生物技術概論-細胞工程20141020課件

第?章細胞工程第一節(jié)細胞工程基礎一、細胞工程的概念細胞工程（cellengineering）是應用細胞生物學和分子生物學方法，在細胞水平上改造生物遺傳特性和生物學特性，以獲得特定的細胞、細胞產(chǎn)品或新生物體的技術。廣義的細胞工程包括所有的生物組織、器官及細胞離體操作和培養(yǎng)技術，狹義的細胞工程則是指細胞融合和細胞培養(yǎng)技術。二、細胞工程分類

根據(jù)研究對象不同，細胞工程可分為動物細胞工程、植物細胞工程和微生物細胞工程。

1、動物細胞工程包括：組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)；細胞融合技術；胚胎工程技術（核移植、胚胎分割等）；克隆技術（單細胞系克隆、器官克隆、個體克隆）

2、植物細胞工程包括：植物組織、器官培養(yǎng)技術；細胞培養(yǎng)技術；原生質體融合與培養(yǎng)技術；亞細胞水平的操作技術等。3、微生物細胞工程：微生物遺傳改良、創(chuàng)造。三、細胞工程基本技術1、無菌操作技術：保持材料、培養(yǎng)基、材料生長環(huán)境無菌的操作技術。2、細胞培養(yǎng)技術：細胞在體外無菌條件下的保存、生長和發(fā)育成新的個體的技術。3、細胞融合技術:使兩個及以上細胞細胞膜發(fā)生重排，細胞合并、遺傳物質重組的技術。4、細胞分離技術:獲得用于培養(yǎng)的單細胞方法。第二節(jié)植物細胞工程一、細胞工程在植物育種上的應用

1、快速獲得特殊倍性材料； 2、克服遠緣雜交不親和；3、克服雜種胚早期敗育； 4、轉基因材料培育5、植物種苗脫毒 6、特異材料快速繁殖

7、細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生產(chǎn)物 8、細胞突變體篩選9、植物種質資源保存 10、植物人工種子生產(chǎn)二、植物細胞工程操作的一般過程即從單個細胞到植物個體的過程：1、間接再生途徑(1)體細胞胚再生途徑細胞、組織、器官外植體愈傷組織體細胞胚芽或根根或芽完整植株(2)愈傷再生途徑細胞、組織、器官外植體愈傷組織芽或根根或芽完整植株2、直接器官再生途徑(細胞一般不可以)組織、器官外植體芽或根根或芽完整植株(一)直接(器官)再生途徑外植體在培養(yǎng)基上不經(jīng)過愈傷階段直接分化出根和芽形成新的個體。1、外植體：莖尖、莖段、葉柄、葉盤、有性胚2、再生模式：外植體→分化芽或根→分化根或芽→新植株

(二)間接(愈傷)再生途徑外植體在培養(yǎng)基上經(jīng)過愈傷后分化出根和芽形成新的個體。1、體細胞胚再生途徑(1)外植體：莖尖、莖段、葉柄、葉盤、有性胚、花粉、花藥、原生質體(2)再生模式：外植體→愈傷組織→體細胞胚→分化芽或根→分化根或芽→新植株2、愈傷組織再生途徑(1)外植體：莖尖、莖段、葉柄、葉盤、有性胚、花粉、花藥、原生質體(2)再生模式：外植體→愈傷組織→分化芽或根→分化根或芽→新植株

第四節(jié)原生質體融合與培養(yǎng)一、原生質體的概念·1、原生質體(protoplast)：指除去細胞壁的細胞或是一個被質膜所包圍的裸露細胞?！?、亞原生質體(subprotoplast)：丟失部分細胞內含物的原生質體。——核質體(nuclearplast)：由原生質膜和薄層細胞質包圍細胞核形成的亞原生質體?！|體（cytoplast）：不含細胞核而僅含有部分細胞質的亞原生質體。例：紫羅蘭原生質體酶法分離： 14日下胚軸： 1.2%Celluase(OnozukaR-10) +0.8%Macerozyme(OnozukaR-10) +3mmol/LMES +CPW-10mol/L處理約12h荔枝：４ｄ齡細胞 １３％的甘露醇預處理１ｈ，ＣＰＷ鹽 +１０％～１１％甘露醇、 +0.8％纖維素酶（celluaseR-10) +0.4%離析酶（MacereaseR-10) 混合酶液中分離。

五、原生質體培養(yǎng)方法1．主要影響因子(1)滲透壓滲透壓調節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。

原生質體的滲透壓原則：培養(yǎng)基與細胞滲透壓等滲。(2)通氣狀況(3)其他同組織培養(yǎng)2。培養(yǎng)方法·(1)液體淺層培養(yǎng)

·(2)固體培養(yǎng)

·(3)液體－固體雙層培養(yǎng)

·(4)瓊脂糖珠培養(yǎng)六、細胞融合1、定義：兩個去壁的細胞合二為一。2、融合方法 PEG誘導融合法 電融合法3、電融合的基本過程：——細胞膜的接觸：當原生質體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，原生質體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串；——膜的擊穿：原生質體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。4、融合方式根據(jù)融合后細胞物質來源，原生質體融合可分為兩大類：· 對稱融合（asymmetricfusion）： 即兩個完整的細胞原生質體融合。 非對稱融合（symmetricfusion）－利用物理或化學方法使某親本的核或細胞質失活后再進行融合 物理方法：射線處理 化學處理： 核失活：碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)； 質失活：羅丹明。5、融合細胞的發(fā)育動態(tài) (1)核質重組

核1+質1+核2+質2 核1+質1+核2 核1+核2+質2 核1+質1+質2 核2+質1+質2 核1+質2 質1+核27、融合細胞的選擇系統(tǒng) 外觀選擇：大小、形態(tài)、 互補選擇：aaBBAAbbAaBb 熒光標記選擇:染色能力差異 雜種植株的鑒定：長成植株后進行鑒定8．體細胞雜種的鑒定 形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學性狀觀察進行鑒定。

細胞學鑒定：細胞器鑒定、染色體鑒定。

生化鑒定：同功酶鑒定。

分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標記鑒定。9、體細胞雜種的應用潛力 植物育種中的核質替換

細胞質雜種的獲得

遠緣雜交創(chuàng)造新物種

細胞器的互作研究10、體細胞雜交面臨的困難 融合特性的高效性

雜種細胞的培養(yǎng)和選擇

雜種的遺傳穩(wěn)定性控制3．單倍體的應用潛力 ——用于獲得純合型材料 ——用于獲得特殊育種中間材料 ——用于誘變育種，可以提高誘變頻率 ——用于獲得細胞融合材料， ——作為基因工程受體，進行基因工程改良 ——用作基礎遺傳研究，確定各個基因功能二、花藥培養(yǎng)首先報道通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株成功的是印度學者Guha和Maheshwari(1964,1966)。目前已有250多種植物花藥培養(yǎng)成功?；ㄋ幣囵B(yǎng)的基本程序是：外植體選擇－外植體(花蕾)預處理—外植體消毒—剝取花藥—接種—誘導培養(yǎng)—分化培養(yǎng)3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基： MS； Nitsch； N6； B5。 附加成分：蔗糖；激素。4．花藥培養(yǎng)中單倍體形成的途徑

花藥壁(2n)、 藥隔(2n)、 花粉粒(n)三、花粉及小孢子培養(yǎng)1．取材時期的確定單核期:四分體、單核早期、單核晚期2．花粉或小孢子的分離花藥液體培養(yǎng)、擠壓花粉3．培養(yǎng)方法

花藥看護培養(yǎng)花粉液體懸浮培養(yǎng)固體-液體雙層培養(yǎng)第六節(jié)人工種子生產(chǎn)一、人工種子的概念

人工種子：（artificialseeds）又稱合成種子（syntheticseeds）或體細胞種子（somaticseeds）。指能夠發(fā)育成完整的植株的人工無性繁殖體。根據(jù)包被的需要程度可分為三類：——裸露的或休眠的繁殖體，如可以適當干燥的體細胞胚（如鴨毛草的體細胞胚）、休眠的微鱗莖和微塊莖等；——人工種皮包被的繁殖體，一些體細胞胚、原球莖等雖不能過度干燥，但只需人工種皮包被即可維持良好的發(fā)芽狀態(tài)，如胡蘿卜體細胞胚；——水凝膠包埋再包被人工種皮的繁殖體，大多數(shù)體細胞胚、不定芽、莖尖等均需要先包埋在半液態(tài)凝膠中，再經(jīng)人工種皮包裹才能避免失水，從而維持良好的發(fā)芽能力。完整的人工種子結構：

1、人工種皮 2、人工胚乳 3、繁殖體二、人工種子優(yōu)點：1、既能保持原有種性，又有實生苗的復壯效應；2、可以對優(yōu)異雜種種子不通過有性制種而獲得大量種子；3、對于一些不能正常產(chǎn)生種子的特殊植物材料如三倍體、非整倍體、基因工程植物等，有可能通過人工種子在短期內加大繁殖應用；4、節(jié)省制種用地，不受季節(jié)限制，工廠化生產(chǎn)，無毒；5、可自然萌發(fā)、生根，可以避免移栽困難，機械化操作，便于儲藏和運輸。三、人工種子繁殖體誘導1、體細胞胚誘導： 體細胞胚的誘導和形成需要經(jīng)過至少兩個階段： 第一階段，高生長素濃度的培養(yǎng)基誘導胚性細胞； 第二階段，較低生長素或無生長素的培養(yǎng)基中形成體細胞胚2、微芽誘導： 一般只需一個培養(yǎng)程序，但有時為了增加繁殖體的數(shù)量，也需進行一定次數(shù)的繼代。3、微型變態(tài)器官誘導： 需要經(jīng)過不同的誘導程序。四、人工種子包被1、繁殖體的預處理 ——體細胞胚適度脫水干燥和強制休眠；

——微型變態(tài)器官繁殖體表面消毒處理； ——芽為繁殖體的老化處理。2、包埋過程

海藻酸鈉作包埋介質的操作程序是： 在配制好的海藻酸鈉溶液中，按一定比例加入繁殖體并混勻，然后將其逐滴滴入2.0%～2.5%的CaCl2溶液中，經(jīng)20～30min的離子交換作用，即能形成含有繁殖體并具有一定剛性的小球珠（bead），再用水漂洗20min以終止反應。此時的人工種子是一種膠囊狀結構，將其晾干后可貯存或播種。

3、涂敷人工種皮理想的人工種皮應該是：封閉性：以保證人工胚乳的各種成分不易流失；透氣性：以保證繁殖體維持生理活性的需要；堅硬度：以加強人工種子的耐儲運性和適于機械化操作；無毒無害：對植物繁殖體無害。水溶與吸漲：能保證繁殖體順利吸水、穿透發(fā)芽。一、病毒在園藝植物上的危害病毒種類繁多，危害廣。如表植物種類病毒數(shù)植物種類病毒數(shù)植物種類病毒數(shù)菊花13矮牽牛5蘋果36康乃馨8馬鈴薯17葡萄26水仙4大蒜2櫻桃44唐菖蒲5草莓24無花果5風信子3豌豆15桃23月季10百合6梨11天竺葵5柑橘23第七節(jié)園藝植物脫毒危害植物的病毒:主要是靠無性繁殖的作物，在母株內逐代積累，危害日趨嚴重。危害：給作物生產(chǎn)帶來重大的損失。如產(chǎn)量嚴重降低，品質大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)10～18%?；ɑ苌喜《镜奈：Υ蟠笥绊懫溆^賞價值。植物病毒病的防治——防重于治和綜合防治1、選育抗病品種2、消滅傳毒昆蟲3、用莖尖脫毒技術培育無毒苗4、接種弱毒株來保護植物這是一種“給莊稼種牛痘”的方法。許多國家已可用此法來預防蕃茄花葉病。5、采用合理的栽培措施等6、藥物處理現(xiàn)在還沒有什么藥物可治愈受病毒侵染的植物。二、植物脫毒方法（一）熱處理法1發(fā)現(xiàn)1889年，印度尼西亞爪畦人發(fā)現(xiàn)，患枯萎病的甘蔗，放在50～52℃的熱水中保持30分鐘，甘蔗就生長良好。自1954年Kassanis用熱處理防治馬鈴薯卷葉病以后，這一技術即被用以防治許多植物的病毒病。2原理熱處理(theomtherapy)，原理是當植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中時，組織內部的病毒受熱之后部分或全部鈍化。3方法溫湯浸漬處理——適用于休眠器官、剪下的接穗或種植的材料，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時，方法簡便易行，但易使材料受傷。熱空氣處理——對活躍生長的莖尖效果較好，將生長的盆栽植株移入溫熱治療室(箱)內，一般在35-40℃。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達數(shù)月。4優(yōu)缺點優(yōu)點：對設備要求不高，技術簡單。缺陷：1）熱處理只能降低植株內病毒的含量，單獨處理難以獲得無毒材料；2）處理時間過長，會造成植株代謝紊亂，加大品種變異的可能性。生產(chǎn)上通常采用熱處理結合莖尖培養(yǎng)的方式，獲得較高的脫毒率。（二）莖尖培養(yǎng)脫毒1原理病毒在植株體內分布不均勻，隨植株部位及年齡而異。研究表明，在受病毒危害的植株中，在莖尖和根尖的分生組織中一般是無毒或僅含極低濃度的病毒粒子。越靠近莖頂端區(qū)域的感染深度越低，生長點(約0.1～1.0mm區(qū)域)則幾乎不含或含病毒很少。分生區(qū)域內無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞在旺盛分裂的細胞中，代謝活性高，病毒無法復制分生組織中可能存在活性較高的病毒鈍化系統(tǒng)莖尖中存在高水平內源生長素，可抑制病毒增殖3莖尖培養(yǎng)方法有適當光源的簡單解剖鏡(8—40倍)、一套解剖刀。在切取外植體之前一般須對莖芽進行表面消毒。剝離莖尖時，莖尖暴露的時間應當越短越好，以防莖尖變干。將接種好的莖尖置于22℃左右的溫度下。每天以16h，2000-30001x的光照條件下培養(yǎng)。在切取莖尖時越小越好，但太小則不易成活，過大又不能保證完全除去病毒。4影響微莖尖培養(yǎng)成功的因素外植體的生理狀態(tài)生長活躍的芽上。例菊花—頂芽；草莓無區(qū)別。外植體的大小培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件使用固體培養(yǎng)基；加少量的生長素或細胞分裂素；光培養(yǎng)比暗培養(yǎng)效果好香石竹脫毒的具體操作過和如下：（1）熱處理：將盆栽植株在36～38℃下處理2周，或在36℃16小時和38℃8小時處理共30天，光照為3000lx。（2）表面消毒：取葉腋間生出的側芽，先用自來水沖洗，用75%的酒精消毒30秒，2.5%次氯酸鈣或次氯酸鈉溶液處理15分鐘,無菌蒸餾水清洗4次,吸去多余水分。（3）莖尖剝離：用解剖針剝掉幼葉，直到只剩下2個最幼小的葉原基。（4）莖尖培養(yǎng)：用小刀片切下莖尖放入培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為25℃，光照16小時，光照強度為2000lx，平均兩周進行一次轉接，5～7周可獲得單個小植株。（三）其他途徑脫毒1.愈傷組織培養(yǎng)脫毒植物的器官和組織誘導產(chǎn)生愈傷組織，然后再分化產(chǎn)生芽，長成小植株，可以得到無病毒苗。產(chǎn)生無病毒植株的原因病毒的復制速度趕不上細胞增殖速度；通過細胞突變獲得抗病毒的抗性應用局限植株遺傳性不穩(wěn)定；有些植物的愈傷組織尚不能產(chǎn)生再生植株2．莖尖微體嫁接木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再從成年無病樹枝上切取0.4—1.0mm莖尖，在砧木上進行試管微體嫁接，以獲得無病毒幼苗。3.化學療法脫毒8—氮鳥嘌呤、2—硫脲嘧啶、殺稻瘟抗菌素、放線菌素D、慶大霉素等。如將100μg2-硫脲嘧啶加入培養(yǎng)基可除去煙草愈傷組織中的PVY(馬鈴薯病毒)。4.珠心組織培養(yǎng)脫毒柑橘、葡萄珠心組織與維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系。缺點：會有20—30%的變異，同時無毒苗苗期較長。三、病毒植物的鑒定指示植物法抗血清鑒定法電子顯微鏡檢查法酶聯(lián)血清免疫吸附反應鑒定法（一）指示植物法1指示植物——指接種某種病毒后能迅速表現(xiàn)特有癥狀的植物。只能鑒定靠汁液傳染的病毒。2指示植物法——利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的方法，也即為枯斑和空斑的測定法。3指示植物的要求（特點）1）應根據(jù)不同的病毒選擇適合的指示植物；2）所選擇的指示植物一年四季都容易栽培；3）在較長的時期內還能保持對病毒的敏感性；4）容易接種，而且在較廣的范圍內具有同樣反應。4指示植物種類1）接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，其病毒可擴展到植物非接種部位，通常沒有局部病斑；2）只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)狀病斑構成。5步驟接種時從被鑒定植物取1～3g幼葉，加磷酸緩沖液（pH7.0）在研缽中研碎；用兩層紗布過濾，在濾液中加入少量的500～600目金鋼砂摩擦指示植物的葉片，造成葉表受侵染；清水沖洗葉面，接種后的指示植物應在防蚜蟲溫室中。接種后2～6天可見到癥狀出現(xiàn)。（二）抗血清(antisemm)鑒定法1原理：植物病毒是核蛋白，因而是一種較好的抗原，給動物注射后會產(chǎn)生抗體，抗體與抗原的結合即為血清