血庫的技術(shù)操作規(guī)程

血庫的技術(shù)操作規(guī)程目的：建立血庫各項操作的技術(shù)規(guī)范，確保輸血安全和血型血清學(xué)疾病的準(zhǔn)確診斷。依據(jù)：全國臨床檢驗操作規(guī)程（第二版）、臨床輸血枝術(shù)規(guī)范范圍：血庫工作職責(zé)：血庫工作人員5．1ABO血型定型：5．1．1原理:常規(guī)的ABO定型,必須用已知型特異性的試劑檢查紅細(xì)胞的抗原(forwardtyping,正向定型、紅細(xì)胞定型)，以及用已知的試劑紅細(xì)胞檢查血清中的抗體。5．1．2試劑和材料:5．1．2．1抗A、抗B分型血清試劑，效價分別不低于64和128。5．1．2．13%-5%A、B、O型紅細(xì)胞鹽水懸液。5．1．2．13%-5%受檢者紅細(xì)胞懸液和受檢者血清5．1．3方法:（試管法）：5．1．3．1正定型:取試管2支，分別標(biāo)上A、B字樣，向A管滴加A定型試劑2滴，向B管滴加B定型試劑2滴。向A、B管各滴加待檢血樣的2%紅細(xì)胞懸液各1滴，搖勻3000r/min離心15秒，按照有無凝集判定結(jié)果。血型抗A抗BA+-B-+O--AB++5．1．3．2反定型：?。持г嚬芊謩e標(biāo)上ＡC、ＢC、ＯC,各加受檢者血清2滴于管底,分別滴加A、B、O型試劑紅細(xì)胞懸液1滴混勻，以3000r/min離心15秒，按照有無凝集判定結(jié)果：血型A紅細(xì)胞B紅細(xì)胞O紅細(xì)胞A-+-B+--O++-AB---以上，以正、反定型相一致來判定病人血型，若正、反定型不一致，要進一步作血型鑒定。5．1．4附注:正、反定型不一致的原因，有技術(shù)問題或血清本身問題，常見者有以下數(shù)種：5．1．4．1分型血清試劑效價太低親和力不強。5．1．4．2紅細(xì)胞懸液過濃或過淡，抗原抗體比例不適當(dāng)，使反應(yīng)不明顯誤判為陰性反應(yīng)。5．1．4．3受檢者紅細(xì)胞抗原位點過少（如亞型）或抗原性減弱（見于白血病或惡性腫瘤）以及類B或cisAB.5．1．4．4受檢者血清蛋白紊亂(高球蛋白血病)或?qū)嶒灂r溫度過高,常引起細(xì)胞呈緡錢狀排列.5．1．4．5受檢者血清缺乏應(yīng)有的抗A或抗B抗體,如丙種球蛋白缺乏癥.5．1．4．6各種原因引起的紅細(xì)胞溶解,誤判為不凝集,部分溶血時,可溶性血型物質(zhì)中和了相應(yīng)的抗體.5．1．4．7由細(xì)菌污染或遺傳因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因.5．1．4．8血清中有意外抗體,如自身抗I,常干擾定型.5．1．4．9老年人血清中抗體水平大幅度下降.5．1．4．10如發(fā)現(xiàn)ABO正反定型不一致,首先要重復(fù)做試驗一次.嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程,使用質(zhì)量合格的試劑以及細(xì)心觀察和解釋試驗結(jié)果,就可以解決問題.對于一些疑難問題必須進一步研究.5．1．5臨床意義：輸血原則為同型相輸，ABO血型的確定是輸血前的第一步檢測。母嬰ABO血型不合引起的新生兒溶血病器官移植，供、受體必須ABO血型相符。5．2Rh血型定型5．2．1原理:Rh血型系統(tǒng),主要有五種抗血清,即抗D、抗C、抗E、抗c、抗e。在臨床輸血中,一般只做D抗原的鑒定,凡被檢紅細(xì)胞和抗D血清凝集者為Rh陽性，不凝集者為Rh陰性。5．2．2試劑和材料：5．2．2．1IgM/IgG抗D血清5．2．2．23%-5%病人紅細(xì)胞懸液5．2．2．3已知Rh陽性和Rh陰性5%紅細(xì)胞懸液各1份，作陰陽對照5．2．3方法：試管直接離心法：5．2．3．1加IgM/IgG抗D血清1滴，加3%-5%病人紅細(xì)胞懸液1滴，混勻靜置1分鐘，3000轉(zhuǎn)/分，離心1分鐘。并作好陰、陽性對照。5．2．3．2結(jié)果判斷：凝集者為Rh（D）陽性；陰性者，要作進一步的檢查，防止DU型誤判為Rh陰性。5．2．4附注:5．2．4．1Rh定型時應(yīng)按抗D血清試劑的使用說明書進行,并注意必須要有嚴(yán)格的對照試驗,包括抗原的陰、陽性對照以及試劑對照試驗。5．2．4．2對于Rh陰性標(biāo)本,除了做好DU型鑒定外,還應(yīng)做直接抗人球蛋白試驗來分析,防止因為抗體占滿紅細(xì)胞抗原位點,導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn).5．2．4．3對于Rh陰性急救病人,在庫存沒有相應(yīng)Rh陰性紅細(xì)胞,可以在交叉配血相合的前提下,與臨床科室溝通,輸Rh陽性紅細(xì)胞.但在配(發(fā))血報告單上要特別說明.5．2．4．4假陽性反應(yīng)原因分析:受檢細(xì)胞已被免疫球蛋白致敏,或標(biāo)本血清中有引起紅細(xì)胞凝集的因子.受檢細(xì)胞與抗血清孵育的時間過長,含高蛋白的定型試劑會引起緡錢狀形成.標(biāo)本抗凝不當(dāng),受檢過程中出現(xiàn)凝血或小的纖維蛋白凝塊,誤判為陽性.定型血清中含有事先未檢測的其它特異性抗體,造成假陽性定型結(jié)果.多凝集細(xì)胞造成定型的假陽性.檢定用的器材或抗血清被污染,造成假陽性.可能出現(xiàn)假陰性的原因:受檢細(xì)胞懸液濃度太高,與抗血清比例失調(diào).漏加或錯加定型血清.定型血清的使用方法錯誤,沒按說明書進行.離心后重懸細(xì)胞扣時,搖動用力過度,搖散微弱的凝集.抗血清保存不當(dāng),導(dǎo)致失效.5．3交叉配血的要求和內(nèi)容：5．3．1交叉配血試驗也稱配合試驗，實際上是檢查不配合性，使患者、獻血者血液間沒有可測到的不相配合的抗原、抗體成分。交叉配血試驗通常包括：受血者血清對供血者紅細(xì)胞一般稱“主側(cè)”配血，因為它是檢測對供者紅細(xì)胞起發(fā)應(yīng)的抗體。受血者紅細(xì)胞對供血者血清一般稱“次側(cè)”配血，因為它是檢測對受血者紅細(xì)胞起反應(yīng)的抗體。受血者紅細(xì)胞對受血者血清目的是顯示自身抗體、直接抗球蛋白試驗陽性及紅細(xì)胞緡錢狀假陽性的存在，是自身對照。5．3．2交叉配血應(yīng)在37oC孵育，除了鹽水介質(zhì)、至少還要有抗球蛋白試驗，有條件的還可增加白蛋白介質(zhì)法、低離子強度介質(zhì)法（LISS）、酶法等方法。5．3．3在交叉配血的任何步驟均不產(chǎn)生溶血或凝集的結(jié)果，供者的血液成份才可給患者輸注。5．3．4一些特殊問題，交叉配血試驗中，可能出現(xiàn)的一些問題列舉如下：5．3．4．1緡錢狀的形成血清在室溫和37oC中，使紅細(xì)胞出現(xiàn)了假凝集，造成配血錯誤，常見于多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、霍奇金病，以及其它表現(xiàn)為血沉加速的一些病例中。5．3．4．2交叉配血試驗結(jié)果不相容，顯示有未檢明的同種抗體的存在。在室溫反應(yīng)中，顯示有自身抗體。在抗球蛋白試驗中顯示有自身抗體。5．3．4．3存在抗體篩選試驗陰性和交叉配血結(jié)果陽性的現(xiàn)象，提示可能有未檢明的抗體存在。5．3．4．4交叉配血試驗中，離心力不當(dāng)，造成了假陽性和假陰性。5．3．4．5水浴箱溫度不正確，造成錯誤的結(jié)果。5．3．4．6蒸餾水中某些離子可造成不正確的結(jié)果.5．3．4．7紅細(xì)胞不正確的洗滌和懸浮,使抗球蛋白試驗出現(xiàn)假陰性。5．3．4．8血清中含有溶血性抗體,則相應(yīng)紅細(xì)胞被溶解而不是凝集,交叉配血結(jié)果應(yīng)為陽性。如果血清中存在補體而溶血，血清應(yīng)滅活后再作試驗。5．3．5臨床意義：檢測受、供血者之間的相容性，預(yù)防輸血性溶血的發(fā)生，確保輸血的安全。5．4鹽水介質(zhì)配血法（試管法）(本法現(xiàn)不作本院常規(guī)工作方法，僅必要時采用)5．4．1方法5．4．1．1抽取受血者靜脈血3-4ml，待凝固后分離血清，并將紅細(xì)胞配成3%鹽水懸液。5．4．1．2將獻血者（或供血者）血樣以同樣方法分離血清，并配成3%紅細(xì)胞懸液。5．4．1．3取潔凈小試管（10×60MM）兩支，1支標(biāo)明受血者血清（PS）+獻血者（或供血者）細(xì)胞（DC）為主側(cè)管，另1支標(biāo)明獻血者（或供血者）血清（DS）+受血者細(xì)胞（PC）為次側(cè)管。5．4．1．4按標(biāo)記主側(cè)管放受血者血清2滴，加獻血者（或供血者）紅細(xì)胞懸液1滴。次側(cè)管放獻血者（或供血者）血清2滴，加受血者紅細(xì)胞懸液1滴?；靹颍?20g/分離心1分鐘，或1300g/分，離心15秒。輕輕搖動試管，觀察結(jié)果。冬季室溫較低，應(yīng)將試管保溫，以防冷凝集素引起的凝集反應(yīng)。5．4．2結(jié)果判斷ABO同型配血，主側(cè)和次側(cè)均無溶血及凝集表示無輸血禁忌，可以輸血。5．4．3附注5．4．3．1鹽水介質(zhì)配血法也可用玻片法進行操作。5．4．3．2如鹽水介質(zhì)配血結(jié)果陰性，可將原標(biāo)本做酶法或抗球蛋白法配血。5．5抗球蛋白配血法(本法現(xiàn)不作本院常規(guī)工作方法，僅必要時采用)5．5．1方法5．5．1．1取試管2支,分別標(biāo)明主側(cè)和次側(cè),主側(cè)管加受血者血清2滴和獻血者(或供血者)3%紅細(xì)胞懸液1滴,次側(cè)管加獻血者(或供血者)血清2滴和受血者3%紅細(xì)胞懸液1滴.5．5．1．2混合置37oC水浴致敏30分鐘,取出后用鹽水洗滌3次,傾去上清液.5．5．1．3加最適稀釋度抗人球蛋白血清1滴,120g/分，離心1分鐘，或1300g/分，離心15秒,觀察結(jié)果。5．5．1．4陽性對照：3%不完全抗D致敏的Rh陽性紅細(xì)胞懸液1滴，加抗球蛋白血清1滴。陰性對照：3%正常AB血清致敏Rh陽性紅細(xì)胞懸液1滴，加抗球蛋白血清1滴。鹽水對照：獻血者（或供血者）3%紅細(xì)胞鹽水懸液1滴，加等滲鹽水1滴，另1管受血者3%紅細(xì)胞鹽水懸液1滴加等滲鹽水1滴。5．5．2結(jié)果判定如陽性對照管凝集，陰性對照管鹽水不凝集，主側(cè)、次側(cè)配血管都不凝集，表示無輸血禁忌。5．6改良凝聚胺法（試劑采用：中山生科，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號：YZB/國1262-2003，產(chǎn)品注冊號：國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）2003第3400180）（本法為常規(guī)工作采用）5．6．1試驗原理:紅細(xì)胞血型抗原及相應(yīng)的抗體經(jīng)低離子介質(zhì)(L.I.M)快速孵育致敏后,加入由凝聚胺(polybrene)等帶正電荷的大分子聚合物,以減弱紅細(xì)胞靜電斥力,縮短紅細(xì)胞間距,加速分子運動,幫助紅細(xì)胞血型抗原與相應(yīng)的抗體緊密搭橋,再利用機械離心力作用,呈現(xiàn)出肉眼可見的凝集狀,這種凝集反應(yīng)中存在的非特異性免疫凝集因素,可以被附加的假凝集清除液清除,而特異性的免疫凝集對附加的假凝集清除液不敏感,能維持較長時間的凝集狀,由此可特異地檢出相應(yīng)的血型抗原或抗體(IgG或IgM).5．6．2實驗過程：主（次）側(cè)管加入受（供）血者血清2滴，加供（受）血者3%-4%紅細(xì)胞鹽水懸液1滴。各管加低離子介質(zhì)0.8ml,混勻，靜置1min,加凝聚胺2滴，混勻，以3500r/min離心15s,倒出上清液（殘留約0.1ml）,扣搖，肉眼可見明顯的凝集狀（如無凝集須重做），再加1滴假凝集清除液于管底，輕搖，凝集1min內(nèi)消失呈均勻混懸液，再將反應(yīng)物倒于玻片上借助顯微鏡觀察，鏡下無凝集紅細(xì)胞為陰性，1min內(nèi)凝集不能被消除，為陽性。5．6．3結(jié)論：陽性表示受（供）血者血清中含供（受）血者紅細(xì)胞血型抗原相應(yīng)的抗體(IgG或IgM)，供受者不相容，陰性表示供受者相容。5．6．4注意事項：5．6．4．1操作者須嚴(yán)格按照操作說明書進行試驗，紅細(xì)胞濃度、血清滴量、反應(yīng)時間、離心速度等均可影響試驗結(jié)果。5．6．4．2檢測標(biāo)本如為非抗凝血，標(biāo)本含抗凝成分的含量過高明顯干擾凝集反應(yīng)時，可適當(dāng)調(diào)加凝集胺的滴量，以中和抗凝成分的干擾。5．6．4．3試驗溫度以20-37oC為宜,若疑為冷凝集,37oC水浴1分鐘,在此溫度下觀察,凝集消失,說明存在冷凝集.5．6．4．4試劑檢驗:取自身血清與自身紅細(xì)胞用本試驗方法作陰性對照試驗;取IgG抗D血清與抗D陽性的紅細(xì)胞用本試驗方法作陽性對照,對照試驗結(jié)果符合,試劑有效。5．6．4．5疑難結(jié)果以抗人球蛋白試驗(AGT)作終判試驗.5．7ABO-HDN血型血清學(xué)檢查5．7．1原理：新生兒溶血病是由母嬰血型不合引起,可見于ABO、Rh及MN等血型系統(tǒng)。胎兒和新生兒紅細(xì)胞被來自母親的IgG抗體所包被，并在嬰兒的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)受到免疫性破壞。病情的嚴(yán)重程度不同，重者在宮內(nèi)死亡，輕者臨床上僅由血清學(xué)試驗檢測才能發(fā)現(xiàn)。5．7．2嬰兒及其父母ABO血型鑒定：此鑒定是檢查新生兒溶血病的第一步，以便考慮以后進一步檢查的程序。5．7．3患兒血樣檢查：診斷ABOHDN的最有力證據(jù)是證實患兒紅細(xì)胞被來自母親的IgG抗A（B）所致敏。5．7．4直接抗人球蛋白試驗5．7．4．1取患兒紅細(xì)胞配成5%懸液。以IgG抗D血清致敏O型紅細(xì)胞（37oC、1小時）配成5%懸液作為陽性對照。5．7．4．2取玻璃試管三支，其中兩支加5%患兒紅細(xì)胞懸液各50ul，另一支加陽性對照紅細(xì)胞懸液50ul，以生理鹽水洗滌三次。5．7．4．3一支患兒紅細(xì)胞與陽性對照管加抗人球蛋白各2滴，另一支患兒紅細(xì)胞加生理鹽水100ul作自身陰性對照，3000轉(zhuǎn)/分離心15秒（兩次）。5．7．4．4輕輕搖散，在低倍鏡下觀察有3-5個紅細(xì)胞聚集可判陽性（可使紅細(xì)胞呈流動狀態(tài)下觀察，可見聚集的紅細(xì)胞團不分散，一塊流動）。5．7．5患兒紅細(xì)胞抗體釋放試驗（熱放散法）5．7．5．1患兒紅細(xì)胞用鹽水洗滌3次，取壓積紅細(xì)胞1ml左右，加等量或半量鹽水，置試管中。5．7．5．2將試管放在56oC水浴中不斷振搖10分鐘,取出后置預(yù)先準(zhǔn)備盛有56oC熱水的離心套管內(nèi),立即3000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘。吸取上層液（即放散液）備用。5．7．5．3將放散液分為3份，加入3個小試管中，分別加入3%的A、B、O型酶處理紅細(xì)胞懸液1滴，37oC致敏，60分鐘。5．7．5．4取出后用鹽水洗3次，加入抗IgG（或廣譜）最適稀釋度抗人球蛋白血清2滴，3000轉(zhuǎn)/分，離心15秒2次。肉眼觀察結(jié)果。按圖1分析結(jié)果。（圖1）患兒紅細(xì)胞抗體釋放試驗意義指示紅細(xì)胞ABO 意義+--放散出IgG抗A-+-放散出IgG抗B++-放散出抗C(交叉反應(yīng)性抗體),或同時放散出IgG抗A或抗B---未放散出抗體O※O+放散出ABO血型以外的抗體 注:※=+或-5．7．5．5在放散試驗的結(jié)果觀察中,會遇到一中交叉反應(yīng)性抗體(抗C),這是O型人血清中除抗A、B以外的第三種抗體，表示的符號有抗C、抗A、B（抗A+B）等。它針對的特異性是A和B抗原所共有的，因而它能凝集A型和B型紅細(xì)胞。5．7．5．6Wiener等認(rèn)為一個血型抗原可以有多種特異性（見圖2）如一個A1血型抗原有A1、A和C三個特異性，而不是在紅細(xì)胞上有A1、A和C三個抗原。（圖2）特異性解釋紅細(xì)胞上血型抗原特異性血清中抗體A型A1A1、A、C抗BB型BB、C抗AO型--抗A、抗B、抗CAB型ABA、B、C5．7．6患兒血清中游離抗體測定5．7．6．1取小試管3支，每支加患兒血清2滴。5．7．6．2分別加入3%的A、B、O型紅細(xì)胞鹽水懸液（標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞）1滴，37oC致敏60分鐘后取出，若致敏已發(fā)生凝集，證明存在相應(yīng)的抗體，則不必繼續(xù)往下做。5．7．6．3若不凝集，用鹽水洗3次后加入抗IgG（或廣譜）最適稀釋度抗人球蛋白血清1滴，3000轉(zhuǎn)/分，離心15秒2次。輕輕搖散，肉眼觀察結(jié)果。按圖3分析結(jié)果。（圖3）新生兒血清中游離抗體檢查指示紅細(xì)胞ABO 意義+--游離的抗A-+-游離的抗B++-游離的抗A、抗B或抗CO※O+游離的ABO系統(tǒng)以外抗體---無游離抗體注:※=+或-5．8產(chǎn)前（HDN）血型血清學(xué)檢查：包括產(chǎn)婦夫妻各自ABO血型檢查和不規(guī)則抗體篩選以及IgG抗A（B）測定。以下介紹IgG抗A（B）的測定:5．8．1原理：ABO-HDN由于IgG抗A（B）引起，所以檢測母親血清中有無IgG性質(zhì)的抗體并滴定其效價，即可預(yù)測ABO-HDN發(fā)生的可能性。人血清中抗A、抗B往往是IgG和IgM混合物，它們具有相同的特異性，要單獨測定IgG抗A（B）必須除去IgM抗A（B）的干擾。方法有巰基乙醇法（2-Me）和HAB血型物質(zhì)中和法，本院血庫采用了巰基乙醇法（2-Me）。5．8．2巰基乙醇法原理血清