3.2基因工程的基本操作程序

一直以來，蟲害對(duì)于棉花的產(chǎn)量有著很大的影響，自然界的棉花缺乏抗蟲能力，而蘇云金桿菌則含有一種特殊的毒蛋白基因：Bt毒蛋白基因，該基因可以產(chǎn)生通Bt抗蟲蛋白破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。如何利用這些資料，設(shè)想出一條提高棉花產(chǎn)量的方法？從社會(huì)中來3.2基因工程的基本操作程序基因工程的一般操作程序主要包括四個(gè)步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。1.目的基因的篩選與獲取4.目的基因的檢測(cè)與鑒定2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序什么叫目的基因？目的基因怎么選？選好之后怎么獲取？獲取目的基因1定義：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等相關(guān)的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因目的基因的定義從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選目的基因科學(xué)家已經(jīng)明確Bt基因的序列信息，也對(duì)Bt抗蟲蛋白有深入了解利用序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列對(duì)比工具（如BLAST）等，找到合適的目的基因問題：篩選出來的目的基因如何獲??？目的基因的篩選基因組文庫部分基因文庫（主要是cDNA文庫）基因文庫：1.從基因文庫中直接獲取目的基因的獲取2.利用mRNA和逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄獲取cDNA3.人工合成cDNA：先由mRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下獲得單鏈DNA，再利用DNA聚合酶，將單鏈DNA復(fù)制，產(chǎn)生雙鏈DNA，即為cDNA。獲取一個(gè)Bt基因之后，是否就該立即開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)基因操作？問題思考先對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，找出PCR的定義、原理、條件、大致過程。PCR擴(kuò)增目的基因：定義：依據(jù)半保留復(fù)制，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。發(fā)明者：穆里斯名字來由：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的原理：DNA的半保留復(fù)制DNA在體內(nèi)的半保留復(fù)制

條件：模板、原料、能量、酶

模板：DNA的兩條鏈（母鏈）

原料：四種游離的脫氧核苷酸

能量：一般由ATP

酶：解旋酶、DNA聚合酶

特點(diǎn)：半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制知識(shí)回顧體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸說明：PCR所用原料實(shí)為dNTP，dNTP和ATP類似可以通過基團(tuán)轉(zhuǎn)移為反應(yīng)提供能量。解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無需解旋酶，用高溫代替DNA母鏈4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常為小的單鏈DNA）反應(yīng)還需要其它條件，如緩沖液等PCR的條件知識(shí)回顧PCR和DNA的體內(nèi)復(fù)制是否完全相同？PCR的過程PCR的過程5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’引物13’5’引物23’5’5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’引物13’5’引物23’5’引物25’3’引物1目的基因PCR的過程受熱變性引物

耐高溫的DNA聚合酶(1)過程：（2）結(jié)果：1個(gè)模板DNA分子經(jīng)過n輪PCR，以_____方式擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出

個(gè)DNA片段。

指數(shù)2nPCR小結(jié)1.復(fù)性的過程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？思考

復(fù)性時(shí)引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低。原因是：①模板鏈一般比較長(zhǎng)，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之問的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)。難點(diǎn)剖析2.用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？思考不能！由于RNA不穩(wěn)定，需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進(jìn)行擴(kuò)增。難點(diǎn)剖析思考3.獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能分離出目的基因？至少要三次循環(huán)。難點(diǎn)剖析14.如何對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定嗎？思考瓊脂糖凝膠電泳DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向看與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就叫電泳。難點(diǎn)剖析5.獲得目的基因后直接轉(zhuǎn)入受體嗎？思考不是，游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因。難點(diǎn)剖析1.基因表達(dá)載體的目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的組成位置：功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)?；虻氖锥耍ㄒ欢斡刑厥饨Y(jié)構(gòu)的DNA片段）人們所需要的基因位置：功能：基因的尾端（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉(zhuǎn)錄用來鑒別或篩選含有重組DNA分子的細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心）2DNA復(fù)制所需結(jié)構(gòu)基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段AgeneisusuallyapieceofDNAthathasageneticeffectDNA片段基因1基因2基因3放大非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。非編碼區(qū)：不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段?；蛲ǔＪ怯羞z傳效應(yīng)的DNA片段——原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)AgeneisusuallyapieceofDNAthathasageneticeffect——Genestructureofprokaryoticcells非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子連續(xù)的、不間隔的RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA啟動(dòng)子本質(zhì)：位置：作用：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于基因上游基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段——真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)AgeneisusuallyapieceofDNAthathasageneticeffect——Genestructureofeukaryoticcells非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子間隔的、不連續(xù)的內(nèi)含子外顯子外顯子：內(nèi)含子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列?；蛲ǔＪ怯羞z傳效應(yīng)的DNA片段AgeneisusuallyapieceofDNAthathasageneticeffect原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點(diǎn)都有能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼非編碼序列=非編碼區(qū)原核基因：非編碼序列真核基因：=非編碼區(qū)+內(nèi)含子

3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種基因表達(dá)載體的構(gòu)建培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會(huì)得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？問題探討載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1如何解決這一問題？選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割，防止目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。難點(diǎn)剖析1.前面說用應(yīng)該同一種限制酶切割載體和目的基因，現(xiàn)在又說應(yīng)該用不同的限制酶切割載體和目的基因，兩種說法是否沖突？

不沖突，用不同的酶是指不管是切割載體還是切割目的基因，最好都用兩種限制酶切，保證不管是載體還是目的基因，其本身左右兩側(cè)的切口不同，不會(huì)自身環(huán)化。

而為了保證目的基因和載體能連接，就要求不管目的基因用的什么種類的限制酶切，載體也應(yīng)該用同一種限制酶，比如目的基因用酶1和酶2切，則載體也應(yīng)該用酶1和酶2切。(2016高考題改編)某一質(zhì)粒載體如圖所示，有人將此質(zhì)粒用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。（1）被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含_______的,含___________的，_____________________的。(2)如果用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述三種大腸桿菌細(xì)胞中,含_____的和_____________________的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是____________________________________；質(zhì)粒載體含有目的基因的重組質(zhì)粒二者均含有四環(huán)素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)Amp:四環(huán)素抗性基因課堂練習(xí)環(huán)狀目的基因含有目的基因的重組質(zhì)粒質(zhì)粒載體難點(diǎn)剖析2.目的基因應(yīng)該插入到載體的哪個(gè)部位？如果目的基因插入到標(biāo)記基因或復(fù)制原點(diǎn)中，該基因表達(dá)載體還能用么？如何避免這種現(xiàn)象？

（1）目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子和終止子之間，才能保證目的基因的正常轉(zhuǎn)錄。

（2）目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)等各個(gè)結(jié)構(gòu)都不得含有限制酶識(shí)別序列，否則會(huì)影響表達(dá)載體的構(gòu)建。如圖為某質(zhì)粒限制酶酶切圖譜。某基因不含圖中限制酶識(shí)別序列，為使該基因與該質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒，切割目的基因和質(zhì)粒時(shí)應(yīng)該選擇哪兩種酶？A、NdeⅠ和BamHⅠB、NdeⅠ和XbaⅠC、XbaⅠ和BamHⅠD、EcoRⅠ和KpnⅠ課堂練習(xí)A將目的基因與載體結(jié)合，構(gòu)建好基因表達(dá)載體后，下面該進(jìn)行什么操作？問題思考基因工程第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

轉(zhuǎn)化：指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。自主閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，總結(jié)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些，各個(gè)方法的原理是什么？各自適用于什么生物？3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程1.花粉管通道法（我國獨(dú)創(chuàng)）②在植物授粉后一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法導(dǎo)入外源DNA將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞適用生物：開花植物2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞適用生物：雙子葉植物目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA中重組DNA轉(zhuǎn)入桿菌農(nóng)桿菌侵入植物將目的基因帶入植物細(xì)胞含外源目的基因的重組DNA整合到植物細(xì)胞的基因組中目的基因遺傳特性穩(wěn)定維持和表達(dá)重點(diǎn)剖析1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關(guān)系？T-DNA不是目的基因，但它將來會(huì)被整合到宿主細(xì)胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞并整合到宿主細(xì)胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進(jìn)入植物的一個(gè)體細(xì)胞，但基因工程最終要的是一個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，如何實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)？

得到含有目的基因的植物細(xì)胞后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)操作程序：取受精卵顯微注射胚胎移植為什么常選用受精卵作為受體細(xì)胞呢？提純基因表達(dá)載體①體積大，易操作。②全能性高，易培養(yǎng)成完整個(gè)體。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（補(bǔ)充）3.顯微注射法（導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞）

科學(xué)家也用病毒DNA

與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)。如用腺病毒載體，搭載新冠病毒S基因，進(jìn)入人體內(nèi)，使人體產(chǎn)生對(duì)S蛋白的免疫記憶。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（補(bǔ)充）4.病毒介導(dǎo)法（主要用于導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞）

使用Ca2+處理可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（感受態(tài)細(xì)胞）過程微生物作為受體細(xì)胞有哪些優(yōu)點(diǎn)：繁殖快，單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，易于培養(yǎng)操作Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子大腸桿菌細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（補(bǔ)充）5.Ca2+轉(zhuǎn)化法（導(dǎo)入微生物）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——Ca2+轉(zhuǎn)化法課堂總結(jié)病毒介導(dǎo)法顯微注射法法將表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞后，如何判斷導(dǎo)入是否成功？即使導(dǎo)入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達(dá)？問題思考基因工程第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定1.分子檢測(cè)2.個(gè)體水平鑒定③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因

4目的基因的檢測(cè)與鑒定

在抗蟲棉的培育過程中，可以從哪些層次對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)與鑒定？1.檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法：PCR擴(kuò)增和DNA分子雜交技術(shù)目的基因的檢測(cè)與鑒定基本思路：1.制作出與目的基因序列相同的有同位素標(biāo)記的DNA片段，并用PCR擴(kuò)增（基因探針）2、提取受體細(xì)胞全部DNA，與基因探針置于同一培養(yǎng)液。3、高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N變性變性DNA分子雜交技術(shù)15NDNA分子雜交檢測(cè)目的基因的原理是什么？堿基互補(bǔ)配對(duì)原則雜交DNA分子（可檢測(cè)）2.檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴(kuò)增和分子雜交技術(shù)目的基因的檢測(cè)與鑒定基本思路：1.制作出與目的基因序列相同的有同位素標(biāo)記的DNA片段，并用PCR擴(kuò)增（基因探針）2、提取受體細(xì)胞全部RNA，直接與基因探針置于同一培養(yǎng)液?；蛳葘NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再與基因探針置于同一培養(yǎng)液。3、高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)分子雜交片段。變性探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA分子雜交技術(shù)

分子雜交檢測(cè)目的基因的原理是什么？堿基互補(bǔ)配對(duì)原則3.檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：抗原-抗體雜交技術(shù)蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交原理：抗原抗體的特異性結(jié)合目的基因的檢測(cè)與鑒定轉(zhuǎn)Bt基因非轉(zhuǎn)基因2.個(gè)體水平的檢測(cè)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株接種棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達(dá)目的基因表達(dá)目的基因的檢測(cè)與鑒定1.目的基因的篩選與獲取4.目的基因的檢測(cè)與鑒定2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序課堂總結(jié)：基因工程基本操作程序獲取目的基因的方法，PCR表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)和建構(gòu)方法目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的各種方法檢測(cè)的層次與原理1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（

）（2）構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶（

）（3）只要檢測(cè)出番茄細(xì)胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功（

）2.利用PCR既可以快速擴(kuò)增特定基因，也可以檢測(cè)基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述錯(cuò)誤的是（

）

A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶

B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶

C.復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則

D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸√××D課堂練習(xí)3.2基因工程的基本操作程序（第三課時(shí)）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定自主探究1、實(shí)驗(yàn)原理2、實(shí)驗(yàn)器材3、實(shí)驗(yàn)步驟4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.DNA體外擴(kuò)增的原理PCR利用了DNA熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。2.DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來。實(shí)驗(yàn)原理PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶（體外用高溫）打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種游離的脫氧核苷酸合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸實(shí)驗(yàn)器材PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5ul20mmol/l的4種脫氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA5-10ul總體積50ul注：模板DNA的用量為1pg-1ug實(shí)驗(yàn)器材用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min移液離心擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)步驟（PCR）PCR實(shí)驗(yàn)根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳、觀察接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。實(shí)驗(yàn)步驟（電泳鑒定）注意：1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。實(shí)驗(yàn)步驟（電泳鑒定）1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因?？梢栽谧贤鉄粝轮苯佑^察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。結(jié)果分析電泳實(shí)驗(yàn)新冠病毒核酸檢測(cè)例1：用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜，其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號(hào)為蒸餾水。PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此做出分析不合理的是(

)A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B.3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D.10號(hào)的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有干擾B課堂練習(xí)例2：通過引物設(shè)計(jì)運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)突變.圖1為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5'端分別設(shè)計(jì)增加限制性內(nèi)切酶a和限制性內(nèi)切酶b的識(shí)別位點(diǎn).有關(guān)敘述正確的是（）A.兩種引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因的定向插入B.在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等C.第2輪PCR，引物1與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因D.在第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/8A課堂練習(xí)例3：科學(xué)家通過利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)改造Rubisco酶基因，提高了光合作用過程中Rubisco酶對(duì)CO2的親和力，從而顯著提高了植物的光合作用速率，請(qǐng)回答下列問題：（1）PCR過程所依據(jù)的原理是_______________，