鏡檢實(shí)驗(yàn)室技術(shù).課件

瘧疾鏡檢實(shí)驗(yàn)室技術(shù)

太和縣疾病預(yù)防控制中心

2012.5.20

血片制作、染色所需器材

1.載玻片：玻片使用前應(yīng)清洗干凈，以防血膜脫落。①新玻片應(yīng)先浸入有液態(tài)洗滌劑的清水中10~20分鐘，然后用干凈棉巾逐個(gè)擦拭，再用清水沖洗干凈，涼干，最后用干凈、柔軟的棉巾將玻片擦亮。②已用過的玻片應(yīng)先浸泡于洗滌劑溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小時(shí)，再移到新配置的洗滌劑溶液中1~2小時(shí)，逐個(gè)擦去玻片上舊的血膜痕跡，用清水漂洗干凈，再將玻片擦干擦亮。洗凈的玻片每10~20張用白紙包好放入塑料袋內(nèi)，保存于干燥環(huán)境中備用。血片制作所需器材2.采血針：使用一次性釆血針。3.75％乙醇棉球：用于采血前后的消毒。4.記號(hào)筆：用于玻片上書寫號(hào)碼。5.玻片盒：防止污染和蠅、蟲吸食血膜。6.無水甲醇：固定薄血膜。7.二甲苯或無水乙醇3份與乙醚7份的混合液：用于血片和鏡頭脫油。8.姬氏或瑞氏染液采血部位及取血方法

以耳垂采血較為合適，也可采手指末端血，嬰兒可從拇趾或足跟取血。。用75%酒精棉球消毒采血部位，待酒精干后，左手拇指和食指緊捏采血部位兩側(cè)，右手持一次性采血針迅速刺入1－2毫米深，輕輕擠出血滴，涂制血膜。厚、薄血膜的形狀和位置厚血膜的位置，位于玻片右1/3處。薄血膜寬2cm，長2.5cm.厚血膜外觀：圓形厚薄均勻，無劃痕。過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求。薄血膜位置：位于玻片1/2～1/3處。薄血膜外觀：舌狀厚薄均勻，無劃痕。呈輕微黃白色，可看到書報(bào)字體。厚、薄血膜的大小位置

每張載玻片上可做1個(gè)薄血膜和1個(gè)厚血膜，如圖標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片位置

厚血膜涂制方法取潔凈玻片2張，1張做載片，1張做推片，推片邊緣要光滑，載玻片放桌上，右手拇指和食指持推片二側(cè)，以推片左端下角刮取1小滴血(小火柴頭大?。?，在載玻片1/3處，涂成直徑0.8－1.0厘米厚血膜。涂畢后用干棉球擦凈耳垂上和推片上殘留血漬。

薄血膜涂制方法

以推片左端中部刮取1－1.5ul血液，然后將血液端推片平抵載玻片，略加實(shí)壓，使血液向兩側(cè)擴(kuò)展至約2cm寬時(shí)，使兩玻片保持25°一35°角，從右向左迅速推成薄血膜。推時(shí)速度快慢、血滴大小和角度均影響血膜的厚薄程度。最理想的薄血膜是一層血細(xì)胞，血細(xì)胞的分布排列比較均勻。無裂縫，無空隙。血片的編號(hào)待血膜自然干燥后，用鉛筆將受檢者號(hào)碼寫在薄血膜上，這樣號(hào)碼不易脫落。血片編號(hào)也可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行操作。血片的固定與厚膜溶血薄血膜先用無水甲醇或無水乙醇固定，厚血膜不能固定，即不能接觸甲醇或酒精。厚血膜可以直接用吉氏染色，不需要先溶血。但瑞氏染色，厚血膜一定要先溶血再染色間日瘧－采血的時(shí)間間日瘧什么時(shí)間檢查,都能查到瘧原蟲，但在發(fā)作數(shù)小時(shí)至十余小時(shí)后，瘧原蟲發(fā)育到大滋養(yǎng)體或裂殖體時(shí)更以查到。在患者發(fā)熱初期，查血往往可看到較多環(huán)狀體、裂殖體，也可見到大滋養(yǎng)體和配子體。間日瘧原蟲在患者剛發(fā)冷發(fā)熱后不久，大部是在小滋養(yǎng)體期，即環(huán)狀體期，故這一時(shí)期可能區(qū)別瘧原蟲種類是不太容易的。惡性瘧－采血的時(shí)間外周血惡性瘧原蟲可見到的環(huán)狀體和配子體。環(huán)狀體在外周血液中經(jīng)10幾個(gè)小時(shí)的發(fā)育后，逐漸隱匿于微血管、血竇等內(nèi)臟的毛細(xì)血管內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育成大滋養(yǎng)體及裂殖體，所以，這兩個(gè)時(shí)期在外周血液中一般不易見到。故較理想的取血時(shí)間，是在發(fā)作后的10－15小時(shí)。因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候，環(huán)狀滋養(yǎng)體發(fā)育到最高峰，但尚進(jìn)入內(nèi)臟毛細(xì)血管中發(fā)育。惡性瘧環(huán)狀體的數(shù)量與構(gòu)造，有助于瘧原蟲種類的鑒別。惡性瘧原蟲的配子體很易識(shí)別，但在初發(fā)時(shí)，一般需要在發(fā)作7－10日后才能在末稍血液中出現(xiàn)，應(yīng)當(dāng)注意。染色劑的選擇

瘧原蟲鏡檢常用的染色方法有吉氏染色和瑞氏染色，推薦使用吉氏染液。①吉氏染劑較適用于厚血膜和批量血膜的染色；②染色效果穩(wěn)定，吉氏染色后的血膜保存時(shí)間較長，瘧原蟲不宜退色。③吉氏染劑能長期保存而不變質(zhì)。④染色技術(shù)易掌握。染色方法固定薄血膜：要用甲醇或無水乙醇；瑞氏染色前厚血膜要溶血：用蒸餾水或清水溶血。

吉氏染色液的配制：取蒸餾水或緩沖液8ml加入吉氏染原液10~12滴，配成3%的稀釋液，混合均勻后，滴在厚、薄血膜上，染色20~30分鐘，然后水洗、晾干。吉氏稀釋液使用時(shí)間：最好0.5－1小時(shí)內(nèi)使用染色效果最好；使用最長時(shí)間不超過1天。8ml影響染色效果的因素血片染色好壞除與玻片是否清潔，血片制作質(zhì)量好壞有關(guān)外，還與下列因素有關(guān):1、染料和溶劑的質(zhì)量2、染液的新舊3、染液稀釋后的使用時(shí)間影響染色效果的因素4、染液的稀釋濃度。5、染色時(shí)間：根據(jù)染液質(zhì)量、新舊、濃度和氣溫6、染色用水PH7.0—7.27、沖洗血片時(shí)不能直接將染液倒掉血片制作的注意事項(xiàng)1.剛涂制的血膜要平放，注意防塵、防蟲。2.血膜應(yīng)自然干燥。切忌在毒太陽下曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。加熱會(huì)使原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果。3使用前載玻片一定要清潔，不然會(huì)影響血片制作和鏡檢結(jié)果。

4.配置母液時(shí)過濾可除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量。5.固定薄血膜時(shí)不要將甲醇觸碰到厚血膜。6.沖洗染液時(shí)，不要沖走厚血膜。

瘧原蟲血片制作質(zhì)量考核評(píng)分表項(xiàng)目檢查內(nèi)容評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果分值檢測(cè)結(jié)果分值檢測(cè)結(jié)果分值血片制作厚血膜（25分）血量（5分）4～5mm3（μl）5略多或略少3過多或過少1位置（5分）玻片右1/35稍偏右4偏右過多3直徑（5分）0.8～1.0cm50.7～0.8或1.0～1.2cm3<0.7或>1.2cm1外觀（10分）圓形厚膜均勻，邊緣整齊10圓形稍不均不整齊8厚薄不勻影響著色5薄血膜（25分）血量（5分）1～1.5mm3（μl）5略多或略少3過多或過少1位置（5分）玻片1/2～1/3處5稍偏右或偏左4偏右或偏左過多3直徑（5分）2.5～2.0cm5稍大或稍小3過多或過少1外觀（10分）舌狀厚薄均勻10舌狀稍不均5厚薄不勻呈波浪型3血片染色質(zhì)量（30分）外觀（10分）藍(lán)紫色10深藍(lán)色6紅色或灰白色4鏡下（20分）白細(xì)胞、瘧原蟲胞漿藍(lán)色，核紅色20染色過深，原蟲胞漿與核均呈深藍(lán)色16染色過淺，胞漿藍(lán)色不易顯見