DB37-T 3319-2018 水貂、狐和貉犬瘟熱病毒等10種病毒性病原實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法

ICS65.020.30B41

DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T3319—201810PCRReal-timefluorescentPCRReal-timefluorescentPCRdetectingofdistemperandother10viralpathogensofmink,foxandraccoondog2018061220180712山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王貴升、王金寶、田夫林、張鶴曉、崔凱、張?jiān)?、張華杰。水貂、狐和貉犬瘟熱病毒等10種病毒性病原實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水貂、狐和貉犬瘟熱病毒等10種病毒性病原實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。10種病毒的熒光PCR方法，其他動(dòng)物參考。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法3縮略語3縮略語熒光PCRCt值DNARNATaq酶PBS實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號量達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)圈數(shù)脫氧核糖核酸核糖核酸TaqDNA聚合酶磷酸鹽緩沖生理鹽水4試劑和材料PCR（板）。高速臺式冷凍離心機(jī)（12000r/min）?；靹蚱鳌：銣厮″?。4.5冰箱（2℃～8℃和-20℃兩種）。4.6微量移液器（0.5L～10L，5L～20L，20L～200L，200L～1000L）及配套吸頭。1.5mL（無核酸酶）。DNA\RNA5樣品的采集與前處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣品前處理過程中須戴一次性手套。取樣工具棉拭子、剪刀、鑷子、研缽、Eppendorf所有上述取樣工具必須經(jīng)（121±2）℃，15min1602h。采樣方法拭子樣品3～51.0mLPBSEppendorf肛拭子采樣，采樣時(shí)要將拭子深入肛門回刮3～5次，取排泄物。然后將拭子插入到裝有1.0mLPBS無菌Eppendorf管中，編號備用。內(nèi)臟或肌肉樣品用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品1.0g于研缽中充分研磨，再加5.0mLPBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌Eppendorf管中，編號備用。血清或血漿用無菌注射器直接吸取至無菌Eppendorf管中，編號備用。存放與運(yùn)送采集或處理的樣本在2℃～824-70（最多凍融3引物及探針見表1“熒光PCR方法的引物及探針”。表1熒光PCR方法的引物及探針引物及探針引物及探針見表1“熒光PCR方法的引物及探針”。表1熒光PCR方法的引物及探針RNA病毒犬瘟熱病毒FGCAAGCGAGGATTGAGGGTATRGGCCTATGGGACACACTCAAAProbeFAM-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQ星狀病毒FTCCAGGCATTTGAGTATGCCRCCACATAATCCTGGGGGAProbeFAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ冠狀病毒FTGGGAC(T)TATCCT(A)AAG(A)TGTGARTAA(G)CACACAACNCCATCATCProbeFAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ杯狀病毒FCTGACTTCAAATTTCATCTCRTGGGAATTAAGTCAGAGGProbeFAM-ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC-BHQ輪狀病毒FTTTATAGATAATGTATGTATGGATGRCCAATTCTCAATGTAATCAGProbeFAM-AATAGCCAGAGAATCAGAACGAA-BHQ細(xì)小病毒FCGTCTACACAAGGGCCATTTARCCATGTTGTCTACCAAATGCAT表1熒光PCR方法的引物及探針（續(xù)）細(xì)小病毒ProbeFAM-CGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCA-BHQDNA病毒博卡病毒FAGACGACGCCTAGTTGTTTGGTRCAGTCCCTCCCAAGATACACTTTGProbeFAM-AGGTTCCACCCAATCCTGGTGCATTAAGC-BHQ偽狂犬病毒FGCCAACCCGCTCGTGCTCRCACGAACACGCAGTCGCAGTAProbeFAM-GGCAGGTGCTGGGACTCGGGC-BHQ圓環(huán)病毒FCTCCCAATCTCCCTATTTGATRATCTGTTCCTTTCGCTTTCTCProbeFAM-ACACCCCACCTACAGGGGTTCGC-BHQ阿留申病毒FACCCTCCAGGTCAACTCTTRTTAGTAAATACACCAGGTTCTCCProbeFAM-TGAGTTCTCTTTTAACAGGATTCC-BHQ操作方法DNA在樣本處理區(qū)進(jìn)行。1.5mleppendorf200ul，1mlDNA25μLK，562h，10μLRNA，371h。200ul（10min。412000r/min、15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動(dòng)白色中間相）。10min。412000r/min、15min，用移液器小心吸去所有上清。1ml7548000r/min、10min，用移液器小心吸去所有上清，重5min。40μl～60μlTEDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｗ?：可采用經(jīng)驗(yàn)證的病毒DNA/RNA提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書提取DNA/RNA。RNARNARNA酶的。1.5mleppendorf200ulTRIzol1ml，充分混勻，室溫放10min。200ul（10min。413000r/min、15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動(dòng)白色中間相）。10min。413000r/min、15min，用槍小心吸去所有上清。1ml7548000r/min、10min，用槍小心吸去所有上清，重復(fù)此5min。40μl～60μlTERNA，-20℃保存?zhèn)溆?。?：可采用經(jīng)驗(yàn)證的病毒DNA/RNA提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書提取DNA/RNA。擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行，不區(qū)分DNA病毒和RNA病毒。PCR，2000r/min5sec；nPCRPCR11管陽性對照）；15μLPCR0.3μLTaqPCR15μL，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。加樣在樣品處理區(qū)進(jìn)行，分別向上述PCR管中加入樣本核酸提取步驟7.1中制備的DNA（或RNA）溶液各10μL，使總體積達(dá)25μL。蓋緊管蓋后，1000r/min離心30sec。PCR將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄PCR管擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：DNA502min；953min；第二階段，95℃15sec，60℃60sec404010sec階段每次循環(huán)的延伸時(shí)進(jìn)行。RNA45℃/15min；95℃/3min；第二階段，9515sec，6060sec404010sec；熒光收集在第二階段每次循環(huán)的延伸時(shí)進(jìn)行。結(jié)果判定結(jié)果分析條件的設(shè)定PCR儀，選定FAM(465-510)檢測通道讀取檢測結(jié)果，ABI儀器選擇FAM無熒光淬滅基團(tuán)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)TECt/CpCt/Cp28，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。結(jié)果判定Ct/Cp陽性：Ct/Cp30.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品為陽性。Ct/Cp30.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品建議復(fù)驗(yàn)。復(fù)驗(yàn)仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，判為陽性，否則判為陰性。廢棄物處理實(shí)驗(yàn)檢測過程中產(chǎn)生的廢棄物嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室生物安全管理的要求進(jìn)行處理并做好記錄。附錄A（規(guī)范性附錄）磷酸鹽緩沖生理鹽水配方所用試劑均為分析純以上。0.5mol/LTris-HClpH8.0)6.055gTris100mL80mL水，用濃HCl調(diào)節(jié)pH8.0，100mL，高壓滅菌后室溫保存待用。0.5mol/LEDTA（pH8.0）18.61gNa2EDTA?2H2O100mL80mL水，10NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH8.0100mL，高壓滅菌后室溫保存待用。10SDS10gSDS80mL100mL。儲存于滅菌過的容器中待用。5mol/LNaCl29.25gNaCl80mL100mL，高壓滅菌后室溫保存待用。0.5MTris-HCl（PH8.0）40mL，0.5MEDTA（pH8.0）5mL，5.0MNaCl10mL，SDS5mL100mL。20mg/mL蛋白酶K0.2g10，分裝后于-20℃保存。7575mL25mL水。TE0.5mL10mmolTris-HCl(