基因個(gè)體化治療匯總課件

個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)與基因相關(guān)概念個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)與基因相關(guān)概念1人類(lèi)基因組計(jì)劃1990年正式啟動(dòng)人類(lèi)基因組測(cè)序計(jì)劃,2003年完成。

識(shí)別人類(lèi)基因組的所有大約3萬(wàn)個(gè)DNA測(cè)定組成人類(lèi)基因組DNA的約30億對(duì)核苷酸的序列人類(lèi)基因組計(jì)劃1990年正式啟動(dòng)人類(lèi)基因組測(cè)序計(jì)劃,2002個(gè)體化用藥—主要潮流，大勢(shì)所趨WHO：2000年提出，21世紀(jì)步入“3P”時(shí)代—預(yù)防（preventive），預(yù)測(cè)（predictable)和個(gè)體化（personal）美國(guó)FDA：2006全美3600萬(wàn)份用藥記錄中，880萬(wàn)份（24.3%）使用了說(shuō)明書(shū)中有基因組生物標(biāo)記信息的藥物。FDA：2013.12，已經(jīng)批準(zhǔn)超過(guò)200個(gè)需要患者基因信息指導(dǎo)才能準(zhǔn)確治療的藥物，涉及約40%的患者。三甲評(píng)審標(biāo)準(zhǔn)要求：進(jìn)行個(gè)體化給藥方案的研究與監(jiān)測(cè)個(gè)體化用藥—主要潮流，大勢(shì)所趨WHO：2000年提出，21世3Wewouldn’tthinkofbuyingshoesinasinglesize

我們不會(huì)愿意買(mǎi)只有一個(gè)尺碼的皮鞋Sowhyshouldwebesatisfiedwithone-size-fits-allmedicine?那為什么我們就滿(mǎn)足于千人一方呢？Wewouldn’tthinkofbuyingsh4據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)，各國(guó)住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率在10%至20%，其中5%的患者會(huì)因?yàn)閲?yán)重的藥品不良反應(yīng)而死亡。目前全世界死亡的病人中，約有1/3的患者死于用藥不當(dāng)，藥品不良反應(yīng)致死占社會(huì)人口死因的第4位。藥物毒性或不良反應(yīng)的發(fā)生往往是因?yàn)樗幬锓磻?yīng)的個(gè)體差異所致；個(gè)體差異使藥品的效果差異顯著。個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)的必要性據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)，各國(guó)住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率5個(gè)體化藥學(xué)臨床應(yīng)用的意義降低醫(yī)療事故發(fā)生率縮短平均住院日提高醫(yī)院收入為臨床用藥提供更精確的指導(dǎo)（精準(zhǔn)劑量,減少不良反應(yīng)，藥物相互作用等）個(gè)體化藥學(xué)臨床應(yīng)用的意義降低醫(yī)療事故發(fā)生率6療效好療效不好或無(wú)療效毒副反應(yīng)藥物反應(yīng)的個(gè)體差異相同藥物治療的一組人群基因?環(huán)境?藥物不良反應(yīng)藥物效應(yīng)療效好療效不好或無(wú)療效毒副反應(yīng)藥物反應(yīng)的個(gè)體差異相同藥物治療7據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)，各國(guó)住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率在10%至20%，其中5%的患者會(huì)因?yàn)閲?yán)重的藥品不良反應(yīng)而死亡。目前全世界死亡的病人中，約有1/3的患者死于用藥不當(dāng)，藥品不良反應(yīng)致死占社會(huì)人口死因的第4位。藥物毒性或不良反應(yīng)的發(fā)生往往是因?yàn)樗幬锓磻?yīng)的個(gè)體差異所致；個(gè)體差異使藥品的效果差異顯著。個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)的必要性據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)，各國(guó)住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率8相關(guān)藥物的劑量范圍各類(lèi)常用藥物的有效率常用藥物的有效率與劑量相關(guān)藥物的劑量范圍各類(lèi)常用藥物的有效率常用藥物的有效率與劑量90%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%基因環(huán)境因素II糖尿病乳腺癌男性心肌梗死原發(fā)性高血壓病冠心病I糖尿病苯妥英鋰水揚(yáng)酸異戊巴比妥雙香豆素阿司匹林安替匹林保泰松遺傳和非遺傳因素在藥物代謝中的作用藥物代謝及疾病，遺傳與非遺傳的影響0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%110新的醫(yī)學(xué)模式:個(gè)體化治療（PersonalizedTherapy）根據(jù)分子診斷提出治療方案診斷分子診斷-預(yù)測(cè)反應(yīng)治療理想反應(yīng)藥理學(xué)+基因組學(xué)新的醫(yī)學(xué)模式:診斷分子診斷-預(yù)測(cè)反應(yīng)治療理想反應(yīng)11基因個(gè)體化治療匯總課件12基因個(gè)體化治療匯總課件13基因個(gè)體化治療匯總課件14基因是載有特定生物遺傳信息的DNA分子片斷，人類(lèi)基因包括兩大區(qū)域:1.編碼區(qū)(占5%);2.側(cè)翼序列基因是載有特定生物遺傳信息的DNA分子片斷，人類(lèi)基因包括兩大15

DNA分子是由腺嘌呤（A）、胞嘧啶(C）、鳥(niǎo)嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T，DNA專(zhuān)有）和尿嘧啶（U，RNA專(zhuān)有）堿基排列組成,每個(gè)人都存在差異，將其稱(chēng)為多態(tài)性。人類(lèi)的基因發(fā)現(xiàn)幾百萬(wàn)由單一的堿基變換而形成的位點(diǎn)既SNP，它意味著個(gè)人間最小的遺傳差異。

A:腺嘌呤T:胸嘧啶G:鳥(niǎo)嘌呤C:胞嘧啶CGTTCTCTATTAACA……GCAAGAGATAATTGT……CGTGCTCTATTAACA……GCACGAGATAATTGT……藥物相關(guān)基因研究A:腺嘌呤CGTTCTCTATTAACA……CGTGCTC1610q24.2Chromosome10CYP2C9gene9Exon55kb490AA10q24.2CGTASNPCYP2C9*1NormalenzymaticactivityGAGGACCGTGTTCAAGluAspArgValGln5’3’CYP2C9*2NoenzymaticactivityT430C>T(Arg144Cys)Cys單核苷酸多態(tài)性（SNP）導(dǎo)致人類(lèi)遺傳易感性的重要因素導(dǎo)致人類(lèi)藥物代謝和反應(yīng)差異的重要因素GT突變野生型突變型10q24.2Chromosome10CYP2C9gen17變態(tài)反應(yīng)藥動(dòng)學(xué)代謝吸收、分布、排泄藥效學(xué)靶向結(jié)合作用免疫系統(tǒng)毒副作用治療作用藥物耐受藥物代謝酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白藥物靶蛋白、受體人類(lèi)白血球抗原藥物作用基因與藥物作用的關(guān)系原理基因蛋白合成舉例：抗癲癇藥丙戊酸鈉的相關(guān)代謝酶——CYP2C19其基因最主要的兩個(gè)突變位點(diǎn)

CYP2C19*2:第5外顯子681位G→ACYP2C19*3:第4外顯子636位G→A產(chǎn)生終止密碼，過(guò)早終止蛋白合成，產(chǎn)生無(wú)活性CYP2C19酶，降低對(duì)丙戊酸代謝，使其在體內(nèi)蓄積，發(fā)生毒副反應(yīng)18變態(tài)反應(yīng)藥動(dòng)學(xué)藥效學(xué)毒副作用藥物代謝酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白...CCATTGAC......CCATTGAC...…GGTAACTG...…GGTAACTG......CCATTGAC......CCGTTGAC...…GGTAACTG...…GGCAACTG......CCGTTGAC......CCGTTGAC...…GGCAACTG...…GGCAACTG...A/A野生型純合子單核苷酸多態(tài)性形成三種基因型和表型XXXA/a野生型雜合子a/a突變純合子高活性中活性低活性...CCATTGAC......CCA19GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人WildtypeMutationWildtypeConcentrationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450

相同的劑量不同的血漿濃度P450酶活性與PD/PK值的關(guān)系GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人Wildt20吸收-慢

-快受體-缺失-豐富代謝

-慢速-中等-快速-超快速排泄

-緩慢-正常藥物體內(nèi)過(guò)程)吸收藥物代謝酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)分布藥物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝藥物代謝酶排泄藥物轉(zhuǎn)運(yùn)藥物相關(guān)基因研究吸收受體代謝排泄21CYP450

主要存在于肝微粒體中,它的活性決定藥物的代謝速率,與藥物的清除率有著直接關(guān)系。CYP450酶系的基因主要有CYP1,CYP2,CYP3三家族,有以下幾種重要的P450酶:CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。藥物代謝酶CYP450主要存在于肝微粒體中,它的活性決定藥物的代22根據(jù)CYP2D6基因型調(diào)整抗抑郁藥劑量3839米帕明多慮平馬普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕羅西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM18213217480301288138174129928113217941811259811915292118138747593115135941161327084110130641159360148170523838%平均劑量根據(jù)CYP2D6基因型調(diào)整抗抑郁藥劑量3839米帕明多慮平馬23關(guān)于CYP2D6的表型判斷舉例：關(guān)于CYP2D6的表型判斷，CYP2D6屬于細(xì)胞色素P450酶常見(jiàn)藥物代謝酶基因型及表型判斷舉例：關(guān)于CYP2D6的表型判斷，CYP2D6屬于細(xì)胞色素P24Β1受體基因突變藥物計(jì)量調(diào)整Β1受體基因突變藥物計(jì)量調(diào)整25

美托洛爾，根據(jù)CYP2D6基因調(diào)整劑量26美托洛爾，根據(jù)CYP2D6基因調(diào)整劑量26高血脂藥物及硝酸甘油高血脂藥物及硝酸甘油27雌激素與兒童智商相關(guān)基因雌激素與兒童智商相關(guān)基因28【英國(guó)《每日郵報(bào)》網(wǎng)站3月23日?qǐng)?bào)道】科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種會(huì)增加兒童智商低下風(fēng)險(xiǎn)的基因。這個(gè)發(fā)現(xiàn)意味著，在新生兒出生后不久對(duì)其進(jìn)行一項(xiàng)基因檢測(cè)，可能會(huì)有助于發(fā)現(xiàn)存在上述問(wèn)題的嬰兒，甚至為應(yīng)對(duì)這一問(wèn)題確定治療方案做好準(zhǔn)備?？茖W(xué)家認(rèn)識(shí)到，如果7歲以下兒童在體內(nèi)出現(xiàn)一種常見(jiàn)基因變異體的同時(shí)，甲狀腺激素水平也出現(xiàn)下降，那么他們的智商變得異常低下的可能性將為其他兒童的4倍。每年約有4%的新生兒帶有這種基因，而且體內(nèi)的甲狀腺激素水平較低。給這些兒童服用含有甲狀腺激素的藥片，或許可以幫助其大腦正常發(fā)育并達(dá)到正常水平的智商。每年將會(huì)有3萬(wàn)名兒童因此受益。這項(xiàng)新研究的關(guān)注重點(diǎn)是與細(xì)胞內(nèi)甲狀腺激素的產(chǎn)生有關(guān)的Ⅱ型脫碘酶。研究人員此前已將這種酶的基因突變與包括糖尿病和高血壓在內(nèi)的其他健康問(wèn)題聯(lián)系在一起。在上述新研究中，加的夫大學(xué)和布里斯托爾大學(xué)的科學(xué)家對(duì)3123名7歲以下兒童的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。這些兒童也接受了智商測(cè)試。體內(nèi)甲狀腺激素水平較低且存在Ⅱ型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于85的可能性是其他兒童的4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問(wèn)題的兒童不會(huì)面臨更多智商低下的風(fēng)險(xiǎn)。加的夫大學(xué)的皮特·泰勒博士說(shuō)：“如果其他研究證實(shí)了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時(shí)進(jìn)行針對(duì)這種基因變異體的測(cè)試，將有助于識(shí)別出今后最有可能變得智商低下的那些兒童。”相關(guān)研究結(jié)果是在于利物浦召開(kāi)的英國(guó)內(nèi)分泌協(xié)會(huì)大會(huì)上發(fā)布的。

兒童DIO2基因突變導(dǎo)致智商低下的研究【英國(guó)《每日郵報(bào)》網(wǎng)站3月23日?qǐng)?bào)道】科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種會(huì)增加29在上述新研究中，加的夫大學(xué)和布里斯托爾大學(xué)的科學(xué)家對(duì)3123名7歲以下兒童的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。這些兒童也接受了智商測(cè)試。體內(nèi)甲狀腺激素水平較低且存在Ⅱ型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于85的可能性是其他兒童的4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問(wèn)題的兒童不會(huì)面臨更多智商低下的風(fēng)險(xiǎn)。加的夫大學(xué)的皮特·泰勒博士說(shuō)：“如果其他研究證實(shí)了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時(shí)進(jìn)行針對(duì)這種基因變異體的測(cè)試，將有助于識(shí)別出今后最有可能變得智商低下的那些兒童?！毕嚓P(guān)研究結(jié)果是在于利物浦召開(kāi)的英國(guó)內(nèi)分泌協(xié)會(huì)大會(huì)上發(fā)布的。

兒童DIO2基因突變導(dǎo)致智商低下的研究在上述新研究中，加的夫大學(xué)和布里斯托爾大學(xué)的科學(xué)家對(duì)312330本世紀(jì)，腫瘤的藥物治療取得了巨大成就。但腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性和腫瘤藥物治療的個(gè)體差異常造成腫瘤化療的失敗，且引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。個(gè)體藥物治療的藥效和毒性的差異在很大程度上受到遺傳因素如藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥物作用靶點(diǎn)等藥物相關(guān)基因的遺傳多態(tài)性的影響。所以抗惡性腫瘤藥臨床有效率為30-80%腫瘤個(gè)體化治療與基因檢測(cè)本世紀(jì)，腫瘤的藥物治療取得了巨大成就。但腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性31根據(jù)病人的遺傳特征,選擇最有效的疾病治療方法，更好地控制疾病的進(jìn)展甚至預(yù)防疾病的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)最佳的醫(yī)學(xué)治療效果。

在合適的時(shí)間(RightTime)給合適的病人(RightPatient)施行合適的治療(RightTreatment),達(dá)到腫瘤個(gè)體化治療腫瘤個(gè)體化治療與基因檢測(cè)根據(jù)病人的遺傳特征,選擇最有效的疾病治療方法，更好地控制32腫瘤個(gè)體化治療包括靶向治療和化療兩部分:靶向治療:通過(guò)實(shí)時(shí)定量、基因測(cè)序、FISH等技術(shù)檢測(cè)腫瘤患者基因拷貝及基因突變信息，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行靶向治療。個(gè)體化化療：通過(guò)實(shí)時(shí)定量、基因分型、mRNA定量等技術(shù)，檢測(cè)患者腫瘤標(biāo)本或血液標(biāo)本的mRNA表達(dá)、DNA的SNP分型，確定患者對(duì)化療藥物的敏感性和毒性反應(yīng)并確定化療劑量。腫瘤個(gè)體化治療與基因檢測(cè)腫瘤個(gè)體化治療包括靶向治療和化療兩部分:腫瘤個(gè)體化治療與基因33腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)與化療藥物腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)與化療藥物34突變基因與化療藥物突變基因與化療藥物35腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測(cè)腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測(cè)36果因PPT工作室/guoyinppt原位雜交技術(shù)

2014-03-19果因PPT工作室/guoyinppt原37原位雜交技術(shù)一原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展二原位雜交技術(shù)的原理及分類(lèi)三原位雜交技術(shù)的一般過(guò)程四原位雜交技術(shù)的應(yīng)用原位雜交技術(shù)一原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展二原位雜交技術(shù)38一、原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展

原位雜交技術(shù)(Insituhybridization，ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門(mén)新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。1969年美國(guó)耶魯大學(xué)的Gall等首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，將該基因進(jìn)行定位，與此同時(shí)Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是20世紀(jì)70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，為原位雜交技術(shù)的發(fā)展奠定了深厚的技術(shù)基礎(chǔ)。

一、原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展原位雜交技術(shù)(Insit39二、原位雜交技術(shù)的原理及分類(lèi)概念：原位雜交技術(shù)(Insituhybridization，ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織，細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。原理：利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專(zhuān)一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。二、原位雜交技術(shù)的原理及分類(lèi)概念：原位雜交技術(shù)(Ins40原位雜交法分類(lèi)1、基因組原位雜交技術(shù)基因組原位雜交(GISH)技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一種原位雜交技術(shù)。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當(dāng)?shù)臐舛茸鞣庾瑁诎腥旧w上進(jìn)行原位雜交。

2、熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是在已有的放射性

原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放

射性DNA分子原位雜交技術(shù)。它利用熒光標(biāo)記

的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切

片上的特異性雜交，通過(guò)熒光檢測(cè)系

統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測(cè)信號(hào)DNA序列在染色體或

DNA顯微切片上的目的DNA序列，進(jìn)而確定其雜

交位點(diǎn)。原位雜交法分類(lèi)1、基因組原位雜交技術(shù)413、多彩色熒光原位雜交技術(shù)多彩色熒光原位雜交(mFISH)是在熒

光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的

一種新技術(shù)，它用幾種不同顏色的熒

光素單獨(dú)或混合標(biāo)記的探針進(jìn)行原位

雜交，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶位，各靶位

在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，

呈現(xiàn)多種色彩。4、原位PCR原位PCR技術(shù)是常規(guī)的原位雜交技術(shù)與PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，即通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)靶核酸序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增使其拷貝數(shù)增加，然后通過(guò)原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)靶核酸序列進(jìn)行定性、定位和定量分析。原位雜交法分類(lèi)3、多彩色熒光原位雜交技術(shù)原位雜交法分類(lèi)42三、原位雜交技術(shù)的一般過(guò)程以經(jīng)過(guò)標(biāo)記的已知核酸分子為探針以細(xì)胞內(nèi)與探針序列互補(bǔ)的特異核酸分子為靶分子在一定條件下使探針與靶核酸分子在原位發(fā)生雜交再對(duì)其探測(cè)三、原位雜交技術(shù)的一般過(guò)程以經(jīng)過(guò)標(biāo)記的已知核酸分子為探針43探針標(biāo)記靶核酸分子雜交檢測(cè)探針標(biāo)記靶核酸分子雜交檢測(cè)44一）、探針

是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的DNA或RNA片段，是在原位雜交中用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定DNA或RNA順序定位的特殊試劑，探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結(jié)合上1、cDNA2、RNA3、寡核苷酸一）、探針是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的DNA或RNA片451、cDNA(complementaryDNA)互補(bǔ)于mRNA的DNA分子（長(zhǎng)度為數(shù)百-數(shù)千堿基對(duì)）⑴克隆于質(zhì)粒中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡⑵較穩(wěn)定，不易被降解⑶標(biāo)記方法可靠易行優(yōu)點(diǎn)1、cDNA互補(bǔ)于mRNA的DNA分子⑴克隆于質(zhì)粒中46優(yōu)點(diǎn)：⑴雜交效率比DNA探針高

⑵在檢測(cè)mRNA時(shí)所形成的RNA-mRNA雜交體比DNA-mRNA雜交體穩(wěn)定

⑶可以同時(shí)得到同義RNA鏈和反義RNA鏈缺點(diǎn)：2、RNA

RNA是單鏈分子（探針長(zhǎng)度50-300堿基對(duì)）容易受RNA酶的污染而被降解優(yōu)點(diǎn)：2、RNARNA是單鏈分子容易受47

這類(lèi)探針是根據(jù)靶分子而設(shè)計(jì)序列在DNA合成儀上用化學(xué)方法合成

優(yōu)點(diǎn)：形成雜交體快速（序列短鏈，雜交時(shí)易于穿透）

缺點(diǎn)：特異性較低（短鏈和簡(jiǎn)單）短鏈探針(長(zhǎng)度10-50個(gè)核苷酸)3、寡核苷酸這類(lèi)探針是根據(jù)靶分子而設(shè)計(jì)序列短鏈探針3、寡核48

二）、探針標(biāo)記1、標(biāo)記物

（1）放射性標(biāo)記物

（2）非放射性標(biāo)記物2、標(biāo)記方法

（1）DNA探針標(biāo)記

（2）RNA探針標(biāo)記

（3）寡核苷酸探針標(biāo)記

二）、探針標(biāo)記1、標(biāo)記物（1）放射性標(biāo)記物491、標(biāo)記物①高度靈敏性；②標(biāo)記物與核酸探針結(jié)合，應(yīng)絕對(duì)不能影響核酸探針與模板的結(jié)合能力及結(jié)合的特異性；③當(dāng)用酶促方法進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，應(yīng)對(duì)酶促活性（Km值）無(wú)多大影響，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性；④高度特異性；⑤較高的化學(xué)穩(wěn)定性，保存時(shí)間長(zhǎng)，標(biāo)記及檢測(cè)方法簡(jiǎn)單；⑥對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)人體無(wú)損傷；⑦價(jià)格低廉等。1、標(biāo)記物①高度靈敏性；50標(biāo)記物分類(lèi)放射性標(biāo)記物：同位素35S、33P、32P和3H等非放射性標(biāo)記物：熒光素生物素地高辛

溴脫氧尿嘧啶等標(biāo)記分子：某種單核苷酸在單核苷酸分子中導(dǎo)入某個(gè)原子、功能基團(tuán)或側(cè)鏈分子作為標(biāo)記物，對(duì)堿基配對(duì)不造成影響標(biāo)記物分類(lèi)放射性標(biāo)記物：同位素35S、33P、32P和51標(biāo)記分子：放射性標(biāo)記分子：

35S-UTP35S-dATP

35S-dCTP

32P-UTP32P-dATP等等非放射性標(biāo)記分子：

四甲基羅達(dá)明-UTP

生物素-UTP(Bio-UTP)

地高辛-dUTP(Dig-dUTP)

溴脫氧尿嘧啶本身為標(biāo)記分子標(biāo)記分子：522、標(biāo)記方法（1）DNA探針標(biāo)記

切口移位法隨機(jī)引物法（2）RNA探針標(biāo)記

在體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)中與探針制備同時(shí)完成（3）寡核苷酸探針標(biāo)記

末端轉(zhuǎn)移法將放射性或非放射性的標(biāo)記分子在各種酶促反應(yīng)中參入探針?lè)肿?、標(biāo)記方法（1）DNA探針標(biāo)記將放射性或非放射性的標(biāo)記分子53切口平移法切口平移法54隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法55

三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：指所要探測(cè)的核酸分子或核苷酸序列（DNA或RNA）

DNA——可以是中期染色體上的或是間期細(xì)胞核內(nèi)的，也可以是線(xiàn)粒體DNA或病毒DNARNA——可以是編碼細(xì)胞合成的任何蛋白質(zhì)分子的mRNA，也可以是核糖體rRNA線(xiàn)粒體或病毒RNA三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：56四）、雜交

1.雜交體

2.雜交條件

3.嚴(yán)格度的概念四）、雜交571、雜交體hybrids

DNA-DNADNA-RNARNA-RNA穩(wěn)定性依次是：DNA-DNA＜DNA-RNA＜RNA-RNA1、雜交體hybrids58DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性DNA-DNA變性復(fù)性592、雜交條件（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（5）時(shí)間（1）、雜交液

①鈉鹽（雜交效率↑非特異反應(yīng)↓）②甲酰胺（使雜交所需溫度降低裂解紅細(xì)胞）

③硫酸葡聚糖（提高探針濃度）

④牛血清白蛋白和載體DNA等（阻斷探針與組織非特異結(jié)合，↓背景）2、雜交條件（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH60雜交條件

（2）、探針濃度

探針濃度影響雜交反應(yīng)的速度

放射性標(biāo)記探針0.5μg/ml非放射性為2μg/ml最適宜的探針濃度要經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索得到確定（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（5）時(shí)間雜交條件

（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH61雜交條件（3）、溫度雜交時(shí)溫度一般低于相應(yīng)雜交體的Tm值25℃Tm值：是核酸的融解溫度，是一半雙鏈分子解鏈時(shí)的溫度）

當(dāng)雜交液含50%甲酰胺、鹽濃度0.75mol/L左右時(shí)雜交溫度：對(duì)DNA探針是42℃對(duì)RNA探針是50-55℃對(duì)寡核苷酸探針是37℃1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（5）時(shí)間雜交條件1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（562雜交條件（4）、PH

pH在5-9范圍內(nèi)，雜交體形成不受影響

常用緩沖液pH為6.5-7.5（5）、時(shí)間一般探針濃度下，雜交反應(yīng)在4-6小時(shí)內(nèi)完成孵育6小時(shí)后-雜交信號(hào)不再增強(qiáng)反應(yīng)超過(guò)24小時(shí)后-已形成的雜交體可能發(fā)生解鏈，雜交信號(hào)反而減弱（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（5）時(shí)間雜交條件（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（63五）、雜交體的探測(cè)使標(biāo)記的雜交體在光鏡或電鏡下可見(jiàn)（一）放射自顯影方法（二）免疫細(xì)胞化學(xué)方法五）、雜交體的探測(cè)64（一）、放射自顯影方法方法：切片上涂覆核子乳膠膜

置于暗盒中于4℃干燥處自顯影

經(jīng)顯影和定影后在顯微鏡下觀察銀粒

在細(xì)胞和細(xì)胞器的分布情況用同位素標(biāo)記探針來(lái)顯示雜交反應(yīng)的方法（一）、放射自顯影方法用同位素標(biāo)記探針來(lái)顯示雜交反應(yīng)的方法65基因個(gè)體化治療匯總課件66（二）、免疫細(xì)胞化學(xué)方法報(bào)告分子（reportermolecules）在雜交后探測(cè)技術(shù)中，為顯

示探針標(biāo)記物而使用的免疫細(xì)胞

化學(xué)標(biāo)記物常被叫做報(bào)告分子即與抗體（或親和素、A蛋白、）聯(lián)結(jié)，最終在顯微鏡下可見(jiàn)的分子：熒光素膠體金酶—-過(guò)氧化物酶-H2O2和DAB堿性磷酸酶-NBT/BCIP※用地高辛標(biāo)記的探針用熒光素、膠體金、酶標(biāo)記抗地高辛抗體來(lái)顯示依據(jù)免疫細(xì)胞化學(xué)原理用直接法或間接法來(lái)顯示探針標(biāo)記物（二）、免疫細(xì)胞化學(xué)方法報(bào)告分子（reportermole67四、原位雜交技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞特異mRNA轉(zhuǎn)錄的定位，用于基因圖譜、基因表達(dá)和基因組進(jìn)化的研究。感染組織中病毒DNA/RNA的檢測(cè)和定位。癌基因、抑癌基因和各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)和變化的檢測(cè)?；蛟谌旧w上的定位和檢測(cè)染色體序列確定染色體核型。間期細(xì)胞遺傳學(xué)的研究疾病的基因變化的研究四、原位雜交技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞特異mRNA轉(zhuǎn)錄的定位，用于基因圖68探針雜交采集標(biāo)本提取基因組DNA/RNAPCR擴(kuò)增顯色/掃描電泳檢測(cè)純化PCR產(chǎn)物基因芯片焦磷酸測(cè)序雙脫氧標(biāo)記毛細(xì)管電泳焦磷酸測(cè)序雙脫氧測(cè)序RT-PCR實(shí)時(shí)熒光PCR采集標(biāo)本標(biāo)本預(yù)處理雜交測(cè)序個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)平臺(tái)出現(xiàn)污染的高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié)低風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié)探針雜交采集標(biāo)本提取基因組PCR擴(kuò)增顯色/掃描電泳檢測(cè)純化P69thanksthanks70個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)與基因相關(guān)概念個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)與基因相關(guān)概念71人類(lèi)基因組計(jì)劃1990年正式啟動(dòng)人類(lèi)基因組測(cè)序計(jì)劃,2003年完成。

識(shí)別人類(lèi)基因組的所有大約3萬(wàn)個(gè)DNA測(cè)定組成人類(lèi)基因組DNA的約30億對(duì)核苷酸的序列人類(lèi)基因組計(jì)劃1990年正式啟動(dòng)人類(lèi)基因組測(cè)序計(jì)劃,20072個(gè)體化用藥—主要潮流，大勢(shì)所趨WHO：2000年提出，21世紀(jì)步入“3P”時(shí)代—預(yù)防（preventive），預(yù)測(cè)（predictable)和個(gè)體化（personal）美國(guó)FDA：2006全美3600萬(wàn)份用藥記錄中，880萬(wàn)份（24.3%）使用了說(shuō)明書(shū)中有基因組生物標(biāo)記信息的藥物。FDA：2013.12，已經(jīng)批準(zhǔn)超過(guò)200個(gè)需要患者基因信息指導(dǎo)才能準(zhǔn)確治療的藥物，涉及約40%的患者。三甲評(píng)審標(biāo)準(zhǔn)要求：進(jìn)行個(gè)體化給藥方案的研究與監(jiān)測(cè)個(gè)體化用藥—主要潮流，大勢(shì)所趨WHO：2000年提出，21世73Wewouldn’tthinkofbuyingshoesinasinglesize

我們不會(huì)愿意買(mǎi)只有一個(gè)尺碼的皮鞋Sowhyshouldwebesatisfiedwithone-size-fits-allmedicine?那為什么我們就滿(mǎn)足于千人一方呢？Wewouldn’tthinkofbuyingsh74據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)，各國(guó)住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率在10%至20%，其中5%的患者會(huì)因?yàn)閲?yán)重的藥品不良反應(yīng)而死亡。目前全世界死亡的病人中，約有1/3的患者死于用藥不當(dāng)，藥品不良反應(yīng)致死占社會(huì)人口死因的第4位。藥物毒性或不良反應(yīng)的發(fā)生往往是因?yàn)樗幬锓磻?yīng)的個(gè)體差異所致；個(gè)體差異使藥品的效果差異顯著。個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)的必要性據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)，各國(guó)住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率75個(gè)體化藥學(xué)臨床應(yīng)用的意義降低醫(yī)療事故發(fā)生率縮短平均住院日提高醫(yī)院收入為臨床用藥提供更精確的指導(dǎo)（精準(zhǔn)劑量,減少不良反應(yīng)，藥物相互作用等）個(gè)體化藥學(xué)臨床應(yīng)用的意義降低醫(yī)療事故發(fā)生率76療效好療效不好或無(wú)療效毒副反應(yīng)藥物反應(yīng)的個(gè)體差異相同藥物治療的一組人群基因?環(huán)境?藥物不良反應(yīng)藥物效應(yīng)療效好療效不好或無(wú)療效毒副反應(yīng)藥物反應(yīng)的個(gè)體差異相同藥物治療77據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)，各國(guó)住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率在10%至20%，其中5%的患者會(huì)因?yàn)閲?yán)重的藥品不良反應(yīng)而死亡。目前全世界死亡的病人中，約有1/3的患者死于用藥不當(dāng)，藥品不良反應(yīng)致死占社會(huì)人口死因的第4位。藥物毒性或不良反應(yīng)的發(fā)生往往是因?yàn)樗幬锓磻?yīng)的個(gè)體差異所致；個(gè)體差異使藥品的效果差異顯著。個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)的必要性據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)，各國(guó)住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率78相關(guān)藥物的劑量范圍各類(lèi)常用藥物的有效率常用藥物的有效率與劑量相關(guān)藥物的劑量范圍各類(lèi)常用藥物的有效率常用藥物的有效率與劑量790%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%基因環(huán)境因素II糖尿病乳腺癌男性心肌梗死原發(fā)性高血壓病冠心病I糖尿病苯妥英鋰水揚(yáng)酸異戊巴比妥雙香豆素阿司匹林安替匹林保泰松遺傳和非遺傳因素在藥物代謝中的作用藥物代謝及疾病，遺傳與非遺傳的影響0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%180新的醫(yī)學(xué)模式:個(gè)體化治療（PersonalizedTherapy）根據(jù)分子診斷提出治療方案診斷分子診斷-預(yù)測(cè)反應(yīng)治療理想反應(yīng)藥理學(xué)+基因組學(xué)新的醫(yī)學(xué)模式:診斷分子診斷-預(yù)測(cè)反應(yīng)治療理想反應(yīng)81基因個(gè)體化治療匯總課件82基因個(gè)體化治療匯總課件83基因個(gè)體化治療匯總課件84基因是載有特定生物遺傳信息的DNA分子片斷，人類(lèi)基因包括兩大區(qū)域:1.編碼區(qū)(占5%);2.側(cè)翼序列基因是載有特定生物遺傳信息的DNA分子片斷，人類(lèi)基因包括兩大85

DNA分子是由腺嘌呤（A）、胞嘧啶(C）、鳥(niǎo)嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T，DNA專(zhuān)有）和尿嘧啶（U，RNA專(zhuān)有）堿基排列組成,每個(gè)人都存在差異，將其稱(chēng)為多態(tài)性。人類(lèi)的基因發(fā)現(xiàn)幾百萬(wàn)由單一的堿基變換而形成的位點(diǎn)既SNP，它意味著個(gè)人間最小的遺傳差異。

A:腺嘌呤T:胸嘧啶G:鳥(niǎo)嘌呤C:胞嘧啶CGTTCTCTATTAACA……GCAAGAGATAATTGT……CGTGCTCTATTAACA……GCACGAGATAATTGT……藥物相關(guān)基因研究A:腺嘌呤CGTTCTCTATTAACA……CGTGCTC8610q24.2Chromosome10CYP2C9gene9Exon55kb490AA10q24.2CGTASNPCYP2C9*1NormalenzymaticactivityGAGGACCGTGTTCAAGluAspArgValGln5’3’CYP2C9*2NoenzymaticactivityT430C>T(Arg144Cys)Cys單核苷酸多態(tài)性（SNP）導(dǎo)致人類(lèi)遺傳易感性的重要因素導(dǎo)致人類(lèi)藥物代謝和反應(yīng)差異的重要因素GT突變野生型突變型10q24.2Chromosome10CYP2C9gen87變態(tài)反應(yīng)藥動(dòng)學(xué)代謝吸收、分布、排泄藥效學(xué)靶向結(jié)合作用免疫系統(tǒng)毒副作用治療作用藥物耐受藥物代謝酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白藥物靶蛋白、受體人類(lèi)白血球抗原藥物作用基因與藥物作用的關(guān)系原理基因蛋白合成舉例：抗癲癇藥丙戊酸鈉的相關(guān)代謝酶——CYP2C19其基因最主要的兩個(gè)突變位點(diǎn)

CYP2C19*2:第5外顯子681位G→ACYP2C19*3:第4外顯子636位G→A產(chǎn)生終止密碼，過(guò)早終止蛋白合成，產(chǎn)生無(wú)活性CYP2C19酶，降低對(duì)丙戊酸代謝，使其在體內(nèi)蓄積，發(fā)生毒副反應(yīng)88變態(tài)反應(yīng)藥動(dòng)學(xué)藥效學(xué)毒副作用藥物代謝酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白...CCATTGAC......CCATTGAC...…GGTAACTG...…GGTAACTG......CCATTGAC......CCGTTGAC...…GGTAACTG...…GGCAACTG......CCGTTGAC......CCGTTGAC...…GGCAACTG...…GGCAACTG...A/A野生型純合子單核苷酸多態(tài)性形成三種基因型和表型XXXA/a野生型雜合子a/a突變純合子高活性中活性低活性...CCATTGAC......CCA89GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人WildtypeMutationWildtypeConcentrationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450

相同的劑量不同的血漿濃度P450酶活性與PD/PK值的關(guān)系GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人Wildt90吸收-慢

-快受體-缺失-豐富代謝

-慢速-中等-快速-超快速排泄

-緩慢-正常藥物體內(nèi)過(guò)程)吸收藥物代謝酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)分布藥物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝藥物代謝酶排泄藥物轉(zhuǎn)運(yùn)藥物相關(guān)基因研究吸收受體代謝排泄91CYP450

主要存在于肝微粒體中,它的活性決定藥物的代謝速率,與藥物的清除率有著直接關(guān)系。CYP450酶系的基因主要有CYP1,CYP2,CYP3三家族,有以下幾種重要的P450酶:CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。藥物代謝酶CYP450主要存在于肝微粒體中,它的活性決定藥物的代92根據(jù)CYP2D6基因型調(diào)整抗抑郁藥劑量3839米帕明多慮平馬普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕羅西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM18213217480301288138174129928113217941811259811915292118138747593115135941161327084110130641159360148170523838%平均劑量根據(jù)CYP2D6基因型調(diào)整抗抑郁藥劑量3839米帕明多慮平馬93關(guān)于CYP2D6的表型判斷舉例：關(guān)于CYP2D6的表型判斷，CYP2D6屬于細(xì)胞色素P450酶常見(jiàn)藥物代謝酶基因型及表型判斷舉例：關(guān)于CYP2D6的表型判斷，CYP2D6屬于細(xì)胞色素P94Β1受體基因突變藥物計(jì)量調(diào)整Β1受體基因突變藥物計(jì)量調(diào)整95

美托洛爾，根據(jù)CYP2D6基因調(diào)整劑量96美托洛爾，根據(jù)CYP2D6基因調(diào)整劑量26高血脂藥物及硝酸甘油高血脂藥物及硝酸甘油97雌激素與兒童智商相關(guān)基因雌激素與兒童智商相關(guān)基因98【英國(guó)《每日郵報(bào)》網(wǎng)站3月23日?qǐng)?bào)道】科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種會(huì)增加兒童智商低下風(fēng)險(xiǎn)的基因。這個(gè)發(fā)現(xiàn)意味著，在新生兒出生后不久對(duì)其進(jìn)行一項(xiàng)基因檢測(cè)，可能會(huì)有助于發(fā)現(xiàn)存在上述問(wèn)題的嬰兒，甚至為應(yīng)對(duì)這一問(wèn)題確定治療方案做好準(zhǔn)備。科學(xué)家認(rèn)識(shí)到，如果7歲以下兒童在體內(nèi)出現(xiàn)一種常見(jiàn)基因變異體的同時(shí)，甲狀腺激素水平也出現(xiàn)下降，那么他們的智商變得異常低下的可能性將為其他兒童的4倍。每年約有4%的新生兒帶有這種基因，而且體內(nèi)的甲狀腺激素水平較低。給這些兒童服用含有甲狀腺激素的藥片，或許可以幫助其大腦正常發(fā)育并達(dá)到正常水平的智商。每年將會(huì)有3萬(wàn)名兒童因此受益。這項(xiàng)新研究的關(guān)注重點(diǎn)是與細(xì)胞內(nèi)甲狀腺激素的產(chǎn)生有關(guān)的Ⅱ型脫碘酶。研究人員此前已將這種酶的基因突變與包括糖尿病和高血壓在內(nèi)的其他健康問(wèn)題聯(lián)系在一起。在上述新研究中，加的夫大學(xué)和布里斯托爾大學(xué)的科學(xué)家對(duì)3123名7歲以下兒童的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。這些兒童也接受了智商測(cè)試。體內(nèi)甲狀腺激素水平較低且存在Ⅱ型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于85的可能性是其他兒童的4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問(wèn)題的兒童不會(huì)面臨更多智商低下的風(fēng)險(xiǎn)。加的夫大學(xué)的皮特·泰勒博士說(shuō)：“如果其他研究證實(shí)了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時(shí)進(jìn)行針對(duì)這種基因變異體的測(cè)試，將有助于識(shí)別出今后最有可能變得智商低下的那些兒童?！毕嚓P(guān)研究結(jié)果是在于利物浦召開(kāi)的英國(guó)內(nèi)分泌協(xié)會(huì)大會(huì)上發(fā)布的。

兒童DIO2基因突變導(dǎo)致智商低下的研究【英國(guó)《每日郵報(bào)》網(wǎng)站3月23日?qǐng)?bào)道】科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種會(huì)增加99在上述新研究中，加的夫大學(xué)和布里斯托爾大學(xué)的科學(xué)家對(duì)3123名7歲以下兒童的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。這些兒童也接受了智商測(cè)試。體內(nèi)甲狀腺激素水平較低且存在Ⅱ型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于85的可能性是其他兒童的4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問(wèn)題的兒童不會(huì)面臨更多智商低下的風(fēng)險(xiǎn)。加的夫大學(xué)的皮特·泰勒博士說(shuō)：“如果其他研究證實(shí)了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時(shí)進(jìn)行針對(duì)這種基因變異體的測(cè)試，將有助于識(shí)別出今后最有可能變得智商低下的那些兒童?！毕嚓P(guān)研究結(jié)果是在于利物浦召開(kāi)的英國(guó)內(nèi)分泌協(xié)會(huì)大會(huì)上發(fā)布的。

兒童DIO2基因突變導(dǎo)致智商低下的研究在上述新研究中，加的夫大學(xué)和布里斯托爾大學(xué)的科學(xué)家對(duì)3123100本世紀(jì)，腫瘤的藥物治療取得了巨大成就。但腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性和腫瘤藥物治療的個(gè)體差異常造成腫瘤化療的失敗，且引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。個(gè)體藥物治療的藥效和毒性的差異在很大程度上受到遺傳因素如藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥物作用靶點(diǎn)等藥物相關(guān)基因的遺傳多態(tài)性的影響。所以抗惡性腫瘤藥臨床有效率為30-80%腫瘤個(gè)體化治療與基因檢測(cè)本世紀(jì)，腫瘤的藥物治療取得了巨大成就。但腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性101根據(jù)病人的遺傳特征,選擇最有效的疾病治療方法，更好地控制疾病的進(jìn)展甚至預(yù)防疾病的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)最佳的醫(yī)學(xué)治療效果。

在合適的時(shí)間(RightTime)給合適的病人(RightPatient)施行合適的治療(RightTreatment),達(dá)到腫瘤個(gè)體化治療腫瘤個(gè)體化治療與基因檢測(cè)根據(jù)病人的遺傳特征,選擇最有效的疾病治療方法，更好地控制102腫瘤個(gè)體化治療包括靶向治療和化療兩部分:靶向治療:通過(guò)實(shí)時(shí)定量、基因測(cè)序、FISH等技術(shù)檢測(cè)腫瘤患者基因拷貝及基因突變信息，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行靶向治療。個(gè)體化化療：通過(guò)實(shí)時(shí)定量、基因分型、mRNA定量等技術(shù)，檢測(cè)患者腫瘤標(biāo)本或血液標(biāo)本的mRNA表達(dá)、DNA的SNP分型，確定患者對(duì)化療藥物的敏感性和毒性反應(yīng)并確定化療劑量。腫瘤個(gè)體化治療與基因檢測(cè)腫瘤個(gè)體化治療包括靶向治療和化療兩部分:腫瘤個(gè)體化治療與基因103腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)與化療藥物腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)與化療藥物104突變基因與化療藥物突變基因與化療藥物105腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測(cè)腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測(cè)106果因PPT工作室/guoyinppt原位雜交技術(shù)

2014-03-19果因PPT工作室/guoyinppt原107原位雜交技術(shù)一原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展二原位雜交技術(shù)的原理及分類(lèi)三原位雜交技術(shù)的一般過(guò)程四原位雜交技術(shù)的應(yīng)用原位雜交技術(shù)一原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展二原位雜交技術(shù)108一、原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展

原位雜交技術(shù)(Insituhybridization，ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門(mén)新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。1969年美國(guó)耶魯大學(xué)的Gall等首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，將該基因進(jìn)行定位，與此同時(shí)Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是20世紀(jì)70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，為原位雜交技術(shù)的發(fā)展奠定了深厚的技術(shù)基礎(chǔ)。

一、原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展原位雜交技術(shù)(Insit109二、原位雜交技術(shù)的原理及分類(lèi)概念：原位雜交技術(shù)(Insituhybridization，ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織，細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。原理：利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專(zhuān)一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。二、原位雜交技術(shù)的原理及分類(lèi)概念：原位雜交技術(shù)(Ins110原位雜交法分類(lèi)1、基因組原位雜交技術(shù)基因組原位雜交(GISH)技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一種原位雜交技術(shù)。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當(dāng)?shù)臐舛茸鞣庾瑁诎腥旧w上進(jìn)行原位雜交。

2、熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是在已有的放射性

原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放

射性DNA分子原位雜交技術(shù)。它利用熒光標(biāo)記

的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切

片上的特異性雜交，通過(guò)熒光檢測(cè)系

統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測(cè)信號(hào)DNA序列在染色體或

DNA顯微切片上的目的DNA序列，進(jìn)而確定其雜

交位點(diǎn)。原位雜交法分類(lèi)1、基因組原位雜交技術(shù)1113、多彩色熒光原位雜交技術(shù)多彩色熒光原位雜交(mFISH)是在熒

光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的

一種新技術(shù)，它用幾種不同顏色的熒

光素單獨(dú)或混合標(biāo)記的探針進(jìn)行原位

雜交，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶位，各靶位

在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，

呈現(xiàn)多種色彩。4、原位PCR原位PCR技術(shù)是常規(guī)的原位雜交技術(shù)與PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，即通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)靶核酸序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增使其拷貝數(shù)增加，然后通過(guò)原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)靶核酸序列進(jìn)行定性、定位和定量分析。原位雜交法分類(lèi)3、多彩色熒光原位雜交技術(shù)原位雜交法分類(lèi)112三、原位雜交技術(shù)的一般過(guò)程以經(jīng)過(guò)標(biāo)記的已知核酸分子為探針以細(xì)胞內(nèi)與探針序列互補(bǔ)的特異核酸分子為靶分子在一定條件下使探針與靶核酸分子在原位發(fā)生雜交再對(duì)其探測(cè)三、原位雜交技術(shù)的一般過(guò)程以經(jīng)過(guò)標(biāo)記的已知核酸分子為探針113探針標(biāo)記靶核酸分子雜交檢測(cè)探針標(biāo)記靶核酸分子雜交檢測(cè)114一）、探針

是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的DNA或RNA片段，是在原位雜交中用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定DNA或RNA順序定位的特殊試劑，探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結(jié)合上1、cDNA2、RNA3、寡核苷酸一）、探針是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的DNA或RNA片1151、cDNA(complementaryDNA)互補(bǔ)于mRNA的DNA分子（長(zhǎng)度為數(shù)百-數(shù)千堿基對(duì)）⑴克隆于質(zhì)粒中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡⑵較穩(wěn)定，不易被降解⑶標(biāo)記方法可靠易行優(yōu)點(diǎn)1、cDNA互補(bǔ)于mRNA的DNA分子⑴克隆于質(zhì)粒中116優(yōu)點(diǎn)：⑴雜交效率比DNA探針高

⑵在檢測(cè)mRNA時(shí)所形成的RNA-mRNA雜交體比DNA-mRNA雜交體穩(wěn)定

⑶可以同時(shí)得到同義RNA鏈和反義RNA鏈缺點(diǎn)：2、RNA

RNA是單鏈分子（探針長(zhǎng)度50-300堿基對(duì)）容易受RNA酶的污染而被降解優(yōu)點(diǎn)：2、RNARNA是單鏈分子容易受117

這類(lèi)探針是根據(jù)靶分子而設(shè)計(jì)序列在DNA合成儀上用化學(xué)方法合成

優(yōu)點(diǎn)：形成雜交體快速（序列短鏈，雜交時(shí)易于穿透）

缺點(diǎn)：特異性較低（短鏈和簡(jiǎn)單）短鏈探針(長(zhǎng)度10-50個(gè)核苷酸)3、寡核苷酸這類(lèi)探針是根據(jù)靶分子而設(shè)計(jì)序列短鏈探針3、寡核118

二）、探針標(biāo)記1、標(biāo)記物

（1）放射性標(biāo)記物

（2）非放射性標(biāo)記物2、標(biāo)記方法

（1）DNA探針標(biāo)記

（2）RNA探針標(biāo)記

（3）寡核苷酸探針標(biāo)記

二）、探針標(biāo)記1、標(biāo)記物（1）放射性標(biāo)記物1191、標(biāo)記物①高度靈敏性；②標(biāo)記物與核酸探針結(jié)合，應(yīng)絕對(duì)不能影響核酸探針與模板的結(jié)合能力及結(jié)合的特異性；③當(dāng)用酶促方法進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，應(yīng)對(duì)酶促活性（Km值）無(wú)多大影響，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性；④高度特異性；⑤較高的化學(xué)穩(wěn)定性，保存時(shí)間長(zhǎng)，標(biāo)記及檢測(cè)方法簡(jiǎn)單；⑥對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)人體無(wú)損傷；⑦價(jià)格低廉等。1、標(biāo)記物①高度靈敏性；120標(biāo)記物分類(lèi)放射性標(biāo)記物：同位素35S、33P、32P和3H等非放射性標(biāo)記物：熒光素生物素地高辛

溴脫氧尿嘧啶等標(biāo)記分子：某種單核苷酸在單核苷酸分子中導(dǎo)入某個(gè)原子、功能基團(tuán)或側(cè)鏈分子作為標(biāo)記物，對(duì)堿基配對(duì)不造成影響標(biāo)記物分類(lèi)放射性標(biāo)記物：同位素35S、33P、32P和121標(biāo)記分子：放射性標(biāo)記分子：

35S-UTP35S-dATP

35S-dCTP

32P-UTP32P-dATP等等非放射性標(biāo)記分子：

四甲基羅達(dá)明-UTP

生物素-UTP(Bio-UTP)

地高辛-dUTP(Dig-dUTP)

溴脫氧尿嘧啶本身為標(biāo)記分子標(biāo)記分子：1222、標(biāo)記方法（1）DNA探針標(biāo)記

切口移位法隨機(jī)引物法（2）RNA探針標(biāo)記

在體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)中與探針制備同時(shí)完成（3）寡核苷酸探針標(biāo)記

末端轉(zhuǎn)移法將放射性或非放射性的標(biāo)記分子在各種酶促反應(yīng)中參入探針?lè)肿?、標(biāo)記方法（1）DNA探針標(biāo)記將放射性或非放射性的標(biāo)記分子123切口平移法切口平移法124隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法125

三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：指所要探測(cè)的核酸分子或核苷酸序列（DNA或RNA）

DNA——可以是中期染色體上的或是間期細(xì)胞核內(nèi)的，也可以是線(xiàn)粒體DNA或病毒DNARNA——