DB37-T 4415-2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鑒定及牛奶中β-乳球蛋白的檢測技術(shù)

ICS67.050CCSX04ICS67.050CCSX04山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T4415—2021β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鑒定及牛奶中β-乳球蛋白的檢測技術(shù)Detectionofβ-lactoglobulingeneknockoutcowandβ-lactoglobulinincow'smilkDetectionofβ-lactoglobulingeneknockoutcowandβ-lactoglobulinincow'smilk2021101820211118山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鑒定及牛奶中β-乳球蛋白的檢測技術(shù)范圍本文件確立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定方法，以及牛奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印跡（Western-Blot）和定量酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測方法。本文件適用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的檢測。（GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測GB/T27642—2011牛個體及親子鑒定微衛(wèi)星DNA法NY/T1663—2008乳與乳制品中β-乳球蛋白的測定聚丙烯酰胺凝膠電泳法NY/T1672—2008綿羊多胎主效基因FecB分子檢測技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T2695—2015牛遺傳缺陷基因檢測技術(shù)規(guī)程SN/T2497.16—2010進(jìn)出口危險化學(xué)品安全試驗方法第16部分：Western-Blot實驗農(nóng)業(yè)部2031號公告-14-2013轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品成分檢測普通牛(Bostaurus)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1牛β-乳球蛋白基因Bostaurusβ-lactoglobulinBLGBLG（NCBIReferencesequence:NC_037338.1）PAEP（Bostaurus），編碼β-乳球蛋白的基因。注：基因全長4900bp，由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，編碼252個氨基酸。3.2β-乳球蛋白基因敲除奶牛β-lactoglobulinknockoutcow利用基因編輯技術(shù)敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。（PCR）原理通過設(shè)計特異引物，擴(kuò)增出包含牛BLG基因全長的DNA片段，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。依據(jù)BLG基因編碼序列是否發(fā)生突變，并提前引入終止密碼子，造成蛋白質(zhì)編碼異常，判斷是否敲除BLG基因。除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。4.2.1水：GB/T668250×TETri-base2422g571mL.5ol/LEDT(pH80)10m，1000mL1×TAE。11g1×TAE100mLBLG——上游引物：5′-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3′；——下游引物：5′-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3′；6728bp2031-14-2013。10μmol/LPCR4℃～992096×0.2mL12000r/min24×2。4.3.30.001g～100g0.001g0V～600V0mA～100mA4.3.7樣品3mL～5mL4.3.7樣品3mL～5mLACD，-20）0.1g～0.3g752020～3075-200.2mL～0.5mL1～2DNA基因組DNA提取按照GB/T27642—2011附錄B規(guī)定執(zhí)行。DNADNA濃度和純度檢測按照NY/T1672—2008中7.3的規(guī)定執(zhí)行。PCRPCRPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序按照農(nóng)業(yè)部2031號公告-14-2013。PCR4.5.3.1.2.1PCRTaqDNA0.5PCRbuffer25Mixture(2.58μL(10μM)1.0μLDNA200ng～1μg50μL4.5.31.22PCR94℃1i94℃30s52℃30s72℃6i357210m，4.5.3.2對照PCR擴(kuò)增16bpBLGDNA（B）除DNA模板外，對照PCR擴(kuò)增條件與4.5.3.1.2相同。PCR按照NY/T2695—2015中6.4.2的規(guī)定執(zhí)行。將檢測合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行全長測序分析。PCRBLGPCRPCR擴(kuò)增的β-乳球蛋白基因片段參考序列（野生型）見附錄A。對測序結(jié)果和參考序列進(jìn)行比對，判定樣品是否發(fā)生基因敲除。BLGBLG（Western-Blot）原理對預(yù)處理的牛奶樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，使用牛β-乳球蛋白特異性第一抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行檢測，根據(jù)條帶位置和著色深度判定樣品中是否含有β-乳球蛋白。除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.2.1水：GB/T6682牛β（10mg/mL）0.1gβ10mL10SDS10gSDS80mL100mL3029g1g60mL100mL1.5MTris-HCl(pH8.8181.65gTris800mLpH8.81000mL1MTris-HCl(pH=6.8)121.1gTris800mLpH6.8，定容1000mL1010g80mL100mL5.2.815SDS分離膠（5mL）：1.1mL蒸餾水，2.5mL30%丙烯酰胺溶液，1.3mL1.5Tris-HCl(pH8.8)，0.05mL10SDS，0.05mL100.002mLTEMED5.2.95SDS濃縮膠（2mL）：1.4mL蒸餾水，0.33mL300.25mL1.0Tris-HCl(pH6.8)，0.02mL10SDS，0.02mL100.002mLTEMED10×（500mL）：15.1gTris，75g500mL10×TBS（1L）：88g12.1gTris1LpH5.2.121×TBST（1L）：100mL10×TBS899mL1mL20BCAECL12000r/min24×2。5.3.20.001g～100g0.001g5.3.345℃～1350.255Mpa0V～600V0mA～1000V～600V0mA～100mA樣品50mL，離心12000g，5min-805g50mL5.4.1使用BCA試劑盒測定樣品中的蛋白濃度。30μg（β1μgβ5×SDS，10010min（SDS）采用NY/T1663—2008中的方法進(jìn)行SDS凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜按照SN/T2497.16—2010中轉(zhuǎn)膜方法執(zhí)行。封閉將PVDF2h或4β-PVDF2洗膜用TBST10min/次，3～5PVDF1洗膜用TBST10min/次，3～5顯影將ECLABmin～2β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品檢測到預(yù)期大?。?8kD）的條帶，空白和陰性對照無特異性條帶，則表明Western-Blot檢測方法正常；否則，需重新檢測。SDSβ-Western-Blot18kDββ-“β-乳球18kDβ-β（ELISA）原理ββ-450nmββ除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。6.2.1水：GB/T66829696（812。100β1001001001×PBS1.44g0.4g8g氯化鈉和02g氯化鉀溶于800pH7.411BSAPBS1gBSA100mLPBS0.0520PBS50μL20100mLPBS（TMB）2M：10mL9860mL100mLβ-10μg/mL，2.5μg/mL，1.25μμg/mLβ（0μg/mL）12000r/min24×2。6.3.20.001g～100g0.001g45℃～1350.255Mpa5～80450nm樣品按照5.4.1和5.4.21000β）（20℃～25。（μL50μL，3730min200μL2min2100μL3730min6.5.4590μLTMB3720min50μL450nmXβ-β-乳 X=C×式中：X——樣品中β-乳球蛋白含量，單位為μg/mL；Cβ-μg/mL；N1000ELISA0.13μg/mL按照GB/T27403和GB/T19495.2規(guī)定執(zhí)行。按照GB/T19495.2規(guī)定執(zhí)行。附錄A（資料性）PCR擴(kuò)增的野生型牛β-乳球蛋白基因序列g(shù)cctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAGAGGGAGAACGGTGAGTGTGCTCAGAAGAAGATCATTGCAGAAAAAACCAAGATCCCTGCGGTGTTCAAGATCGATGGTGAGTGCTGGGCTGGAACTCACTTTCCTCCCGTCTTGATCTCTTCCAGCCTTGAATGAGAACAAAGTCCTTGTGCTGGACACCGACTACAAAAAGTACCTGCTCTTCTGCATGGAGAACAGTGCTGAGCCCGAGCAAAGCCTGGCCTGCCAGTGCCTGGGTGGGTGCCAACCCTGGCTGCCCAGGGAGTTGACCCCGTCCCGGCCCCACAGTCAGGACCCCGGAGGTGGACGACGAGGCCCTGGAGAAATTCGACAAAGCCCTCAAGGCCCTGCCCATGCACATCCGGCTGTCCTTCAACCCAACCCAGCTGGAGGGTGAGCACCCAGGCCCCACCCTGCTCCTGGGGCAGGAAGCCACCCGGAGTGCCACATCTAGGTGAGCCCCTGCCGGCGCCTCTGGGGTAAGCTGCCTGCCCTGCCCCACGTCCTGGGCACACACATGGGGTAGGGtttcctggatgatgggccgggggtggagaaggcccgggacagggtggggagtggtctggctcagaggatgatggtagggctgggatccagggcgtctgcattacagtcttgtgacatctgggggcccacacacatctacggctctttgaaact注：下劃線部分為引物序列位置；大寫字母部分為β-乳球蛋白基因序列；大寫加粗斜體ATG為起始密碼子，TAG為終止密碼子；大寫加粗字體為編碼序列。附錄B（資料性）PCR擴(kuò)增的16bp缺失牛β-乳球蛋白基因序列g(shù)cctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAG