動物細胞工程ppt參考課件

動物細胞工程專題2細胞工程動物細胞工程細胞核移植動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體制備技術手段二.動物細胞工程基礎動物細胞融合植物細胞工程常用的技術手段有哪些？植物組織培養(yǎng),植物體細胞雜交一、動物細胞培養(yǎng)一.動物細胞的培養(yǎng)過程

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理原代培養(yǎng)單個細胞傳代培養(yǎng)分裝動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液剪碎10代細胞（第一次危機）50代細胞（第二次危機）細胞株不死性細胞細胞系培養(yǎng)瓶(皿)中培養(yǎng)癌變分離細胞大多數衰老死亡（遺傳物質未改變）死亡細胞（遺傳物質已改變）胰蛋白酶胰蛋白酶原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。3、流程表面光滑、無毒、易于貼附胃蛋白酶可否？胰蛋白酶——分解彈性纖維蛋白二.相關概念1、非致死細胞、致死細胞——根據細胞的壽命非致死細胞：在體外培養(yǎng)基中不斷增殖，數目以指數式形式增加，當細胞密度達到一定程度時，細胞停止分裂，不再生長。但當被放到新鮮培養(yǎng)基中，細胞重新生長。這樣可以連續(xù)傳代。這種細胞包括癌細胞、表皮細胞和成纖維細胞。致死細胞：能在體外生存和增殖，但不能連續(xù)傳代，往往分裂幾代或幾十代后就會死亡。大多數細胞屬于這類細胞。2.接觸抑制

貼壁細胞進行有絲分裂，數量不斷增多，當它們分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。3.原代培養(yǎng)直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)（嚴格來說，指成功傳代之前的培養(yǎng)）。實際上，通常把第1代至第10

代以內的培養(yǎng)細胞統稱原代細胞培養(yǎng)。4.傳代培養(yǎng)將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。傳代代數：二.相關概念5.細胞株+細胞系細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數細胞存活到40至50代，這種傳代細胞為細胞株。細胞系：細胞株傳代至50代后又出現細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。細胞株和細胞系的區(qū)別：細胞系的遺傳物質改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。三.培養(yǎng)條件1.營養(yǎng):糖,氨基酸,促生長因子,無機鹽,微量元素等,血清（為什么添加?）2.無菌、無毒的環(huán)境，如培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)皿的消毒，添加維生素,定期更換培養(yǎng)基等。3.溫度和pH值，一般為36.5+0.5度為宜，最適pH值為7.2至7.4。4.氣體，（95%空氣和5%CO2

）

O2是代謝所必需,CO2主要是為了維持培養(yǎng)液的pH值。四.動物細胞培養(yǎng)的應用

1.生產許多有重要價值的蛋白質生物制品，如病毒疫苗、干擾素、克隆抗體等，都可以借助于動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)來生產。2.基因工程技術中的應用（提供受體細胞）3.用于檢測有毒物質，判斷某種物質的毒性。4.醫(yī)學家培養(yǎng)各種正常的或病變的細胞，用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預防疾病提供理論依據。五.植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結果培養(yǎng)目的細胞的全能性細胞有絲分裂固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素葡萄糖動物血清細胞株、細胞系植物體快速繁殖、培育無病毒植株獲得細胞或細胞分泌蛋白思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？1、動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？3、為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？4、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)最終培養(yǎng)成新個體主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動物血清等因為這些組織或器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細胞懸浮液利于培養(yǎng)不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數目增多，不能發(fā)育成新的動物個體動物體細胞核移植技術和克隆動物一.克隆概念克隆(clone)是指一個共同的祖先，通過無性繁殖的方法產生一組遺傳上完全相同的DNA、細胞或個體。

供體體細胞細胞核＋受體去核卵細胞的細胞借助于卵細胞質對體細胞核的發(fā)育功能起著關鍵性的調節(jié)作用發(fā)育成胚胎克隆動物重組細胞動物的一個細胞的細胞核移入一個已去細胞核的卵母細胞中,使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,最終發(fā)育成動物個體1、概念二.細胞體細胞核移植技術與動物克隆胚胎細胞核移植:分化程度低恢復全能性容易體細胞核移植,分化程度高,恢復其全能性困難芬蘭多賽特白羊蘇格蘭黑面母綿羊核供體（A）羊卵供體（B）羊乳腺細胞饑餓培養(yǎng)去核電融合新的卵細胞桑椹胚或囊胚代孕母羊（C）羊多莉證明了動物細胞核具有全能性1：培育出來的克隆牛性狀與誰相似？百分百相似嗎？三.克隆大事記1938年：德國科學家首次提出克隆設想。

1952年：科學家開始用青蛙進行克隆實驗。

1970年：克隆青蛙實驗取得突破，青蛙卵發(fā)育成了蝌蚪，但是在開始進食以后死亡。

1981年：科學家進行克隆鼠實驗，據稱用鼠胚胎細胞培育出了正常的鼠。

1984年：第一只胚胎克隆羊誕生。

1997年2月24日：英國羅斯林研究所宣布克隆羊培育成功。科學家用取自一只6歲成年羊的乳腺細胞培育成功一只克隆羊。

1998年2月23日：英國PPL醫(yī)療公司宣布，該公司克隆出一頭牛犢“杰弗遜先生”。

1998年7月5日：日本科學家宣布，他們利用成年動物體細胞克隆的兩頭牛犢誕生。三.克隆大事記1998年7月22日：科學家采用一種新克隆技術，用成年鼠的體細胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠，這是人類第一次用克隆動物克隆出克隆動物。

1999年5月31日：美國夏威夷大學的科學家，利用成年體細胞克隆出第一只雄性老鼠。

1999年6月17日：以美藉華人科學家楊向中為首的研究小組利用一頭13歲高齡的母牛耳朵上取出的細胞克隆出小牛。

2000年1月3日：美國著名華人楊向東，用體外長期培養(yǎng)后的公牛耳皮細胞成功克隆出6頭牛犢。2000年1月：美國科學家宣布克隆猴成功，這只恒河猴被命名“泰特拉”。

2000年3月14日：曾參與克隆小羊“多利”的英國PPL公司宣布，他們成功培育出5頭克隆豬。四.體細胞核移植技術的應用前景體細胞核移植技術已展示出廣闊的應用前景，概括起來大致有以下四個方面：（2）生產轉基因動物；（4）復制瀕危的動物物種，保存和傳播動物物種資源（3）生產人胚胎干細胞經過誘導分化形成相應組織、器官用于器官移植；

（1）培育優(yōu)良畜種和生產實驗動物。動物克隆的展望電影《第六日》片段《時代》封面故事“爭論克隆人”2001年11月美科學家宣布首次克隆處于早期階段的人類胚胎

圖為冒死也要克隆人的科學家布瓦瑟利耶五.體細胞核移植技術存在的問題成功率比較低，產下活克隆動物占移植的胚胎平均不到10%克隆技術的各個環(huán)節(jié)有待進一步改進健康問題:畸形率高,死亡率高,易出現早衰。倫理、食品安全等問題也是目前人們爭論的焦點?？寺游锘蚪M重新編程的機制尚不清楚費用昂貴,距大規(guī)模應用還有一段距離克隆技術的弊端六.尚待解決的倫理難題1、人類在制造生命的同時又在毀滅生命。如果以獲取胚胎干細胞為目的來克隆人類胚胎，那么，人類在獲取干細胞的同時也就破壞了這個胚胎，而胚胎本身已經具有了生命的特征，可看作是一個生命。2、克隆人的出現對人類意味著什么？人類必須對這個問題進行更深層次的思考。禁止生殖性克隆人。堅持四不原則：不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人的實驗。但是，中國不反對治療性克隆人。中國政府的態(tài)度：說說我的看法你支持克隆人胚胎（治療性克?。┭芯繂?？你愿意被科學家克隆嗎？你支持克隆人（生殖性克?。﹩?？如果有一天克隆人真的來了，我們該怎么辦？你怎么看？動物細胞融合

細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合

受精作用思考下列問題：1、什么叫動物細胞融合？植物體雜交技術與動物細胞融合有什么不同呢？2、動物細胞在結構上有何區(qū)別？這與它們雜交或融合過程有什么影響？3、動物細胞融合與植物原生質體融合的基本原理是否相同？兩者的融合過程是否也一樣？2、基本原理生物膜的流動性3、誘導融合的方法

動物細胞融合也稱細胞雜交，指用自然或人工方法、使兩個或多個不同的細胞融合成一個細胞的過程雜交細胞：融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞。1、概念化學：PEG（聚乙二醇）物理：電融合生物：滅活的病毒仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒喪失感染性、保留其的抗原性（誘導細胞融合）誘導細胞融合：篩選、克隆雜合細胞4、技術流程雜交細胞滅火病毒誘導過程滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿透4、優(yōu)點：突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能四、單克隆抗體克隆:單個細胞無性繁殖單:抗體:單克隆抗體

用單個效應B細胞進行無性增殖（擴增），也就是通過克隆，形成細胞群，這樣的細胞群就有可能產生出化學性質單一、特異性強的抗體——單克隆抗體是機體受抗原刺激后產生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。效應B淋巴細胞產生抗體。一般抗原刺激機體會產生多種抗體1、機體如何產生抗體？2、抗體主要存在部位？4、獲得的抗體產量高嗎？特異性強嗎？純度高嗎？為什么？5、如何獲得某種特異性強的單一抗體(單克隆抗體）？6、用某種效應B細胞能否大量制備此單克隆抗體？為什么3、從何處提取、分離抗體？外來抗原刺激機體，從而發(fā)生特異性免疫反應、產生抗體血清腹水等內環(huán)境從動物血清或腹水中提取同種抗原刺激，體內的B細胞可以產生多達百萬種以上的特異性抗體，一種抗原存在不同的抗原決定簇得到分泌此抗體的效應B細胞不能、效應B細胞無增殖能力、10天左右死亡7、如何大量制備？賦予此效應B細胞無限增殖能力如何賦予無限增殖能力利用淋巴細胞產生抗體的功能利用腫瘤細胞無限增殖的特性利用細胞融合的技術將兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞利用動物細胞培養(yǎng)技術大量培養(yǎng)雜交瘤細胞1、單克隆抗體的制備效應B細胞骨髓瘤細胞誘導細胞融合未融合、融合細胞群篩選能產生某專一特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體種類？分泌抗體都能和刺激機體的抗原結合嗎？本過程利用了哪些技術、原理？第1次篩選HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)液提取腹水提取動物細胞培養(yǎng)技術動物細胞融合技術免疫學技術抗原刺激如何獲?。繌暮翁帿@取脾臟如何篩選出雜種細胞？多種雜種細胞如何篩選出某一雜種細胞？第2次篩選為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合?骨髓瘤細胞是癌細胞嗎？兩次篩選的作用是？誘導其融合方法克隆、專一抗體檢測陽性都能產生和抗原特異性結合的抗體嗎？

單克隆抗體制備過程1.科學家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，得到雜交細胞，經培養(yǎng)可產生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細胞融合的是

A.經過免疫的B淋巴細胞B.沒經過免疫的T淋巴細胞

C.經過免疫的T淋巴細胞D.沒經過免疫的Ｂ淋巴細胞A2.用動物細胞工程技術獲取單克隆抗體，下列實驗步驟中錯誤的是

A．將抗原注入小鼠體內，獲得能產生抗體的B淋巴細胞

B．用纖維素酶處理B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞

C．用聚乙二醇作誘導劑，促使能產生抗體的B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合

D．篩選雜交瘤細胞，并從中選出能產生所需抗體的細胞群，培養(yǎng)后提取單克隆抗體B4.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細胞是（）

①淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞

A．②④B．①③⑤

C．①②③④D．②③C35．下圖是單克隆抗體制備流程階段示意圖。(1)

技術是單克隆抗體技術的基礎。(2)根據培養(yǎng)基的用途分類，圖中培養(yǎng)基屬于

培養(yǎng)基。(3)單克隆抗體與常規(guī)的血清抗體相比。最大的優(yōu)越性是

。(4)動物細胞融合除了采用植物細胞原生質體融合常用誘導劑外，還可以采用

。(5)選出的雜交瘤細胞既具備骨髓瘤細胞的

特點，又具備淋巴細胞的

特點。(6)淋巴細胞是由動物體

中的

細胞分化、發(fā)育而來。(7)雜交瘤細胞從培養(yǎng)基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是

。動物細胞培養(yǎng)選擇特異性強，靈敏度高滅活的病毒在體外大量增殖分泌特異性抗體骨髓造血干主動運輸2、單克隆抗體的應用單克隆抗體的優(yōu)點與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產量高，特異性強，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。應用主要有：3、作為載體，運載抗癌藥物，形成“生物導彈”治療腫瘤資料：目前世界各國已經研制出數以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內診斷，借以鑒別和定位體內“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。2、在疾病診斷、治療和預防方面，具有特異性高、靈敏度高等優(yōu)越性。1、在基礎理論研究中具有重要意義3.關于單克隆抗體，下列敘述不正確的是

A．可以制成診斷盒用于疾病的珍斷

B．可以與藥物結合，用于病變細胞的定向治療

C．可以利用基因工程技術生產

D．可以在生物體內生產，不能在體外生產D下圖表示用生物工程制備人抗A抗體的過程。請回答下列問題（1）人的紅細胞膜表面有被稱為凝集原的特異______：從免疫學角度看，這種凝集原是________。（2）圖中細胞中1是小鼠體內注入人A型血紅細胞后而獲得的

細胞，這種細胞具有產生________________的特點，但難以在體外培養(yǎng)。甲培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細胞2，是從患骨髓瘤的小鼠體內獲取的骨髓瘤細胞，這種細胞在體外培養(yǎng)時能________________，但不會產生抗體。（3）為了能充分發(fā)揮上述兩種細胞各自的特點，經特殊處理，在促細胞融合因子的作用下，使兩種細胞發(fā)生融合，形成圖中的細胞3，這種細胞稱為________________。把它在乙培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，則能產生大量的細胞群，這種方法稱為_____________。（4）過程①的主要目______________。通過過程②或③的培養(yǎng)方法能產生大量__________________抗體。單克隆雜交瘤細胞快速大量增殖單一的抗A抗體免疫B淋巴抗原糖蛋白篩選出能產生單一抗A抗體的雜交瘤細胞

單克隆抗A單克隆上圖是單克隆抗體制備過程示意圖。據圖回答：（1）通過①過程得到的B淋巴細胞從小鼠體內分離出之前，應對小鼠進行的處理是_______________，該處理的實質是在小鼠體內發(fā)生________________________反應。（2）骨髓瘤細胞與進行原代培養(yǎng)的細胞相比較，核內的結構發(fā)生的主要變化是

，從而違背了“程序性細胞死亡”規(guī)則，打破了細胞產生與死亡的動態(tài)平衡。（3）培養(yǎng)瓶中的雜交瘤細胞在有絲分裂中期，核內DNA分子數：染色體數＝

。（4）試設想運用生物工程其它領域的技術制備單克隆抗體的一條途徑：_________________

。注射相應抗原體液免疫遺傳物質（原癌基因）發(fā)生了改變2：1運用基因工程方法制造含有某種抗體的基因的工程菌進行發(fā)酵生產總結一種誘導細胞融合的新方法一種新細胞滅活病毒雜交瘤細胞一個優(yōu)勢單克隆抗體特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢6、植物體細胞雜交與動物細胞融合比較細胞壁再生細胞工程植物體細胞雜交動物細胞融合實質內容理論基礎誘導手段誘導過程應用

改變遺傳物質、產生新性狀，獲得細胞產品（使后代具有雙親的特性）植物細胞全能性、生物膜的流動性細胞增殖、生物膜的流動性物理：離心、振動、電刺激化學：聚乙二醇物理：離心、振動、電刺激化學：聚乙二醇生物：滅活病毒（如仙臺病毒）去細胞壁（纖維素酶、果膠酶）原生質體融合（雜種原生質體）植物細胞培養(yǎng)（獲得雜種植株）獲得分離單個動物細胞（胰蛋白酶）誘導融合（雜種原生質體）動物細胞培養(yǎng)（細胞產品）白菜—甘藍等雜種植物單克隆抗體的制備（雜交瘤細胞）超鏈接細胞間物質主要是蛋白質。胃蛋白酶作用適宜pH約為2，pH大于6，胃蛋白酶會失去活性。胰蛋白酶作用適宜pH為7.2～8.4。多數動物細胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2～7.4，進行動物細胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？為什么動物細胞培養(yǎng)要添加血清?血清中含有蛋白質,氨基酸,葡萄糖,激素等,蛋白質是白蛋白和球蛋白.氨基酸有多種,是蛋白質合成的基本成分,激素：胰島素,生長激素等及多種生長因子,多種未知的促細胞生長因子,促貼附因子及其它活性物質,

一般要添加劑10%～20%的血清HAT選擇性培養(yǎng)液普通動物細胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)DNA合成有兩條途徑生物合成途徑（“D途徑”）應急途徑或補救途徑（“S途徑”）氨基酸及其他小分子化合物核苷酸核酸葉酸作為輔酶催化此反應氨基喋呤（A）是葉酸的拮抗物次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）核苷酸核酸效應B細胞：骨髓瘤細胞：D途徑正常、S途徑正常D途徑正常、S途徑異常效應B細胞效應B細胞－效應B細胞骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞－骨髓瘤細胞效應B細胞－骨髓瘤細胞有D途徑、被阻斷有S途徑但無增殖能力有D途徑、被阻斷無S途徑有D途徑、被阻斷有S途徑有增殖能力√單克隆抗體制備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細胞，第二次篩選出能產生特異性抗體的雜交瘤細胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的。

第一次篩選的原理與方法：細胞融合后，雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)是第一次篩選的關鍵。普遍采用的HAT選擇性培養(yǎng)液是在普通的動物細胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依據是細胞中的DNA合成有兩條途徑：一條途徑是生物合