北京耐多藥肺結(jié)核控制項目室相關(guān)問題

結(jié)核病細菌學檢驗的標準化與新診斷技術(shù)進展王甦民2022年4月第一頁，共七十四頁。強化結(jié)核病實驗室診斷標準化的必要性1、全球結(jié)核病控制的三大挑戰(zhàn)：耐藥結(jié)核病、HIV/艾滋病合并結(jié)核病、移民〔流動人口〕2、我國結(jié)核病疫情依然嚴重3、目前結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)的缺乏第二頁，共七十四頁。第三頁，共七十四頁。分類結(jié)核分枝桿菌屬原核生物界、厚壁菌門、裂植菌綱、放線菌目、分枝桿菌科的分枝桿菌屬，分枝桿菌屬種類甚多，目前已命名的有200多種，一般可分為緩慢生長和快速生長兩大類。第四頁，共七十四頁。結(jié)核分枝桿菌特點結(jié)核菌生長緩慢，在一般培養(yǎng)基上分裂一代需要10-20小時細胞壁厚度為10~35nm，較一般細菌的細胞壁厚，含有大量脂類，具有堅韌性和疏水性。抗酸性是分枝桿菌的重要特征。第五頁，共七十四頁。結(jié)核病細菌學檢查的重要作用細菌學檢查是結(jié)核病最客觀、最科學和最重要診斷方法和流行病學研究工具。因此結(jié)核病的實驗室檢驗仍然面臨著較多的問題。第六頁，共七十四頁。細菌學檢驗存在的問題不易于標準化操作誤差較大〔可到達30%〕1、個人操作誤差2、標本性狀3、標本來源對結(jié)果的理解差異可影響檢驗結(jié)果對臨床治療的參考或指導意義。第七頁，共七十四頁。主要的細菌學檢驗技術(shù)1、痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù)2、分枝桿菌別離培養(yǎng)技術(shù)3、分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)4、藥物敏感性實驗技術(shù)5、分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)第八頁，共七十四頁。標準的痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù)標本的收集，特別是痰標本的采集、保存制片和染色過程的標準化讀片操作的熟練程度和標準化對結(jié)果的理解第九頁，共七十四頁。痰標本的采集、保存和運送膿樣、干酪樣或膿性粘液樣痰為合格標本，痰量應為3-5毫升。難以獲得合格標本時，也應進行細菌學檢查，但應注明標本性狀，以供分析結(jié)果時參考。容器上應注明與檢驗單一致的病人姓名、編號及日期。不能及時檢驗的痰標本應置4C冰箱保存，如需轉(zhuǎn)運，外送前要認真核對檢驗單與痰瓶上標注，放在專用的轉(zhuǎn)運箱內(nèi)運送。第十頁，共七十四頁。標本的采集

標本留取方法痰標本的留取應在醫(yī)護人員的指導下進行。醫(yī)護人員應告知病人如何咳痰，合格的痰標本是深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物，并說明唾液檢出的可能性很小。檢驗人員檢查痰標本的性狀，并在登記本和檢驗報告單上注明〔按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分類登記〕。第十一頁，共七十四頁。如何正確留痰查痰對于結(jié)核病的診斷是非常重要的，通過痰檢可以知道您是否痰中帶菌。如果痰中帶有結(jié)核菌說明您患有肺結(jié)核，具有傳染性，應該及時遵醫(yī)囑治療。送檢痰標本的質(zhì)量直接影響檢驗結(jié)果的準確性。請您一定按照以下要求和方法留取合格的痰標本。每個痰盒應分別留取1～2口痰，請不要將1口痰分開放到2或3個痰盒中。正確的咳痰方法：1、咳嗽前應緩慢地深吸氣，吸氣后稍屏氣片刻。2、軀干略向前傾，兩側(cè)手臂屈曲，平放在兩側(cè)胸壁下部，內(nèi)收并稍加力。3、咳嗽時腹肌用力快速收縮，使腹壁內(nèi)陷。一次深吸氣，可連續(xù)咳嗽三聲。4、停止咳嗽后，收縮腹肌將剩余的氣體盡量呼盡。5、重復緩慢吸氣動作或平靜呼吸片刻，準備再次咳嗽的動作。*注意：局部人如果突然深吸氣容易誘發(fā)咳嗽，您可以嘗試緩慢或分幾次吸氣，爭取肺泡內(nèi)充分充氣，以增加咳嗽的效率。在這一過程中，要注意動作的連貫性，一氣呵成。同時，也可以叩擊前胸，或由家屬協(xié)助叩擊后背胸壁。這樣震動支氣管內(nèi)的分泌物，能夠增加咳嗽排痰的力度。第十二頁，共七十四頁。直接痰涂片檢查法

萋爾-尼爾遜氏〔Ziehl－Neelsen〕抗酸染色法〔熱染法〕第十三頁，共七十四頁。細菌學常規(guī)檢查

—直接涂片法操作流程涂痰膜自然干燥復紅加熱初染5分鐘自然干燥鏡檢流水沖洗美蘭復染30秒鹽酸酒精脫色流水沖洗流水沖洗第十四頁，共七十四頁。載玻片〔一〕新載玻片必須經(jīng)95%乙醇脫脂，檢查無劃痕后方可使用。〔二〕一張載玻片只能涂抹1份痰標本?！踩齿d玻片只允許一次性使用，嚴禁清洗后重復用于AFB檢查。〔四〕載玻片正面一側(cè)1/3處標注實驗室序號(如使用的載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫)。〔五〕載玻片正面另一側(cè)2/3中央處均勻涂抹成面積為10×20mm的卵圓形痰膜。第十五頁，共七十四頁。染色〔一〕嚴格按照操作標準完成染色程序?！捕橙旧蟮奶的示鶆蛄了{色，無紅色斑塊。〔三〕將染色后的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不能分辨報紙上的文字，那么說明該玻片涂抹過厚，或染色過程有誤。〔四〕染色后的痰膜脫落局部應小于整個涂抹面積的10%。第十六頁，共七十四頁。〔一〕為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴禁油鏡頭直接接觸玻片上的痰膜?！捕匙屑氂^察300以上的視野?！踩趁總€工作日，一名鏡檢人員的玻片閱讀量一般不應超過25張?！菜摹尺B續(xù)閱讀10～12張玻片后，應休息20分鐘左右。鏡檢讀片第十七頁，共七十四頁。

痰涂片抗酸菌濃度與陽性結(jié)果機率檢出菌數(shù)每毫升標本估算菌數(shù)陽性結(jié)果機率0/100或更多視野＜1000＜10％1-2/300視野5000-1000050％1-9/100視野約3000080％1-9/10視野約5000090％〔cv〕1-9/每視野約10000096.2％〔cv〕10或更多/每視野約50000099.95％〔cv〕第十八頁，共七十四頁。

查痰次數(shù)與陽性機率關(guān)系為什么診斷前強調(diào)三涂兩培〔3S2C〕

12345第十九頁，共七十四頁。細菌學常規(guī)檢查

—直接涂片法顯微鏡檢報告方式：0條/300視野：萋-尼氏抗酸桿菌陰性1-8條/300視野：實報菌數(shù)3-9條/100視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性〔+〕1-9條/10視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性〔2+〕1-9條/1視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性〔3+〕10條/1視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性〔4+〕第二十頁，共七十四頁。細菌學常規(guī)檢查

—直接涂片法本卷須知：選擇痰標本中膿性、血樣、干酪樣的局部涂片陽性率較高；一張玻片只涂一份標本，玻片一次性使用，防止交叉污染；翻開痰盒、涂抹痰膜時容易產(chǎn)生氣溶膠，應注意正確操作和自身防護；石炭酸復紅初染時必須加溫。第二十一頁，共七十四頁。細菌學常規(guī)檢查

—直接涂片法優(yōu)點：是直接發(fā)現(xiàn)原菌的檢查方法，適用于痰、尿、便、體液、組織等幾乎一切標本，有重要的臨床診斷價值。是發(fā)現(xiàn)和確定傳染源的重要途徑，是考核和評價療效的重要指標，有重要的流行病學意義；操作簡便，價格低廉，適于各級實驗室開展；快速，數(shù)小時可報告結(jié)果。第二十二頁，共七十四頁。細菌學常規(guī)檢查

—直接涂片法缺點：敏感性低：通常每毫升含5000-10000條以上抗酸菌才可得到陽性結(jié)果；特異性較低：只能報告“抗酸菌陽性〞，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌；鏡下只能觀察菌體形態(tài)，不能區(qū)分死、活菌。第二十三頁，共七十四頁。涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng)—室內(nèi)質(zhì)控標本收集、染色液制備、涂片染色程序、顯微鏡鏡檢、顯微鏡的保養(yǎng)和維護、結(jié)果的報告和登記、痰片的分類保存等應按照國家參比實驗室的統(tǒng)一標準嚴格進行操作。復查方式：自查：試驗員當日對已查涂片抽樣復查?；ゲ椋河杀緦嶒炇移渌囼瀱T抽查當日10%涂片。第二十四頁，共七十四頁。涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng)—室間質(zhì)控以現(xiàn)場和非現(xiàn)場督導為主要方式?，F(xiàn)場督導：質(zhì)控實驗室人員赴被質(zhì)控實驗室就實驗室布局、平安防護、污染物處理、涂片染色操作、顯微鏡維護狀況、日常實驗記錄等進行考核和指導，并以盲法、按比例抽取涂片復查。非現(xiàn)場督導：防治人員依據(jù)盲法、按比例的原那么抽取涂片交實驗室復查。第二十五頁，共七十四頁。復檢玻片樣本量1.樣本量估算：盲法復檢的關(guān)鍵是復檢結(jié)果能否真正代表被督導實驗室的實際水平。世界衛(wèi)生組織推薦80%靈敏度、100%特異性〔針對陰性玻片〕、誤差為0的可接受數(shù)量以及95%可信限樣本量表，可以極大地減少樣本量，保證了盲法復檢在統(tǒng)計學意義上可以代表被評估實驗室的總體水平。第二十六頁，共七十四頁。復檢樣本量計算表上一年陰性玻片的總數(shù)

玻片陽性率2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%30018512910180675950400217143108867061515002431541148971625270028116712192756554100031818012896766655200037619713510079685650004232081411038069571000044121314210480695720000450215143104826957第二十七頁，共七十四頁。復檢樣本量計算表說明：

a、玻片陽性率：指所有檢測的玻片中陽性玻片的比例〔平均陽性率〕。b、上一年陰性玻片總數(shù)：每年玻片的總數(shù)減去全年陽性玻片數(shù)。c、抽樣時，當上一年陰性玻片數(shù)量和玻片陽性率不在選擇點，陰性玻片數(shù)值采用區(qū)間上限，玻片陽性率采用區(qū)間下限。第二十八頁，共七十四頁。復檢結(jié)果評價盲法復檢的目的不是為了驗證某個病人診斷正確與否,而是評價整個實驗室操作水平。評價的內(nèi)容除了玻片鏡檢結(jié)果存在的誤差之外，還包括檢查標本的質(zhì)量〔合格標本與不合格標本的比例〕、涂抹的大小和厚度、染色質(zhì)量如何等,以便采取糾正措施，提高實驗室的工作質(zhì)量。第二十九頁，共七十四頁。1.誤差分類：分為定性誤差和定量誤差〔1〕定性誤差包括高假陽性和高假陰性高假陽性〔HighFalsePositiveHFP〕：陰性片被錯誤地判讀為2＋以上的陽性。高假陰性〔HighFalseNegativeHFN〕：2＋以上的陽性玻片被錯誤地判讀為陰性。第三十頁，共七十四頁?！?〕定量誤差包括量化誤差、低假陽性和低假陰性量化誤差〔QuantificationError，QE〕：同一張陽性玻片初檢者和復檢者陽性判斷級別的差異。低假陽性〔LowFalsePositive，LFP〕：陰性玻片被錯誤地判斷為1＋及以下的陽性。低假陰性〔LowFalseNegative，LFN〕：1＋及以下玻片被錯誤地判斷為陰性。第三十一頁，共七十四頁。常見“誤差〞原因誤差類型可能原因建議假陽性（FP）1)例如染料沉渣或結(jié)晶等被誤識為抗酸桿菌2)原始報告后著色的抗酸桿菌退色1）對技術(shù)人員復訓。2）對假陽性玻片重新染色并復檢。假陰性（FN）1）觀察玻片的視野數(shù)量不足2）鏡檢技術(shù)能力差3）染色操作不規(guī)范（抗酸桿菌顏色暗淡、背景對比不足或過高）4）顯微鏡存在問題5）染液質(zhì)量差1、2、3）對技術(shù)人員復訓4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài)5）重新購置質(zhì)量合格的染料并重新配制染液量化誤差（QE）1）觀察玻片視野數(shù)量不足2）陽性玻片的分級報告標準掌握差3）鏡檢技術(shù)能力差4）顯微鏡存在問題1.2.3）對技術(shù)人員復訓4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài)第三十二頁，共七十四頁。實驗室診斷的新進展1、擴大開展液體培養(yǎng)和藥敏試驗2、引入現(xiàn)代分子生物學快速檢測技術(shù)3、引入現(xiàn)代免疫學快速檢測技術(shù)第三十三頁，共七十四頁。1、現(xiàn)代分子生物學檢測主要技術(shù)實時熒光定量PCR環(huán)介導等溫擴增基因檢測(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)分子線性探針〔Hain技術(shù)〕(2022WHO推薦)基因芯片技術(shù)GeneXpertMTB/RIF快速診斷技術(shù)第三十四頁，共七十四頁。〔1.1〕聚合酶鏈反響〔PCR〕

PCR誕生于1985年，由美國Muliis等創(chuàng)造。PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸〔DNA〕復制原理而設計的體外DNA或核糖核酸〔RNA〕擴增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反響組成一個周期，經(jīng)過n個周期后，理論上可以獲得2n雙鏈DNA分子，使DNA特定區(qū)段大量擴增。此檢測技術(shù)靈敏度高、特異性強、簡便、快速，但也存在假陰性、假陽性、污染等方面的問題，研究人員對其進行了不懈的研究，使該技術(shù)不斷得到改善，新的PCR及其衍生技術(shù)不斷建立。第三十五頁，共七十四頁。實時熒光定量PCR實時定量PCR(RealTimeQuantitativePCR)是指在PCR反響體系參加熒光基團，利用熒光積累能夠監(jiān)控PCR擴增的每一個循環(huán)，在靶ＤＮＡ擴增的同時可獲得定量的結(jié)果.即在同一個反響體系內(nèi)完成擴增和擴增產(chǎn)物的檢測,從而省去了靶ＤＮＡ擴增后復雜的定量檢測工作。第三十六頁，共七十四頁。實時熒光定量PCR該技術(shù)的優(yōu)勢在于其擴增產(chǎn)物的自動和實時檢測,減少了常規(guī)ＰＣＲ產(chǎn)物檢測步驟,也減少了人工判斷結(jié)果的主觀性，提高了結(jié)果的客觀性和可比較性。同時工作效率大大提高。研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通ＰＣＲ有所提高。與Southern雜交和酶促化學發(fā)光技術(shù)檢測的靈敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。第三十七頁，共七十四頁?！?.2〕環(huán)介導等溫擴增基因檢測(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)檢測是連續(xù)等溫進行的。擴增效率十分高，反響靈敏。采用4條引物，識別6個位點，特異性強。不需要特殊的試劑與儀器，總費用很低。反響不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部檢測。利用Bst酶的鏈置換功能進行反響。參加反轉(zhuǎn)錄酶，可以完成ＲＮＡ的一步法檢測。第三十八頁，共七十四頁。PurificationforUltraRapidExtraction

(PURE)LAMP方法PURE方法等溫反響高擴增效率高特異性實驗周期短(幾乎一個小時)簡單去除核酸擴增抑制因子縮短處理時間Pre-treatmentkitLAMPtestSampleLysisMixtureFilterDNA第三十九頁，共七十四頁。LAMP檢測陰性陽性不需要離心,等溫,快速(整個過程只需一個小時)；DNA與SYBRGreen結(jié)合現(xiàn)示綠色，Bst聚合酶于30分鐘到一個小時內(nèi)可將毫微微克/毫升(fg/ml)〔或500-100拷貝/毫升〕的DNA或RNA擴增到10微克左右。第四十頁，共七十四頁。LAMP敏感度101001000NCcopies/reaction模板:純化的TB基因組DNA反響條件:67℃,40min第四十一頁，共七十四頁。LAMP結(jié)果分析儀器特點：1.LAMP檢測專用，每隔6秒測定反響產(chǎn)物的濁度．2.可以設定相應的反響條件與檢測要求．3.測定結(jié)果可直接輸入電腦進行實時分析．4.檢測結(jié)果〔圖像等〕可以打印．5.可同時檢測32個樣本，８聯(lián)管適用．第四十二頁，共七十四頁?！?.3〕、分子線性探針〔Hain技術(shù)〕原理：基于PCR擴增的檢測方法。擴增后的產(chǎn)物與預先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反響判斷結(jié)果，可以鑒定TB和NTM、鑒定TB復合群、快速檢測RIF、INH、EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性第四十三頁，共七十四頁。

GenoType?分支桿菌試劑盒系列GenoType?MTBC〔來自于培養(yǎng)標本的結(jié)核分枝桿菌復合群菌種間的鑒定〕GenoType?MycobacteriaDirect〔來自于病人標本的結(jié)核分枝桿菌復合群，非結(jié)核分枝桿菌復合群的鑒定〕GenoType?MycobacteriumCM〔來自于培養(yǎng)物的結(jié)核分枝桿菌復合群，非結(jié)核分枝桿菌的鑒定〕GenoType?MycobacteriumAS〔來自于培養(yǎng)物的其他非結(jié)核分枝桿菌的鑒定〕GenoType?MTBDRplus〔結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性檢測〕GenoType?MTBDRsl〔結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性檢測〕第四十四頁，共七十四頁。技術(shù)設備TwinCubator?

手工雜交儀第四十五頁，共七十四頁。自動操作-全自動雜交儀GT-Blot?48或GT-Blot?20第四十六頁，共七十四頁。GenoTypeMTBDRplus結(jié)果MTBC及其對利福平和/或異煙肼的耐藥性第四十七頁，共七十四頁。

適用于培養(yǎng)物和痰液。檢測快速，對于直接采集的樣本或陽性培養(yǎng)物在數(shù)小時后內(nèi)即可完成檢測；檢測INH單耐藥型TB、MDR和XDR；符合WHO推薦的線性探針分析標準。GenoTypeMTBDRplus/sl–優(yōu)點第四十八頁，共七十四頁。驗證數(shù)據(jù)產(chǎn)品目的材料靶點敏感性專屬性對照方法*GenoType?

MycobacteriumCM普通分支桿菌的鑒定陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA97%93,5%測序；生化技術(shù)GenoType?MycobacteriumAS其他菌種的鑒定陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA96%94%測序；生化技術(shù)GenoType?

MTBC結(jié)核分支桿菌復合群的菌種區(qū)分陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA100%100%生化技術(shù)；分子遺傳學方法GenoType?

MTBDRplus結(jié)核分支桿菌復合群的鑒定及其對利福平和/或異煙肼的耐藥性直接采集的標本（顯微鏡檢查陽性，經(jīng)過純化）；陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA直接采集的標本RMP:96,8%INH:90,2%固體/液體培養(yǎng)物RMP:98,7%INH:92%直接采集的標本RMP:95%INH:100%固體/液體培養(yǎng)物RMP:100%INH:100%傳統(tǒng)的藥敏試驗(DST)GenoType?

MTBDRsl結(jié)核分支桿菌復合群的鑒定及其對氟喹諾酮類和/或氨基糖苷類/環(huán)肽和/或乙胺丁醇的耐藥性直接采集的標本（顯微鏡檢查陽性，經(jīng)過純化）；陽性的固體/液體培養(yǎng)物DNA直接采集的標本氧氟沙星：88,9%阿米卡星/卷曲霉素：75%乙胺丁醇：38,5%固體/液體培養(yǎng)物**氧氟沙星：90,6%阿米卡星/卷曲霉素：84,8%乙胺丁醇：69,2%直接采集的標本氧氟沙星：100%阿米卡星/卷曲霉素：100%乙胺丁醇：100%固體/液體培養(yǎng)物氧氟沙星：100%阿米卡星/卷曲霉素：100%乙胺丁醇：100%傳統(tǒng)的藥敏試驗(DST)GenoType?

MycobacteriaDirect結(jié)核分支桿菌復合群鳥分支桿菌M.avium、胞內(nèi)分支桿菌M.intracellulare、堪薩斯分支桿菌M.kansasii、瑪爾摩分支桿菌M.malmoense的鑒定經(jīng)純化后的直接采集的標本RNA涂片陽性樣本97,5%涂片陰性樣本83,3%涂片陽性樣本99%培養(yǎng)第四十九頁，共七十四頁。結(jié)論DNA-Strip技術(shù)系列涵蓋了分枝桿菌菌種鑒定、TB-復合群的區(qū)分和藥敏試驗。所有檢測都采用通用試劑盒和相同的方案進行擴增和雜交。所有檢測均可在4-5小時內(nèi)完成。本法適用于大樣本量的檢測〔每天檢測數(shù)百份樣品〕。第五十頁，共七十四頁。〔1.4〕、基因芯片技術(shù)科學的開展人類的進步要求進行大規(guī)模基因信息的解析鑒于基因芯片的多種用途和其遠大的開展前景，不少生命科學研究機構(gòu)和生物技術(shù)公司都先后參與了這項技術(shù)的研究。據(jù)不完全統(tǒng)計目前僅國內(nèi)就有十多家單位從事該技術(shù)的研究與開發(fā)工作，全世界估計至少有二三十家。它已象半導體技術(shù)一樣成為一個重要的產(chǎn)業(yè)方向。當前已正被廣泛地應用于諸多領域，包括生物醫(yī)學、臨床診斷學和基因組學研究。第五十一頁，共七十四頁。什么是基因芯片基因芯片指對數(shù)以千記的DNA片段同時進行處理分析的技術(shù)，諸如基因組DNA突變譜和mRNA表達譜的檢測等〔TrendsinBiotechnology)。該技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。第五十二頁，共七十四頁。基因芯片技術(shù)的主要特點技術(shù)操作簡單自動化程高序列數(shù)量大檢測效率高應用范圍廣本錢相對低第五十三頁，共七十四頁。博奧分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)主要分為樣品制備、芯片反響和結(jié)果判讀三局部。

首先，將檢測菌的DNA從培養(yǎng)、別離純化的菌株或者直接從臨床樣品中提取出來；

然后，對樣品中的靶基因進行擴增和熒光標記；

接著，將擴增并熒光標記的基因序列與芯片上的探針進行雜交反響；

最后芯片掃描成像，用配套軟件進行判讀。第五十四頁，共七十四頁。芯片掃描結(jié)果1第五十五頁，共七十四頁。臨床驗證第五十六頁，共七十四頁。〔1.5〕GeneXpertMTB/RIF快速診斷技術(shù)Cepheid?MTB/RIF:可直接檢測痰液，檢測結(jié)核分支桿菌的同時，鑒定是否有利福平耐藥性，2小時出結(jié)果。GeneXpert檢測平臺采用實時熒光定量PCR檢測原理。所有檢測均無需提取核酸，手工操作時間不超過2分鐘。第五十七頁，共七十四頁。GeneXpert最大程度簡化TB檢測?。?！將痰液參加處理瓶，放置15分鐘；將處理后的樣品參加樣品反響盒；將該盒子放置在GeneXpert中，輕松按下“開始〞鍵；得到結(jié)果〔2小時〕：檢測是否含有結(jié)核分支桿菌的同時，可對利福平耐藥性進行判讀。第五十八頁，共七十四頁。XpertMTB/RIF檢測操作步驟1、痰液參加處理瓶，放置15分鐘。2、取處理后的痰液2mL參加Xpert反響試劑盒3、將反響試劑盒放入GeneXpert儀器，點擊“開始〞〔手工操作至此結(jié)束！〕4、自動過濾洗滌樣品5、自動超聲破碎，純化樣品6、熒光定量PCR擴增7、巢氏PCR擴增8、自動結(jié)果判讀〔MTB/RIF〕第五十九頁，共七十四頁?！癝amplein.Answerout.〞全自動操作完全封閉系統(tǒng)污染可能性小減少人為錯誤結(jié)果精確度高檢測時間短無需專業(yè)技術(shù)人員和特殊實驗室第六十頁，共七十四頁。研究人數(shù)>1,700Patients?秘魯、南非、阿塞拜疆、印度?涂片陽性樣品：?靈敏性98.2%,特異性99.2%?涂片陰性,培養(yǎng)陽性樣品：?三次檢測靈敏性90.2%?一次檢測靈敏性72.5%?對利福平耐藥性檢測：?靈敏性97.6%,特異性98.1%第六十一頁，共七十四頁。結(jié)論GeneXpert檢測Mtb簡單、易于操作，對操作者技術(shù)要求不高：只需要把痰液、反響液參加儀器即可得出診斷報告；GeneXpert檢測Mtb快速：整個過程大約2小時。GeneXpert檢測Mtb對操作人員平安：整個檢測過程全封閉、一次性完成。高靈敏性：BCG—176cfu/ml；H57Rv—112cfu/ml耐藥性診斷：可對利福平耐藥性進行檢測第六十二頁，共七十四頁?，F(xiàn)代免疫學診斷技術(shù)1、體液免疫診斷技術(shù)：是利用結(jié)核分枝桿菌或其提取物抗原檢測結(jié)核病患者血清抗體的方法。目前，通過檢測抗結(jié)核桿菌的抗體(IgG)診斷結(jié)核病的商品化試劑盒已較多。采用的方法包括：酶聯(lián)免疫吸附試驗〔ELISA)和免疫金標記技術(shù)的免疫層析法和膠體金標記的滲濾法等，采用的抗原也各不相同。第六十三頁，共七十四頁。體液免疫學診斷技術(shù)的意義在國內(nèi)應用較廣泛，是結(jié)核病的輔助診斷方法之一,尤其對肺外結(jié)核、菌陰肺結(jié)核的診斷具有應用價值。缺乏之處：單獨使用時，其檢測的特異性和靈敏度都有些缺點。目前國際上反對使用該項技術(shù)的呼聲在增加。原因主要是特異性問題。第六十四頁，共七十四頁。2、細胞免疫學診斷技術(shù)細胞免疫診斷技術(shù)應用較少，過去主要應用PPD皮試技術(shù)，近年來英國和澳大利亞研制了ELISpot、T-Spot技術(shù)和QFT-Gold。此項技術(shù)用于感染情況的檢測是一項特異性較強、靈敏度較高很有希望的新技術(shù)。第六十五頁，共七十四頁。酶聯(lián)免疫斑點(ELISpot)技術(shù)是檢測細胞分泌細胞因子的一種實驗方法，采用可定量的夾心ELISA方法，利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6&CFP-10刺激和激活免疫活性細胞使其產(chǎn)生IFN-，并檢測IFN-的濃度變化進行診斷的方法。通過ELISpot酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對加底物后形成的斑點分析后得出結(jié)果。ELISpot具有較高的特異性和敏感性。第六十六頁，共七十四頁。ELISPOT技術(shù)原理細胞免疫主要由T淋巴細胞發(fā)動，T淋巴細胞分成效應T淋巴細胞和記憶T淋巴細胞。記憶T淋巴細胞在首次感染病原體后長期存在免疫系統(tǒng)中。當再次受到感染刺激后。這些記憶T淋巴細胞發(fā)出信號分子并增殖成為效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞分泌細胞因子，如干擾素(INF-γ)。所以無論是否有臨床病癥，檢測效應T淋巴細胞在血中的水平可作為機體是否被感染的指標。第六十七頁，共七十四頁。ELISPOT在結(jié)核病診斷中的應用在MTB潛伏感染診斷中的應用早期診斷MTB潛伏感染對控制結(jié)核病意義重大。目前診斷MTB潛伏感染仍沿用100年來使用的TST，但TST不能區(qū)分MTB感染患者和接種BCG的健康人以及感染環(huán)境中的分枝桿菌患者。Lalvani在土耳其檢查了暴露于肺結(jié)核家庭環(huán)境中的908名健康兒童。皮試結(jié)果說明580名兒童患有潛伏性肺結(jié)核,需要進行藥物治療,以免轉(zhuǎn)化為活動性肺結(jié)核;而ELISPOT結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有380名兒童患有潛伏性肺結(jié)核。通過ELISPOT檢測,只需要治療380名兒童,而不是580名,但卻能夠預防同樣數(shù)量的活動性肺結(jié)核病例發(fā)生。因此，ELISPOT比TST篩選結(jié)核潛伏感染更有效,而且ELISPOT檢測結(jié)果與MTB的接觸程度相關(guān)性更強。第六十八頁，共七十四頁。ELISPOT早期技術(shù)評估英國Ewer等用ELISpot檢測對結(jié)核分枝桿菌分泌的抗原有特異性反響的T淋巴細胞來診斷早期結(jié)核病。這項研究共納入了結(jié)核流行區(qū)有不同程度結(jié)核病接觸史的535名學生，結(jié)果顯示結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)和ELISpot的一致性達89%(P<0.0001)。但ELISpot與研究對象結(jié)核病接觸程度之間的正相關(guān)性顯著強于TST。在接種過BCG的兒童中，TST假陽性的可能性較大，而BCG接種對ELISpot結(jié)果沒有影響。作者認為ELISpot可開始替代TST，這將使更多的人能在感染仍處于隱匿期時就可進行預防，而不至于開展成為嚴重的結(jié)核病。第六十九頁，共七十四頁。ELISPOT法的優(yōu)點(1)靈敏、特異，能從100萬個細胞中測出1個分泌INF細胞；只有MTB和少數(shù)非結(jié)核分枝桿菌才會出現(xiàn)陽性反響，而BCG及多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌因不分泌ESAT-6和CFP-10蛋白，因此本法能區(qū)別BCG接種出現(xiàn)的陽性反響。(2)快速：能早期診斷結(jié)核感染，檢測全過程2天。(3)應用面廣：在肺結(jié)核、肺外結(jié)核及免疫抑制的結(jié)核患者均能檢測。(4)療效評估：當結(jié)核菌被消滅后，效應T淋巴細胞即消失，測定效應T淋巴細胞也可檢測機體是否去除了結(jié)核菌，進行臨床療效評估。第七十頁，共七十四頁。ELISPOT技術(shù)的缺點細胞培養(yǎng)及抗原刺激時,有發(fā)生細菌污染的可能,以致實驗失敗;實驗過程步驟較多,實驗人員需有一定的理論根底并經(jīng)屢次操作的培訓方能勝任;目前試劑價格比較昂貴。第七十一頁，共七十四頁。結(jié)束語結(jié)核病準確、快速的診斷是結(jié)核病防治人員多年期盼的。隨著科技不斷進步，今天企盼已經(jīng)成為可能。經(jīng)過不斷的對現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)化和繼續(xù)努力開發(fā)更新的技術(shù)，相信未來的結(jié)核病實驗室診斷，一定可以最大限度的滿足臨床和防治工作的需要。第七十二頁，共七十四頁。謝謝！第七十三頁，共七十四頁。內(nèi)容總結(jié)結(jié)核病細菌學檢驗的標準化與新診斷技術(shù)進展。5、重復緩慢吸氣動作或平靜呼吸片刻，準備再次咳嗽的動作。如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫)。以現(xiàn)場和非現(xiàn)場督導為主要方式?！?〕定性誤差包括高假陽性和高假陰性。5）重新購置質(zhì)量合格的染料并重新配制染液。與Southern雜交和酶促化學發(fā)光技術(shù)檢測的靈敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。固體/液體培養(yǎng)物**。謝謝第七十四頁，共七十四頁。兒童休克的診斷與治療思路LOREMIPSUMDOLOR正常的血液循環(huán)過程1.正常的血液循環(huán)過程血容量→心泵→血管→組織灌注→器官功能2.血壓維持的三大要素有效循環(huán)血量心泵功能（心輸出量）外周血管阻力3.收縮壓、舒張壓、脈壓與平均動脈壓收縮壓：反應心肌收縮力與心搏量舒張壓：反應大動脈彈性與外周血管阻力脈壓：是一個計算值，收縮壓與舒張壓之差值平均動脈壓：是一個計算值，1/3收縮壓+2/3舒張壓中心靜脈壓：反映循環(huán)容量符合與右心功能狀況休克的定義

休克（shock）：是由多種致病因素引起的急性循環(huán)功能障礙，因有效循環(huán)血容量減少，使全身組織和重要器官血流灌注不足，集體不能輸送足夠的氧和營養(yǎng)物質(zhì)、并去除代謝產(chǎn)物，從而導致一系列代謝紊亂、細胞損傷及臟器功能不全的急性臨床綜合征。在休克病程的不同階段，有不同的矛盾特點：早期以有效循環(huán)血容量減少，心輸出量減少，微循環(huán)障礙為主晚期以代謝紊亂、細胞損害和器官功能障礙為主最后發(fā)展至MODS，可致死亡。休克的本質(zhì)組織器官血流灌注不足組織氧和營養(yǎng)物質(zhì)利用障礙休克的病理生理過程1.休克的基本發(fā)病過程有效循環(huán)血容量不足→微循環(huán)障礙→MMDS→MODS2.休克的病理生理（早期）有效循環(huán)血容量減少心輸出量減少微循環(huán)障礙（痙攣、擴張、麻痹、血栓、CLS）3.休克的病理生理（晚期）組織缺血缺氧代謝紊亂表現(xiàn)器官功能不全或衰竭→MODS（難治期）休克時血壓與心輸出量變化1.休克時收縮血壓的狀況升高正常下降2.休克時心輸出量的狀況升高正常下降休克的分類（一）根據(jù)病因?qū)W分類1.脫水性休克2.過敏性休克3.膿毒癥休克（感染性休克）4.心源性休克5.神經(jīng)源性休克6.失血性休克7.貧血性休克8.混合性休克休克的分類（二）根據(jù)血流動力學特點分類1.低血容量性休克（如脫水性休克、失血性休克）2.分布異常性休克（如膿毒癥休克、過敏性休克、神經(jīng)源性休克）3.心源性休克4.梗阻性休克5.貧血性休克6.混合性休克休克的分類（三）根據(jù)病程分期1.休克代償期（休克早期）臟器低灌注血壓正?；蛘咂?.休克失代償期（休克晚期）臟器功能不全，伴血壓下降3.休克不可逆期（休克難治期）多臟器功能衰竭伴頑固性低血壓休克的分類（四）根據(jù)臨床表現(xiàn)分型1.暖休克：高排低阻?？捎幸庾R改變、尿量減少或乳酸性酸中毒等，但四肢溫暖、皮膚干燥、無花斑紋，脈壓增大，脈搏搏動有力，毛細血管再充盈時間正常，心率快，休克代償期血壓正常，失代償期血壓降低。多為休克早期，極容易漏診，且可很快轉(zhuǎn)變?yōu)槔湫菘恕?.冷休克：低排高阻或者低排低阻。除意識改變、尿量減少外，還表現(xiàn)為皮膚蒼白或花斑紋，四肢涼，脈搏增快、細弱，毛細血管再充盈時間延長（≧3s）。休克代償期血壓正常，失代償期血壓降低。兒科休克多為此型。膿毒性休克的定義膿毒性休克（septicshock）是發(fā)生在各種嚴重感染的基礎上，由致病微生物及其產(chǎn)物所引起的急性循環(huán)功能障礙，有效循環(huán)血容量減少，使全身組織和重要器官的血流灌注不良，不能輸送足夠的氧和營養(yǎng)物質(zhì)以滿足組織代謝需要，從而導致一系列的代謝紊亂、細胞受損及臟器功能障礙的急性綜合征。sepsis+急性循環(huán)功能障礙（頑固性組織低灌注，伴或不伴低血壓）即為膿毒性休克。在膿毒性休克病程的不同階段，有不同的矛盾特點：早期以有效循環(huán)血容量減少、心輸出量減少、微循環(huán)障礙為主；晚期則以細胞損害、代謝紊亂和器官功能衰竭為主；最后發(fā)展至MODS，可致死亡。承認膿毒性休克2016年最新定義，指在膿毒癥的基礎上，經(jīng)充分液體復蘇后，仍持續(xù)低血壓（需要升壓藥以維持平均動脈壓≧65mmHg）且乳酸水平>2mmol/L。膿毒性休克診斷

根據(jù)兒童膿毒性休克診治專家共識（2015版）（一）膿毒性休克代償期：在下列各項臟器低灌注表現(xiàn)中，6項滿足3項或以上+血壓不下降者1.意識改變早期煩躁不安或萎靡，表情淡漠或嗜睡，晚期意識模糊，甚至昏迷、驚厥（多見于失代償休克）2.心率脈搏改變心率、脈搏增快，外周動脈搏動細弱，外周動脈搏動可有力3.皮膚改變面色蒼白或蒼灰，肢端濕冷，大理石樣花斑紋。如為暖休克可表現(xiàn)為四肢溫暖、皮膚干燥、無花斑紋4.毛細血管再充盈時間（CRT）延長CRT≧3s（或>2s）（除外環(huán)境溫度影響）。如為暖休克，CRT可正常。5.尿量減少充分液體復蘇后，尿量<0.5ml/（kg.h）（無尿），持續(xù)至少2h；或者尿量<1ml/（kg.h）（少尿）6.乳酸酸中毒動脈血乳酸>2.0mmol/L（除外其他缺血缺氧以及代謝因素）膿毒性休克診斷

根據(jù)兒童膿毒性休克診治專家共識（2015版）（二）膿毒性休克失代償期：代償期臟器低灌注表現(xiàn)加重+出現(xiàn)低血壓（主要指收縮壓）者<1月收縮壓<60mmHg1-12月收縮壓<70mmHg1-10歲收縮壓<70+2×年齡（歲）mmHg≧10歲收縮壓<90mmHg2.需要使用心血管活性藥物才能夠維持血壓在正常范圍（多巴胺>5ug/（kg.min））或任何劑量的多巴酚丁胺、去甲腎上腺素、腎上腺素等）膿毒性休克診斷

根據(jù)兒童膿毒性休克診治專家共識（2015版）（三）膿毒性休克不可逆期（難治性）：多臟器功能衰竭血壓明顯持續(xù)下降，心音嫉妒低鈍，嚴重心肌損害，嚴重心律紊亂，常合并心功能衰竭、肺水腫或ARDS、腦水腫、腎功能衰竭、胃腸道功能衰竭、DIC、嚴重的內(nèi)環(huán)境紊亂與電解質(zhì)紊亂（低鈣血癥、低鈉血癥等）等多器官功能衰竭表現(xiàn)。治療難度極大，大多最終死亡。兒童危重癥的基本處理原則（1）除告知病情危重，并做相應處理外，還應把我以下基本原則1.通道2.氧氣3.鹽水4.監(jiān)護5.上級6.住院（PICU）7.強調(diào)病情變化，動態(tài)監(jiān)測，即使評估，隨時調(diào)整。兒童休克的治療原則各種兒童休克治療的基本原則1.早期、積極、持續(xù)，并采取綜合治療措施2.重癥監(jiān)護（包括血流動力學監(jiān)測）與一般治療3.抗休克治療（液體復蘇與心血管活性藥物應用）4.器官功能飽和與支持對癥治療5.針對病因與基礎疾病治療6.基礎治療，如氧療、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛治療，胃腸道減壓治療7.監(jiān)測評估調(diào)整相統(tǒng)一膿毒性休克的治療

膿毒性休克治療的主要內(nèi)容與方法重癥監(jiān)護（包括血流動力學監(jiān)測）與一般治療抗休克治療（液體復蘇與心血管活性藥物應用）抗感染治療及感染灶清除，并與抗炎治療協(xié)同進行腎上腺皮質(zhì)激素應用靜脈大劑量免疫球蛋白治療糾正凝血功能障礙與DIC連續(xù)血液凈化治療（腎臟替代治療）器官功能保護與支持對癥治療（ECMO）維持內(nèi)環(huán)境平衡與穩(wěn)定危重癥的營養(yǎng)支持治療（暫禁食與靜脈營養(yǎng)）基礎治療，如氧療，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛治療，胃腸道減壓治療膿毒性休克的重癥監(jiān)護與一般治療1.重癥監(jiān)護：生命體征、臨床癥狀及實驗室指標：a心電監(jiān)護、SPO2監(jiān)測以及動脈血氣分析。bT、R、BP、意識改變、肢端溫度、皮膚顏色、CRT、尿量、肝臟大小、心肺聽診等。c血常規(guī)、尿常規(guī)、血氣、血乳酸、血糖、血電解質(zhì)、肝腎功能、凝血功能指標、心肌損害指標、其他器官功能指標d炎癥反應指標（如CRP、PCT、IL-6、鐵蛋白等）e床旁胸片、彩超、心電圖、腦電圖等f病原學指標g無創(chuàng)或有床血流動力學監(jiān)測與氧代謝指標監(jiān)測h準確記錄液體出量、入量膿毒性休克的重癥監(jiān)護與一般治療2.合適體位：頭部及雙下肢抬高30°3.對癥治療：積極控制體溫；四肢末梢保暖；亞低體溫腦保護；保證氣道暢通。4.基礎治療：氧療（給予高流量鼻導管供氧或面罩氧療，如鼻導管或面罩氧療無效，則予無創(chuàng)正壓通氣，或盡早進行氣管插管機械通氣），胃腸道減壓（如鼻胃管持續(xù)負壓吸引減壓/肛門直腸減壓、灌腸/導瀉、導尿），鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛肌松治療，維持內(nèi)環(huán)境平衡，營養(yǎng)治療等。膿毒性休克的液體復蘇（一）膿毒性休克液體復蘇目的1.恢復有效循環(huán)血容量，即容量復蘇。休克時微循環(huán)障礙，血液淤滯在微循環(huán)內(nèi)，毛細血管通透性增加，血管內(nèi)頁滲漏到組織間隙，血流分布一場，有效循環(huán)血容量急劇減少，心輸出量下降。因此患兒無論是否有額外體液丟失，液體復蘇都是重要的治療措施。且往往需要大容量液體復蘇，液體入量遠高于出量。由于血液重新分配及毛細血管滲漏等，膿毒性休克的液體丟失和持續(xù)低血容量可能持續(xù)數(shù)日。因此要繼續(xù)和維持輸液，應維持數(shù)日。2.恢復有效的器官血流灌注休克時，血流比血壓可能更重要。3.糾正各種代謝紊亂，維持內(nèi)環(huán)境平衡穩(wěn)定如維持水電解質(zhì)平衡、滲透壓平衡、糾正代謝性酸中毒、維持血糖穩(wěn)定（5個平衡）膿毒性休克的液體復蘇

(二)膿毒性休克液體復蘇原則1.及時充分液體復蘇是逆轉(zhuǎn)休克病情，降低病死率最關(guān)鍵的措施。