新課標(biāo)2023版高考生物一輪總復(fù)習(xí)第十四單元基因工程及生物技術(shù)的安全性與倫理問(wèn)題第2講重點(diǎn)研究“基因工程操作中限制酶的選擇和PCR技術(shù)”課件

基因工程操作中目的基因的獲取和基因表達(dá)載體的構(gòu)建都離不開(kāi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶，只有選取合適的限制酶才能準(zhǔn)確切取目的基因，因此限制酶的選取是基因工程操作的重點(diǎn)也是難點(diǎn)，近年來(lái)較難的高考試題大都圍繞限制酶的選取進(jìn)行考查。PCR技術(shù)既可以用于獲取目的基因，又可以用于目的基因的檢測(cè)與鑒定，是基因工程中重要技術(shù)之一，其應(yīng)用較強(qiáng)，因此對(duì)PCR技術(shù)的考查也成為命題的熱點(diǎn)。深化提素養(yǎng)1．(2021·全國(guó)乙卷)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類(lèi)需要的生物產(chǎn)品。在此過(guò)程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性?xún)?nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是____________。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能________；質(zhì)粒DNA分子上有____________________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是___________________________________________________________________________________。(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指_________________________________________________________________________________。解析：(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA連接酶來(lái)源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)，而T4DNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)既可以用E.coliDNA連接酶連接，又可以用T4DNA連接酶連接，而限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)只能用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。(3)質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達(dá)的載體。質(zhì)粒上含有復(fù)制原點(diǎn)，能保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中自我復(fù)制；質(zhì)粒DNA分子上有一個(gè)至多個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)，便于目的基因的導(dǎo)入；質(zhì)粒上的標(biāo)記基因是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。(4)啟動(dòng)子是一段特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得需要的蛋白質(zhì)。答案：(1)EcoRⅠ、Pst

Ⅰ

EcoRⅠ、Pst

Ⅰ、Sma

Ⅰ和EcoRⅤ

(2)磷酸二酯鍵(3)自我復(fù)制一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程2．(2021·山東高考)人類(lèi)γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過(guò)改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長(zhǎng)度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是______，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是________。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程共需要________種酶。(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去

BCL11A

基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光。含F(xiàn)7

與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光的原因是________________。(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測(cè)，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于_________________________________________，理由是______________________________________________________________。解析：(1)據(jù)題意可知，需要將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入并指導(dǎo)熒光蛋白基因的表達(dá)，則含有啟動(dòng)子P的擴(kuò)增后的產(chǎn)物讀取方向與熒光蛋白基因的讀取方向一致，故擴(kuò)增后的產(chǎn)物中的R端與熒光蛋白基因中限制酶MunⅠ

識(shí)別序列端結(jié)合，才能保證擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入并指導(dǎo)熒光蛋白基因的表達(dá)。要做到定向插入，需要引物末端兩端添加限制酶的識(shí)別序列，且被限制酶識(shí)別并切割后，兩端的黏性末端不能相同。而擴(kuò)增后的產(chǎn)物中可能含有MunⅠ

和

XhoⅠ

的識(shí)別位點(diǎn)，故在引物末端添加限制酶的識(shí)別序列不能被限制酶MunⅠ和Xho

Ⅰ所識(shí)別，故應(yīng)該選用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ識(shí)別序列，據(jù)圖中對(duì)限制酶的注釋可知，限制酶MunⅠ與限制酶EcoRⅠ

識(shí)別并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7

末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是SalⅠ；熒光蛋白基因中含有限制酶EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，故對(duì)載體使用限制酶MunⅠ

和XhoⅠ

切割。綜上所述，對(duì)載體使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物選用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ識(shí)別序列，然后在DNA連接酶的催化作用下，連接形成重組載體；產(chǎn)物擴(kuò)增中需要使用Taq酶催化，合成更多的產(chǎn)物，故從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程共需要6種酶，分別是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶Sal

Ⅰ、限制酶Mun

Ⅰ、限制酶Xho

Ⅰ、DNA連接酶。(2)受體細(xì)胞中已經(jīng)除去BCL11A基因，故擴(kuò)增產(chǎn)物中的BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，不會(huì)抑制熒光蛋白基因的表達(dá)；基因的表達(dá)需要RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，才能完成熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程；含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7

與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光，則可能是F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不表達(dá)。(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，此時(shí)重組載體上的BCL11A基因表達(dá)，產(chǎn)生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白與BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，導(dǎo)致熒光蛋白基因被抑制；含F(xiàn)1～F4

與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，則說(shuō)明BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后在引物F4與引物R之間的序列上；含F(xiàn)5～F6

與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光，則說(shuō)明BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后在引物F5的上游序列，故據(jù)此結(jié)果可推測(cè)，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4

與F5

在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上。答案：(1)SalⅠ

EcoRⅠ

6

(2)F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不表達(dá)(3)引物F4

與F5

在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上根據(jù)有無(wú)熒光情況判斷，F(xiàn)1～F4

與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點(diǎn)，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的下游(右側(cè))；F5～F6

與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無(wú)結(jié)合位點(diǎn)，可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5

所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的上游(左側(cè))，所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4

與F5

在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上3．(2020·江蘇高考)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)：請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題：(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種__________________酶，它通過(guò)識(shí)別特定的__________________切割特定位點(diǎn)。(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′-羥基與5′-磷酸間形成____________；PCR循環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化_______________________。(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號(hào))。項(xiàng)目

DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物(4)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是________。A．5′-AACTATGCG……AGCCCTT-3′B．5′-AATTCCATG……CTGAATT-3′C．5′-GCAATGCGT……TCGGGAA-3′D．5′-TTGATACGC……CGAGTAC-3′解析：(1)根據(jù)題圖可知，步驟Ⅰ是獲取目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一種限制酶，其能識(shí)別特定的核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。(2)步驟Ⅱ是將目的DNA片段連接成環(huán)狀，其中DNA連接酶的作用是催化相鄰核苷酸之間的3′-羥基和5′-磷酸間形成磷酸二酯鍵。PCR循環(huán)中，升高溫度到95℃是為了打開(kāi)氫鍵使雙鏈解旋，獲得DNA單鏈，TaqDNA聚合酶的作用是催化游離的脫氧核苷酸連接到引物3′端，合成DNA子鏈。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA子鏈，因?yàn)镈NA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，故為擴(kuò)增未知序列，選擇的與模板鏈相結(jié)合的引物應(yīng)為④和②。(4)分析題意可知，片段F的兩端為限制酶EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的黏性末端，因此其5′端序列應(yīng)為AATT-，3′端序列應(yīng)為-TTAA，B正確。答案：(1)限制性?xún)?nèi)切核酸(或限制)核苷酸序列(2)磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸(3)②④

(4)B知能集成(一)探討基因工程操作中限制酶的選擇方法1．根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)(1)應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。(2)不能選擇切點(diǎn)位于目的基因和標(biāo)記基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲、乙不能選擇SmaⅠ。(3)為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。2．根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)3．根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：[典例]

(2022·衡水模擬)玉米是重要的糧食作物，其葉片細(xì)胞中的P蛋白是一種水通道蛋白，由P基因編碼，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)水分的吸收具有重要的調(diào)節(jié)功能。科研人員成功培育出超量表達(dá)P蛋白轉(zhuǎn)基因玉米，所用DNA片段和Ti質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)如圖所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)強(qiáng)啟動(dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，能被________________識(shí)別并結(jié)合，驅(qū)動(dòng)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。為使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，應(yīng)優(yōu)先選用____________________酶組合，將Ti質(zhì)粒切開(kāi)后構(gòu)建重組表達(dá)載體。T-DNA在該實(shí)驗(yàn)中的作用是

___________________________________________________________。(2)將農(nóng)桿菌浸泡過(guò)的玉米愈傷組織去菌后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入______進(jìn)行篩選，此物質(zhì)屬于氨基糖苷類(lèi)抗生素，它能抑制蛋白質(zhì)在葉綠體和線粒體中合成，使植物的光合作用和________受到干擾，從而引起植物細(xì)胞死亡。(3)愈傷組織是一種相對(duì)沒(méi)有分化的________團(tuán)，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可以分散成胚性單細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細(xì)胞可以發(fā)育成__________，再繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因玉米株系。[解析]

(1)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，能驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。為使P基因在玉米植株中超量表達(dá)，則需要強(qiáng)啟動(dòng)子，因此應(yīng)優(yōu)先選用BamHⅠ和SacⅠ酶組合，將Ti質(zhì)粒切開(kāi)后構(gòu)建重組表達(dá)載體。農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，因此T-DNA在該實(shí)驗(yàn)中的作用是將強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因帶入玉米細(xì)胞并整合到玉米細(xì)胞染色體DNA上。(2)由圖可知，標(biāo)記基因是G418抗性基因，因此將農(nóng)桿菌浸泡過(guò)的玉米愈傷組織去菌后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需加入G418進(jìn)行篩選，此物質(zhì)屬于氨基糖苷類(lèi)抗生素，它能抑制蛋白質(zhì)在葉綠體和線粒體中合成，其中葉綠體是光合作用的場(chǎng)所，線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的主要場(chǎng)所，因此其可使植物的光合作用和呼吸作用(能量代謝)受到干擾，從而引起植物細(xì)胞死亡。(3)愈傷組織是一種相對(duì)沒(méi)有分化的薄壁細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)可以分散成胚性單細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細(xì)胞可以發(fā)育成胚狀體，再繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因玉米株系。[答案]

(1)RNA聚合酶BamHⅠ和SacⅠ將強(qiáng)啟動(dòng)子和P基因帶入玉米細(xì)胞并整合到玉米細(xì)胞染色體DNA上(2)G418呼吸作用(能量代謝)

(3)薄壁細(xì)胞胚狀體[針對(duì)訓(xùn)練]1．(2022·東城區(qū)二模)為了獲得抗蚜蟲(chóng)棉花新品種，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI121)結(jié)合，然后導(dǎo)入棉花細(xì)胞。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖?/p>

(

)A．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因B．與只用KpnⅠ相比，Kpn

Ⅰ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確C．將棉花細(xì)胞接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞D．用PCR技術(shù)可檢測(cè)GNA和ACA基因是否導(dǎo)入棉花細(xì)胞中解析：由圖可知：GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位點(diǎn)，故用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA-ACA融合基因，A正確；圖中質(zhì)粒與GNA-ACA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)，與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確，B正確；由于重組質(zhì)粒含有卡那霉素的抗性基因，故將棉花細(xì)胞接種在含卡那霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，C錯(cuò)誤；PCR技術(shù)可用于基因探針的制備，可用來(lái)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，D正確。答案：C

2．(2022·寧德模擬)將小菜蛾細(xì)胞的羧酸酯酶基因(CarE)導(dǎo)入水稻細(xì)胞，培育抗農(nóng)藥水稻新品種，過(guò)程如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是

(

)A．必須將含CarE基因的質(zhì)粒導(dǎo)入水稻的受精卵B．構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選用PstⅠ和SmaⅠ分別切割質(zhì)粒和含CarE基因的DNAC．Tetr的作用是鑒別和篩選含CarE基因的細(xì)胞D．通過(guò)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物來(lái)判斷CarE基因在水稻細(xì)胞中是否發(fā)揮功能作用解析：不一定要將含CarE基因的質(zhì)粒導(dǎo)入水稻的受精卵，但是導(dǎo)入受精卵效果要好，A錯(cuò)誤；Tetr是標(biāo)記基因，是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)，C正確。答案：A

知能集成(二)

PCR技術(shù)中引物的相關(guān)問(wèn)題分析1．PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較項(xiàng)目PCR技術(shù)DNA復(fù)制場(chǎng)所體外(PCR擴(kuò)增儀中)細(xì)胞內(nèi)(主要是細(xì)胞核內(nèi))解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化酶耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶溫度條件在較高溫度下進(jìn)行需控制溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件合成對(duì)象DNA片段DNA分子相同點(diǎn)均需要模板(DNA雙鏈)、原料(四種脫氧核苷酸)、能量2.與引物相關(guān)的問(wèn)題歸納概括(1)PCR技術(shù)需要引物的原因DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA的復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈，因此DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。(2)PCR擴(kuò)增中需要引物數(shù)目的計(jì)算規(guī)律若一個(gè)DNA分子在PCR中經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)，理論上需要消耗引物數(shù)為2n＋1－2，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數(shù)為2n個(gè)。[典例]

(2022·天津二模)IKK激酶參與動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患兒IKK基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致IKK上第395位酪氨酸被組氨酸代替。為研究該患兒發(fā)病機(jī)制，研究人員利用純合野生鼠應(yīng)用大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)培育出SCID模型小鼠(純合)，主要過(guò)程如圖1、2。分析回答：(1)在PCR反應(yīng)體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入_______________________________________________等。(2)在圖1獲取突變基因過(guò)程中，需要以下3種引物：引物A5′--CCCCAACCGGAAAGTGTCA--3′(下劃線字母為突變堿基)引物B5′--TAAGCTTCGAACATCCTA--3′(下劃線部分為限制酶HindⅢ識(shí)別序列)引物C5′--GTGAGCTCGCTGCCCCAA--3′(下劃線部分為限制酶SacⅠ識(shí)別序列)則PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有__________和圖中大引物的________(填“①”或“②”)鏈。(3)PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃50s,30個(gè)循環(huán)。在循環(huán)之前的94℃3min處理為預(yù)變性；循環(huán)中72℃處理的目的是__________________________________。(4)據(jù)圖2分析代孕母鼠對(duì)移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應(yīng)，這為_(kāi)_______________________提供了可能。(5)研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉(zhuǎn)基因雜合鼠F0，并確認(rèn)突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，請(qǐng)你設(shè)計(jì)完成獲得SCID模型鼠的實(shí)驗(yàn)步驟：①雜交親本：______________，雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機(jī)交配得F2；③提取F2每只小鼠的基因組DNA，采用分子生物學(xué)方法，利用IKK基因探針和突變基因探針進(jìn)行篩選，則___________________________________為模型鼠。[解析]

(1)在PCR反應(yīng)體系中，除加入引物、IKK基因、緩沖液、Mg2＋等外，還需加入耐高溫DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸等。(2)在PCR1中，獲取的是大引物，大引物中含有突變基因，所以應(yīng)含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ識(shí)別的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一個(gè)引物結(jié)合到了基因的左端，在它從5′到3′的序列的開(kāi)始部位應(yīng)含有限制酶SacⅠ識(shí)別的序列，所以要用到引物C；而另外的一個(gè)引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5′到3′端的序列中開(kāi)始部位應(yīng)含有HindⅢ識(shí)別的序列，從圖中看，它是大引物的②鏈。(3)在PCR循環(huán)之前的94℃3min處理為預(yù)變性，使DNA雙鏈解開(kāi)；循環(huán)中72℃處理的目的是使Taq酶從引物起始通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成。(4)代孕母鼠對(duì)移入子宮的胚胎基本不發(fā)生免疫反應(yīng)，這為胚胎在受體內(nèi)存活提供了可能。(5)①研究人員經(jīng)鑒定、篩選獲得一只轉(zhuǎn)基因雜合鼠F0，并確認(rèn)突變基因已經(jīng)穩(wěn)定同源替代IKK基因，若要獲得SCID模型鼠，可讓F0與野生鼠雜交得F1；②F1雌雄鼠隨機(jī)交配得F2；③模型鼠中應(yīng)含有突變基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因組DNA，利用IKK基因探針和突變基因探針進(jìn)行篩選，若IKK基因探針檢測(cè)未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測(cè)出現(xiàn)雜交帶的則為模型鼠。[答案]

(1)Taq酶(或熱穩(wěn)定DNA聚合酶)、4種脫氧核苷酸(2)引物A和引物B引物C

②

(3)使Taq酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成(4)胚胎在受體內(nèi)存活(5)①F0×野生鼠③IKK基因探針檢測(cè)未出現(xiàn)雜交帶，突變基因探針檢測(cè)出現(xiàn)雜交帶[針對(duì)訓(xùn)練]1．據(jù)研究，新冠病毒表面的S蛋白是其主要的病毒抗原，在康復(fù)病人的血清中有抗S蛋白的特異性抗體。如圖為某機(jī)構(gòu)研制新冠病毒疫苗的部分過(guò)程。下列敘述錯(cuò)誤的是

(

)A．對(duì)發(fā)熱病人進(jìn)行核酸檢測(cè)可使用帶標(biāo)記的S基因做探針B．使用PCR選擇性擴(kuò)增的前提條件是掌握S基因的核苷酸序列C．過(guò)程②通常是將S基因和質(zhì)粒連接以構(gòu)建重組表達(dá)載體D．S基因與培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞核DNA整合是其穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵解析：對(duì)發(fā)熱病人進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí)以S基因單鏈作為探針，若出現(xiàn)雜交鏈則細(xì)胞內(nèi)有病毒存在，A正確；使用PCR選擇性擴(kuò)增的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，便于根據(jù)這一序列合成引物，不需要掌握S基因的全部序列，B錯(cuò)誤；過(guò)程②是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，通常是將S基因和質(zhì)粒用相同的限制酶處理后連接以構(gòu)建重組表達(dá)載體，C正確；S基因整合到細(xì)胞核DNA分子中后能使S基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，是其穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵，D正確。答案：B

2．(2022·連云港期末)