771.4211.4011.405±0.0312.2101.51.2261.2571.2271.5641.3341.322±0.14210.7411.51.6651.2431.2361.5411.3201.401±0.19213.704表32.5檢測限（LOD）計算：取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差?？瞻卓椎腛D值的均數(shù)=0.0098空白孔的OD值的標(biāo)準(zhǔn)差=0.0028LOD=0.0098+2*0.0028=0.01543討論通過圖4、圖5和表1、表2、表3可知本次實驗的準(zhǔn)確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值都復(fù)合實際，且各數(shù)據(jù)都趨于理想，對此我們做出分析：HBsAg是乙肝病毒感染后最早出現(xiàn)的血清標(biāo)志物之一，因此HBsAg的檢測是診斷肝炎病毒感染的重要依據(jù)。而針對這項檢測的檢測方法的靈敏度與高特異性的高低以及二者的結(jié)合程度是影響檢驗結(jié)果的重要因素，直接關(guān)系到臨床診斷和用藥，所以對HBsAg的檢測方法的建立和方法的驗證是實驗成敗的關(guān)鍵所在。本實驗以HBsAg測定為例，為了對乙肝表面抗原ELISA法定量進(jìn)行分析的方法學(xué)建立與驗證，以確認(rèn)ELISA法定量檢測HBsAg能否較準(zhǔn)確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情況。按試劑說明書嚴(yán)格操作的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實驗用的試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。本實驗嚴(yán)格按試劑說明書操作的同時運(yùn)用計算機(jī)軟件和酶標(biāo)儀，測得了OD值且繪制出了標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實驗采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），通過倍比稀釋來完成其定量檢測。其中，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度依次為：8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，每個濃度設(shè)置兩個孔，共十二個孔；質(zhì)控品的濃度依次為:6、3、1.5ng/ml，每個濃度設(shè)置五個孔，共十五個孔。往標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，而陰性對照加入等量PBS,經(jīng)過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算質(zhì)控品的準(zhǔn)確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值。本實驗是設(shè)計精密，操作簡便、快捷。主要是通過對質(zhì)控品的準(zhǔn)確度、板內(nèi)精密度、板間精密度、LOD值的計算和根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確認(rèn)ELISA法定量檢測HBsAg能否較準(zhǔn)確、快速地反映體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制情況。如圖5所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9985，接近于1，即相關(guān)性良好。方法準(zhǔn)確度(accuracy)，一般用相對回收率表示，表明用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度，由表1可得出相對回收率符合參考值85%～115%，所以該測定方法比較準(zhǔn)確。方法精密度(precision)，一般用RSD表示，對于ng／ml級水平的RSD一般應(yīng)≤15％。由表2板內(nèi)精密度和表3板間精密度可知，板內(nèi)精密度完全符合要求，板間精密度基本符