實驗動物胚胎工程技術(shù)市公開課一等獎省賽課獲獎?wù)n件

1第十二章試驗動物胚胎工程技術(shù)實驗動物胚胎工程技術(shù)第1頁2第一節(jié)概述工程:經(jīng)過構(gòu)想、設(shè)計，按照人們意愿制作、改造某一事物，以到達預(yù)想目標。

生物工程：

按照工程學(xué)原理，對生物體或生物大分子進行改造或利用，用于生產(chǎn)、研究、檢定和創(chuàng)造新物種綜合性科學(xué)技術(shù)。遺傳（基因）工程蛋白質(zhì)工程酶工程細胞工程微生物工程胚胎工程組織工程

分子水平細胞水平組織水平實驗動物胚胎工程技術(shù)第2頁3胚胎工程（Embryonicengineering）又稱胚胎技術(shù),是指用工程學(xué)原理對動物胚胎進行某種技術(shù)操作或改造，使之取得人們所需要動物一系列生物技術(shù)總稱,包含以下四大技術(shù)體系：一、胚胎操作基本技術(shù)

1.超數(shù)排卵和卵母細胞、精子、受精卵采集

2.體外受精

3.胚胎性別控制

4.胚胎分割

5.胚胎培養(yǎng)

6.胚胎移植

7.胚胎冷凍保留二、體細胞克隆技術(shù)三、干細胞技術(shù)四、外源基因?qū)爰夹g(shù)實驗動物胚胎工程技術(shù)第3頁41．在畜牧業(yè)方面：經(jīng)過建立超數(shù)排卵、受精卵/卵母細胞采集、體外受精、胚胎切割、胚胎性別控制、體細胞克隆以及胚胎移植技術(shù)，加緊良種家畜繁殖和家畜品種改良。

胚胎工程應(yīng)用實驗動物胚胎工程技術(shù)第4頁5已在乳腺表示生物活性蛋白并進入臨床2期或3期試驗：抗凝血酶一Ⅲ抗胰蛋白酶蛋白C乳鐵蛋白乳糖酶2．在生物制藥方面：經(jīng)過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將含有藥用價值生物活性蛋白基因整合到宿主染色體上，使其在乳汁、血液、尿液等體液中表示。經(jīng)過搜集、純化這些體液中生物活性蛋白，用于預(yù)防和治療一些人類疾病。實驗動物胚胎工程技術(shù)第5頁63．在醫(yī)學(xué)方面：經(jīng)過建立卵母細胞采集、體外受精、顯微受精以及胚胎移植技術(shù)，用于不孕癥治療；經(jīng)過對胚胎培養(yǎng)和檢測，剔除含有遺傳性疾病胚胎，到達優(yōu)生優(yōu)育目標。

4．在生命科學(xué)研究方面：說明哺乳動物早期胚胎發(fā)生、發(fā)育機制等基礎(chǔ)理論

5．在拯救瀕危野生動物方面：經(jīng)過野生動物生殖細胞和組織冷凍保留、體細胞克隆和胚胎移植技術(shù)，擴大野生動物種群。實驗動物胚胎工程技術(shù)第6頁7第二節(jié)胚胎操作基本技術(shù)實驗動物胚胎工程技術(shù)第7頁8胚胎操作整個過程局限在胚胎早期發(fā)育實驗動物胚胎工程技術(shù)第8頁9解剖取附睪尾部精子獲取和培養(yǎng)1.精子采集

嚙齒類小動物精子采集大都從體成熟雄性動物附睪獲取。將動物處死后，分離附睪尾部，用眼科剪子在頂端剪一小口，用手指輕柔擠出濃稠液滴，置培養(yǎng)液中培養(yǎng)。大動物精液采集可采取假陰道或電刺激方法促進雄性射精，搜集精液。一、精子、卵母細胞、受精卵采集和超數(shù)排卵實驗動物胚胎工程技術(shù)第9頁102.卵母細胞和受精卵采集

在哺乳動物中取得卵母細胞路徑有兩條：從體內(nèi)成熟并排到輸卵管中去，需經(jīng)過處死動物或外科手術(shù)獲取；假如在交配后，則可獲取受精卵或早期胚胎。取自屠宰淘汰或剛死亡雌性動物卵巢，從卵巢中分離卵母細胞經(jīng)培養(yǎng)而得。小鼠解剖取輸卵管從輸卵管壺腹部取卵母細胞/受精卵方法實驗動物胚胎工程技術(shù)第10頁11

3.超數(shù)排卵（Superovolation）技術(shù)：經(jīng)過注射激素刺激卵巢大量排卵。經(jīng)超數(shù)排卵處理，動物卵巢大量卵泡同時成熟并排出，排卵數(shù)可增加幾倍至十幾倍，一次可取得大量卵細胞、受精卵或早期胚胎。所用激素有促卵泡激素（FSH）、人絨毛膜促性腺激素(HCG)和孕馬血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，以前三種慣用。實驗動物胚胎工程技術(shù)第11頁12檢驗陰栓：妊娠0.5天中午12時中午12時早晨8時二十四小時二十四小時20小時注射PMSG注射hCG小鼠超數(shù)排卵程序放到種公鼠籠內(nèi)受精卵注射PMSG注射hCG晚上5-6時晚上5-6時二十四小時二十四小時卵母細胞采集15小時實驗動物胚胎工程技術(shù)第12頁13

體外受精（Invitrofertilization）是指成熟精子與卵母細胞在體外環(huán)境下完成受精過程。這一過程包含卵母細胞搜集或未成熟卵母細胞培養(yǎng)成熟、精子獲取、獲能處理、受精及受精后胚胎培養(yǎng)等。

體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)（IVF）又稱試管嬰兒。

二、體外受精實驗動物胚胎工程技術(shù)第13頁14

性別控制研究，是畜牧業(yè)生物技術(shù)中一項主要高新技術(shù)。這項技術(shù)應(yīng)用，能夠使畜牧上大動物繁殖按照人們意愿只生產(chǎn)同一性別動物。

在醫(yī)學(xué)上，性別控制研究也含有主動意義。有遺傳性疾病屬于性連鎖遺傳，比如進行性肌營養(yǎng)不良，為X連鎖隱性遺傳，男性發(fā)病，女性攜帶異?；虻话l(fā)病。攜帶此致病基因女性懷孕后如做胚胎性別判定，則可防止男性患兒出生。三、胚胎性別控制實驗動物胚胎工程技術(shù)第14頁15性別控制技術(shù)經(jīng)過對X精子與Y精子分離以控制性別在胚胎移植前對胚胎性別進行判定以控制性別經(jīng)過控制飼料特征、受精環(huán)境如改變精液或陰道PH值等來控制性別。實驗動物胚胎工程技術(shù)第15頁16（一）分離X精子與Y精子以控制性別分離X精子與Y精子依據(jù)：X、Y精子在體積、密度、電荷、運動性和DNA含量、表面抗原等方面存在差異。將X和Y精子分離再經(jīng)過人工授精能夠有效地到達性別控制目標。當(dāng)前將X和Y精子分離方法有沉降法、電泳法、免疫法和流式細胞儀法等。流式細胞儀法是當(dāng)前分離X、Y精子較準確方法，含有重復(fù)性、科學(xué)性和有效性特點。實驗動物胚胎工程技術(shù)第16頁17

應(yīng)用流式細胞儀分離X和Y精子原理：X精子DNA含量比Y精子高。對于奶牛，X精子比Y精子DNA含量高3.8％，因為染料著色量與精子DNA含量成正比，所以X精子吸收染料多，發(fā)出熒光就比Y精子強。正常人染色體實驗動物胚胎工程技術(shù)第17頁18

詳細做法是：先用DNA特異性染料對精子進行活體染色，然后精子連同少許稀釋液逐一經(jīng)過激光束。探測器依據(jù)精子發(fā)光強度把電信號傳遞給計算機，計算機指令液滴充電使發(fā)光強度高液滴帶正電，弱帶負電。即X精子帶上正電荷，Y精子帶上負電荷。當(dāng)經(jīng)過高壓電場時會向不一樣方向偏轉(zhuǎn)，到達分離目標。實驗動物胚胎工程技術(shù)第18頁19（二）對胚胎進行判定以控制性別

在胚胎移植前對胚胎部分組織用染色體檢驗、間接免疫熒光法和PCR法進行性別判定。其中PCR法因有可靠操作程序，含有高效、快速特點，近年來得到快速發(fā)展。

Y染色體短臂上有決定雄性DNA片段-SRY基因(sex-determiningregionofY-chromosome,全稱:Y染色體性別決定區(qū))，為胚胎性別判定提供了可靠路徑。實驗動物胚胎工程技術(shù)第19頁20實驗動物胚胎工程技術(shù)第20頁21受精卵2細胞胚4細胞胚8細胞胚桑椹胚囊胚

胚胎培養(yǎng)是指將取得早期胚胎在體外人工環(huán)境中進行培養(yǎng)，以觀察其發(fā)育或人工干預(yù)某一發(fā)育過程可能性。四、胚胎培養(yǎng)實驗動物胚胎工程技術(shù)第21頁22胚胎培養(yǎng)普通應(yīng)用于以下幾個方面：

1．未成熟卵母細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)，成熟后進行體外受精。

2．受精卵經(jīng)過體外培養(yǎng)發(fā)育成各階段早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷凍保留。

3．冷凍保留胚胎解凍后，經(jīng)過體外培養(yǎng)，篩選成活胚胎用于胚胎移植。

4．經(jīng)過研究胚胎發(fā)育環(huán)境和條件，不停完善胚胎培養(yǎng)條件，揭示胚胎細胞生長發(fā)育和分化奧秘。當(dāng)前胚胎培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)⑽闯墒炻言隗w外成熟，并經(jīng)過體外受精發(fā)育成各階段早期胚胎。即使如此，在體外胚胎培養(yǎng)也只能發(fā)育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到動物子宮內(nèi)。實驗動物胚胎工程技術(shù)第22頁23---胚胎工程最終一道工序

將受精卵或發(fā)育到一定時期早期胚胎,移植到受體動物生殖管道一定部位,能在子宮內(nèi)著床、生長、發(fā)育、分娩、出生仔代動物技術(shù)稱為胚胎移植。幾乎全部胚胎工程技術(shù)在體外完成對胚胎操作后，都需經(jīng)過胚胎移植這一步驟，得到我們所要動物。五、胚胎移植實驗動物胚胎工程技術(shù)第23頁24體外培養(yǎng)胚胎必須移植到同時發(fā)情雌性動物生殖管道內(nèi)。處理同時發(fā)情方法有兩種：1.利用自然同期發(fā)情母畜，此法在實踐上較難辦到；2.經(jīng)過注射一些藥品(如孕激素、雌激素等)誘發(fā)同期發(fā)情。

不一樣發(fā)育階段胚胎移植部位不一樣。受精卵和2細胞胚胎應(yīng)移植到輸卵管內(nèi)，而桑椹胚和囊胚期胚胎應(yīng)移植到子宮內(nèi)，以跟正常妊娠生殖生理改變同時。實驗動物胚胎工程技術(shù)第24頁25同一個屬內(nèi)不一樣品種品系可相互進行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠胚胎可移植到雌性封閉群ICR生殖管道內(nèi)；日本大耳白兔胚胎可移植到雌性新西蘭兔生殖管道內(nèi)。這一特點在畜牧業(yè)尤其有用，如為了加緊良種奶牛繁殖，可將良種奶牛胚胎移植到普通黃牛生殖管道內(nèi)，借腹懷胎。實驗動物胚胎工程技術(shù)第25頁26

胚胎冷凍保留（embryocryopreservation）技術(shù)是指在低溫（-196℃液氮內(nèi)）條件下利用低溫保護劑保留生殖細胞及胚胎一門技術(shù)。六、胚胎冷凍保留實驗動物胚胎工程技術(shù)第26頁27（一）胚胎冷凍保留機制

低溫降低了胚胎內(nèi)生化反應(yīng)速度。而且溫度越低，保留時間就越長。低溫損傷：假如冷卻速度過慢，胞外溶液中水分大量結(jié)冰，溶液濃度提升，胞內(nèi)水分大量滲出，造成細胞強烈收縮和細胞處于高濃度溶液中時間過長，從而造成化學(xué)損傷；假如冷卻速度過快，胞內(nèi)水分來不及經(jīng)過細胞膜向外滲出，胞內(nèi)溶液過冷而結(jié)冰，從而造成物理損傷。

一樣，在復(fù)溫（解凍）過程中，假如復(fù)溫速率不妥也可能引發(fā)細胞內(nèi)結(jié)冰（重結(jié)冰）而損傷。實驗動物胚胎工程技術(shù)第27頁28

采取低溫保護劑預(yù)防低溫損傷：

二甲基亞砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、乙二醇、羥甲基淀粉（HES）等能夠防止或降低結(jié)冰程度與速度，降低細胞周圍未凍結(jié)溶液中電解質(zhì)濃度，從而防止或降低胚胎冷凍過程中所發(fā)生物理和化學(xué)損傷。實驗動物胚胎工程技術(shù)第28頁29

（二）胚胎冷凍保留技術(shù)應(yīng)用

1.應(yīng)用于試驗動物保種和珍稀或瀕危動物種質(zhì)保留。⒉應(yīng)用于試驗動物胚胎長途運輸。⒊應(yīng)用于試驗動物生物凈化。⒋應(yīng)用于試驗動物育種和野生動物試驗動物化。實驗動物胚胎工程技術(shù)第29頁30第三節(jié)動物體細胞克隆技術(shù)實驗動物胚胎工程技術(shù)第30頁31

克?。╟lone）概念克隆是指無性繁殖或拷貝。無性生殖在植物中很常見，在動物中過去認為是不可能。動物克隆是指生物體經(jīng)過體細胞核移植生產(chǎn)出基因型幾乎與供體完全相同后代。實驗動物胚胎工程技術(shù)第31頁32

核移植（Nucleartransfer）是指將動物細胞細胞核移植到另一個體去核卵母細胞胞質(zhì)中，經(jīng)過電激活，使供體核重編程序，形成重構(gòu)卵發(fā)育成胚胎，最終經(jīng)過胚胎移植，使之發(fā)育成個體。假如受體去核卵和供體移入核來自同種動物，則稱種內(nèi)核移植，來自不一樣種則稱為種間核移植。核移植因為沒有經(jīng)過精子和卵子受精過程，核移植動物全部遺傳信息來自供體核細胞，等于是復(fù)制了提供細胞核動物，因而把它俗稱為“克隆”。

實驗動物胚胎工程技術(shù)第32頁33

依據(jù)供體核起源不一樣，核移植包含以下幾個：

胚胎細胞核移植：未著床囊胚（未分化）胚胎干細胞核移植（未分化）胎兒成纖維細胞：出生前胎兒（未分化或低分化）成年體細胞（已分化）實驗動物胚胎工程技術(shù)第33頁34動物克隆試驗過程實驗動物胚胎工程技術(shù)第34頁35動物克隆技術(shù)意義與應(yīng)用加緊良種家畜繁殖速度與體細胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合，能制備大家畜轉(zhuǎn)基因動物拯救瀕危野生動物治療性克隆，用于再生醫(yī)學(xué)實驗動物胚胎工程技術(shù)第35頁36再生醫(yī)學(xué)技術(shù)路線介紹實驗動物胚胎工程技術(shù)第36頁37第四節(jié)干細胞技術(shù)實驗動物胚胎工程技術(shù)第37頁38一、概述干細胞是一類含有自我更新、高度增殖和多向分化潛能細胞。依據(jù)發(fā)育階段，可將干細胞分為胚胎干細胞(embryonicstemcells，ES細胞)和成體干細胞(adultstemcells，AS細胞)。ES細胞存在于囊胚期胚胎內(nèi)細胞團中，是全能性、無限增殖干細胞，在胚胎生長發(fā)育過程中含有分化形成胎兒全部類型細胞、組織和器官潛能。AS細胞是ES細胞定植于胎兒和成人各種組織和器官中“種子”，含有自我更新和分化為組織特異細胞能力，即分化為對應(yīng)組織和器官中細胞“專能”細胞，包含神經(jīng)干細胞、脂肪干細胞、造血干細胞、間充質(zhì)干細胞、精原干細胞、皮膚干細胞和肝臟干細胞等。實驗動物胚胎工程技術(shù)第38頁39實驗動物胚胎工程技術(shù)第39頁40誘導(dǎo)性多潛能干細胞”

(Inducedpluripotentstemcells,iPS細胞)年,Takahashi等首次發(fā)覺導(dǎo)入特定轉(zhuǎn)錄因子基因能夠使已分化細胞重編程回歸到胚胎細胞狀態(tài)。他們經(jīng)過慢病毒載體介導(dǎo)將Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44種轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胄∈笃つw成纖維細胞,取得了含有強大自我更新能力和分化潛能多能性干細胞,命名為“誘導(dǎo)性多潛能干細胞”

(Inducedpluripotentstemcells,iPS細胞)。這一研究克服了ES細胞和AS細胞應(yīng)用存在很多問題，展現(xiàn)了遼闊應(yīng)用前景，受到了整個生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛關(guān)注。當(dāng)前研究中較為理想供體細胞主要有血細胞(如T細胞和B細胞等)、脂肪細胞和皮膚成纖維細胞。實驗動物胚胎工程技術(shù)第40頁41二、胚胎干細胞（ES細胞)起源：ES細胞是從胚胎發(fā)育早期囊胚（人胚胎受精后約5-7天，小鼠胚胎受精后3-4天）中內(nèi)細胞群分離出來未分化細胞。內(nèi)細胞群:含有未分化特征，可深入分裂,分化形成內(nèi)、中、外三個胚層。外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等，中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織，內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等。因為內(nèi)細胞群能夠發(fā)育成完整個體，因而這些細胞被認為含有全能性。當(dāng)內(nèi)細胞群分離出來后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時，我們稱之為ES細胞。實驗動物胚胎工程技術(shù)第41頁42

當(dāng)前除了從小鼠、大鼠和人分離得到并建立ES細胞系外，還未從其它動物囊胚中分離到ES細胞系。實驗動物胚胎工程技術(shù)第42頁43

（二）ES細胞培養(yǎng)

ES細胞培養(yǎng)條件極其苛刻，對培養(yǎng)液、試劑、胎牛血清、水等均需采取胚胎級，對培養(yǎng)器皿等必須清洗潔凈。一旦條件不適合，ES細胞輕易發(fā)生分化，從而失去ES細胞特征。

未分化ES細胞培養(yǎng)普通需要與用絲裂霉素處理過成纖維細胞喂養(yǎng)層（Feedercell）共培養(yǎng)，喂養(yǎng)層細胞為ES細胞提供細胞因子來維持其未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)液中加用白血病抑制因子（LeukemiaInhibitoryFactor，LIF）能更有效地維持未分化ES細胞。實驗動物胚胎工程技術(shù)第43頁44（三）ES細胞判定

ES細胞是一個正常胚胎性干細胞，含有正常染色體核型和體內(nèi)外分化潛能。在建系之初需要對其核型、分化能力和細胞標志物進行判定

1．核型

2．體外分化試驗將ES細胞在無喂養(yǎng)層、低胎牛血清培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數(shù)天后形成胚樣小體（embryoidbodies）內(nèi)皮樣大型細胞團；向成纖維細胞、心肌細胞以及造血細胞分化。

3．體內(nèi)分化試驗將ES細胞懸液注射到同性別小鼠腹股溝皮下，2周后注射部位出現(xiàn)腫塊，病理檢驗為畸胎瘤。畸胎瘤內(nèi)部有各種細胞生長，如上皮細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、成纖維細胞以及干細胞集落等，也可看到各胚層組織分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。

4．ES細胞標志物

Oct-4:Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）屬POU轉(zhuǎn)錄因子一員，它在全能胚胎干細胞(ES)和生殖細胞表示。該表示對于維持干細胞自我更新和多能性是必要。ES分化造成Oct-4下調(diào)。

SSEAs:人ES細胞表示SSEA-3和SSEA-4，但不表示SSEA-1。小鼠ES細胞表示SSEA-1，但不表示SSEA-3或SSEA-4。

實驗動物胚胎工程技術(shù)第44頁45（四）胚胎干細胞應(yīng)用1.用于研究哺乳動物個體發(fā)生發(fā)育規(guī)律

因為ES細胞可分化為胚胎內(nèi)胚層、中胚層和外胚層中任何一個類型細胞，所以可用遺傳標識ES細胞(如標識半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，經(jīng)過組織化學(xué)染色追蹤ES細胞分化特點，探索胚胎發(fā)育過程中細胞分化、組織和器官形成規(guī)律。小鼠ES細胞已成為研究哺乳動物早期發(fā)育規(guī)律主要工具之一。實驗動物胚胎工程技術(shù)第45頁46

2.在體外研究細胞分化規(guī)律

ES細胞僅在喂養(yǎng)層細胞上或在添加白血病抑制因子(LIF)或白細胞介素-6(IL-6)培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)劑，如牛黃酸(RA)、二甲基亞砜(DMSO)、丁酰環(huán)腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可誘導(dǎo)ES細胞發(fā)生不一樣類型分化，經(jīng)過研究ES分化特點可揭示細胞分化和凋亡機理。實驗動物胚胎工程技術(shù)第46頁473.用于研究基因功效和制備基因敲除動物

因為用ES細胞可進行基因打靶，輕易取得基因敲除或定向插入外源基因ES細胞，所以是基因敲除和基因插入首選細胞。經(jīng)過篩選取得陽性細胞，然后用嵌合體或細胞核移植技術(shù)取得轉(zhuǎn)基因動物。用于研究未知基因生物學(xué)功效。實驗動物胚胎工程技術(shù)第47頁484.治療人類一些難治性疾病

人類因為細胞壞死、退化或功效異常引發(fā)疾病，如帕金森綜合癥、少年糖尿病和老年癡呆癥等，已成為醫(yī)學(xué)上還未攻克頑癥。利用ES細胞能夠誘導(dǎo)分化形成新組織細胞特征，移植ES細胞可使壞死或退化部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功效。當(dāng)前，在動物試驗方面，用ES細胞誘導(dǎo)分化出一些組織細胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑難病癥。實驗動物胚胎工程技術(shù)第48頁495.培育出人造組織器官，用于器官移植

伴隨組織工程技術(shù)發(fā)展，經(jīng)過ES細胞體外誘導(dǎo)分化，還能夠培育出人造組織器官，處理當(dāng)前臨床上存在供體器官不足和器官移植后免疫排斥問題。實驗動物胚胎工程技術(shù)第49頁50三、成體干細胞1.成體干細胞（AS細胞）起源AS細胞位于出生后體內(nèi)分化成熟組織之中，含有自我更新和分化潛能，它在分裂時可產(chǎn)生兩個子代細胞，一個與原來干細胞完全一致，另一個向前分化，形成對應(yīng)組織多功效干細胞，經(jīng)過分化增殖和更新衰老細胞來構(gòu)筑對應(yīng)器官，維持正常生理功效。現(xiàn)在可從骨髓和血液、胎盤、臍帶、肌肉、大腦、皮膚、脂肪、滑膜等各種組織中獲取各種多能干細胞。實驗動物胚胎工程技術(shù)第50頁512.AS細胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化取所要分離AS細胞組織，用酶消化法分散細胞進行體外培養(yǎng)。再用各種技術(shù)從體外培養(yǎng)細胞中分離AS細胞，如用免疫磁珠分離系統(tǒng)分離乳腺AS細胞。同ES細胞一樣，AS細胞誘導(dǎo)定向分化需要細胞因子、激素等刺激，如IL-l、IL-11、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）等。通常情況下，供體干細胞在受體中分化為與其組織起源一致細胞。然而在一些情況下干細胞分化并不遵照這種規(guī)律，如神經(jīng)外胚層起源NSC能分化為中胚層起源細胞如肌細胞，肌肉干細胞會分化為各種血細胞系等。全部干細胞中，起源于骨髓干細胞在多向性分化方面含有較大潛能，分為造血干細胞(HSC)和骨髓間質(zhì)干細胞(MSC)。實驗動物胚胎工程技術(shù)第51頁523.AS細胞判定各種AS細胞都有自己標識物，可利用標識物進行判定。4.AS細胞應(yīng)用疾病替換治療和移植治療

如用造血干細胞治療白血病，造血干細胞在體外誘導(dǎo)分化成心肌細胞來修復(fù)受損傷心肌，治療心力衰竭。骨髓起源干細胞及其它起源干細胞都能夠分化得到成骨細胞，經(jīng)過將細胞與支架材料結(jié)合后移植于骨骼受損部位，用于修復(fù)骨骼缺損。實驗動物胚胎工程技術(shù)第52頁53四、誘導(dǎo)性多潛能干細胞1.iPS細胞起源iPS細胞建立過程主要包含:①分離和培養(yǎng)宿主細胞；②經(jīng)過病毒介導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)染方式將若干個多能性相關(guān)基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）導(dǎo)入宿主細胞；③將病毒感染后細胞種植于喂養(yǎng)層細胞上,用ES細胞專用培養(yǎng)體系中培養(yǎng),同時在培養(yǎng)液中依據(jù)需要加入對應(yīng)小分子化合物，以促進重編程。2.iPS細胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化其培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)定向分化條件基本與ES細胞相同。3.iPS細胞判定iPS細胞判定與ES細胞相同。實驗動物胚胎工程技術(shù)第53頁54怎樣取得人ES細胞傳統(tǒng)技術(shù)1.用病人皮膚細胞核移植到人去核卵母細胞人卵母細胞起源問題2.用病人皮膚細胞核移植到動物去核卵母細胞倫理問題新技術(shù)1.用ES細胞特異轉(zhuǎn)錄基因?qū)肴似つw細胞，直接轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)多能干細胞（iPS）(）安全問題2.miRNAs直接將皮膚細胞轉(zhuǎn)化為iPS(年）以病毒為載體，向老鼠成纖維細胞中注入4個基因，將其改造為ｉＰＳ細胞，然后在此基礎(chǔ)上培育出一個老鼠胚胎，再把它植入代孕試驗鼠體內(nèi)。20天后，一只黑色小老鼠出生。實驗動物胚胎工程技術(shù)第54頁554.iPS細胞應(yīng)用iPS細胞與ES細胞相比,含有很多優(yōu)勢。iPS細胞起源更方便、更豐富，能夠經(jīng)過有限幾個轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)染直接誘導(dǎo)各種不一樣動物體細胞來獲取多能性干細胞，而不需要經(jīng)過ES細胞路徑，克服了許多動物至今未分離出ES細胞問題。iPS細胞產(chǎn)生不需要早期胚胎或者其它配子參加，克服了使用人胚胎進行試驗倫理問題，可見iPS細胞必定成為未來相當(dāng)長一段時間內(nèi)研究熱點。當(dāng)前,科學(xué)家們已經(jīng)成功地從小鼠、大鼠、獼猴、豬和人體細胞中誘導(dǎo)并取得iPS細胞。實驗動物胚胎工程技術(shù)第55頁56第五節(jié)外源基因?qū)肱咛ゼ夹g(shù)

實驗動物胚胎工程技術(shù)第56頁57

將外源基因?qū)氲脚咛?nèi)主要有以下幾個方法：一、直接導(dǎo)入受精卵或早期胚胎內(nèi)①顯微注射法：在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源DNA直接注入到受體受精卵雄性原核內(nèi)。②逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法：將外源基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，感染受體細胞時，外源基因可整合到宿主細胞染色體內(nèi)。用于轉(zhuǎn)基因和基因治療。

③精子載體法：將外源DNA與動物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源DNA帶入卵內(nèi)。

實驗動物胚胎工程技術(shù)第57頁58二、將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細胞或體細胞，再將轉(zhuǎn)染細胞作為供體核移植到去核卵母細胞，發(fā)育成胚胎。

1.將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細胞或體細胞：

①電穿孔法：細胞暴露于高電壓時，細胞膜為高電壓瞬時擊穿，從而使外源DNA被攝入細胞中。②脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體是一個人造膜，將外源DNA裝入脂質(zhì)體，與培養(yǎng)細胞一起溫育，即可將外源DNA導(dǎo)入受體細胞。③基因槍法：

④DEAE-葡聚糖介導(dǎo)法：⑤磷酸鈣介導(dǎo)法：

實驗動物胚胎工程技術(shù)第58頁592.帶有外源基因ES細胞經(jīng)過崁合體技術(shù)進入囊胚胚胎嵌合是指將遺傳上不一樣兩類胚胎或胚細胞組合起來，由此而發(fā)育形成動物稱為嵌合體動物。因為嵌合體動物是兩類遺傳背景不一樣胚胎發(fā)育形成，不一樣細胞群體相互嵌合組成了器官和組織，但嵌合體動物攜帶兩種遺傳特征不能同時遺傳給下一代同一個體。終究哪一個親本遺傳特征能遺傳取決于該親本細胞是否在嵌合體動物體內(nèi)分化成生殖細胞（精子或卵子）。分化成生殖細胞親本遺傳特征能傳給后代。實驗動物胚胎工程技術(shù)第59頁60嵌合體動物制備：1.聚合法用聚正當(dāng)制作嵌合體動物，是將遺傳上不一樣（比如毛色不一樣）兩個8～16細胞胚胎用物理方法聚合起來。2.注射法

注射法是將胚胎干細胞或其它胚細胞注入桑椹胚或囊胚腔中來制作嵌合體動物。實驗動物胚胎工程技術(shù)第60頁613.帶有外源基因體細胞經(jīng)過克隆技術(shù)進入胚胎將帶有外源基因體細胞作為供體，經(jīng)過核移植技術(shù)克隆到去核卵母細胞，在體外發(fā)育成囊胚，再移植到假孕動物子宮中。出生后動物基因型與供體基因型完全一致。實驗動物胚胎工程技術(shù)第61頁62

外源基因進入細胞后命運

外源DNA進入細胞后有三種命運：

1．被胞內(nèi)酶降解。

2．以游離狀態(tài)存在。游離未整合外源DNA只要有真核細胞能識別開啟子、編碼基因以及poly(A)信號等，普通都能得到表示，但伴隨細胞衰老，表示力下降。這種表示不能傳代，稱為暫時表示。

3．整合到受體細胞染色體（只有少數(shù)）。整合到受體細胞基因組外源基因，能隨細胞分裂遺傳到子細胞，稱為穩(wěn)定表示。實驗動物胚胎工程技術(shù)第62頁63DNA構(gòu)件導(dǎo)入細胞方法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因電穿孔電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染生殖細胞或早期胚胎ES細胞體細胞隨機整合定點整合或隨機整合定點整合或隨機整合實驗動物胚胎工程技術(shù)第63頁64

外源基因整合到受體細胞染色體可分為以下兩種情況：①隨機插入（Randominsertion）：外源基因進入細胞后，隨機插入到任意染色體內(nèi)。假如插入到一個基因內(nèi)，可能造成該基因失活。另外，插入外源基因受鄰近調(diào)控序列影響，其表示可能高，也可能低。②定點整合（Targetedintegration）：實現(xiàn)定點整合前提是外源基因一端或兩端帶有定點整合部位同源DNA序列，即所謂同源臂（Homologousarm）。當(dāng)外源基因載體進入細胞后，同源臂序列與宿主染色體上相同序列相互靠近，經(jīng)過同源重組，將外源基因載體置換到染色體對應(yīng)位置上，實現(xiàn)了定點整合。我們把這種技術(shù)形象地稱之為“基因打靶”。實驗動物胚胎工程技術(shù)第64頁65隨機整合（Randominsertion）

外源基因隨機插入到染色體任意部位。插入到致死基因序列內(nèi)：胚胎死亡插入到功效基因序列內(nèi)：基因失活插入到調(diào)控區(qū)下游：外源基因表示增強/減弱實驗動物胚胎工程技術(shù)第65頁66

定點整合（targetedintegration）

同義詞：基因打靶（Genetargeting）

是指將基因組某一基因序列克隆出來并加以改造，再導(dǎo)入同種細胞內(nèi)。該基因序列能夠與細胞基因組內(nèi)同源序列（靶基因）發(fā)生重組，從而將改造后基因置換到基因組內(nèi)，實現(xiàn)靶基因敲除、替換或改造。實驗動物胚胎工程技術(shù)第66頁67

同源重組（Homologousrecombination）

是指發(fā)生在DNA同源序列之間重組，其條件是兩條DNA分子有相同序列部分，而且相互靠近。1neotk3