實(shí)驗(yàn)十二 藥物研制工藝 -細(xì)胞色素C的制備及測定課件

實(shí)驗(yàn)十二

藥物研制工藝

——細(xì)胞色素C的制備及測定劉艷麗生科院249室一、目的要求： 掌握從心肌中提取細(xì)胞色素C的原理；學(xué)習(xí)測定細(xì)胞色素C含量的方法；了解細(xì)胞色素C活性測定方法。二、原理： 細(xì)胞色素是一類含鐵卟啉基團(tuán)的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細(xì)胞中，在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色素C是細(xì)胞色素的一種，是一種穩(wěn)定可溶性蛋白，易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取?？煞譃檠趸秃瓦€原型兩種，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。其含量與組織的活動(dòng)強(qiáng)度成正比。以哺乳動(dòng)物的心肌、鳥類的胸肌和昆蟲的翼肌含量最多，肝、腎次之，皮膚和肺中最少。 本實(shí)驗(yàn)以豬心肌為原料經(jīng)過酸溶液抽提，人造沸石吸附及三氯乙酸沉淀得到細(xì)胞色素C粗制品。根據(jù)還原型細(xì)胞色素C在520nm有最高吸收峰，利用分光光度計(jì)測定其含量。三、試劑：1、制備用試劑1mol/L硫酸；1mol/L氨水；人造沸石60-80目；0.2%氯化鈉溶液；25%硫酸銨溶液；20%三氯乙酸；奈氏試劑或10%氯化鋇溶液。2、測定用試劑標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞色素C溶液（80mg/mL）；連二亞硫酸鈉。四、器材：新鮮或冰凍的豬心、離心機(jī)、分光光度計(jì)、層析柱、透析袋、尼龍紗布。六、操作方法：1、細(xì)胞色素C的制備（1）絞碎、提取、壓濾：將豬心絞碎后，稱取100g肌肉糜，加入200mL水，用1M硫酸調(diào)pH至4.0，在室溫下攪拌提取2h。然后用1M氨水調(diào)pH至6.0，用尼龍紗布?jí)簽V，收集濾液，將濾渣按上述條件重提取1h，合并兩次提取濾液。（2）中和：用1M氨水將上述提取液調(diào)pH至7.5，靜置40min，3000rpm離心5min，棄沉淀，合并上清液。（3）吸附：在上清液中加入人造沸石（10g/L）,攪拌吸附40min，靜置5min，棄上層清液，收集吸附細(xì)胞色素C的人造沸石。用蒸餾水洗滌2次，0.2%的氯化鈉溶液洗滌2次，再用蒸餾水洗滌至液體澄清為止（1次）。（4）洗脫：將吸附細(xì)胞色素C的人造沸石裝入預(yù)先加入1/4體積蒸餾水的層析柱內(nèi)，注意要一次加完，避免產(chǎn)生氣泡及條帶。用25%硫酸銨溶液洗脫，流速約2mL/min，收集含細(xì)胞色素C的紅色洗脫液，當(dāng)洗脫液紅色開始消失時(shí)，即洗脫完畢。（5）鹽析、濃縮、透析：洗脫液中加入固體硫酸銨（20g/100mL），邊加邊攪拌，靜置，1.5h后，10000rpm離心5min除去雜蛋白，收集透明液體，緩緩加入20%三氯乙酸溶液（25mL/L），邊加邊攪拌，立即于10000rpm離心5min，收集沉淀。加適量蒸餾水（1mL）剛好使沉淀完全溶解，裝入透析袋，攪拌下透析除鹽，透析三次，10min/次，第三次用奈氏試劑或氯化鋇檢測透析外液無銨根離子或硫酸根離子為止，收集透析液即為細(xì)胞色素C粗品。2、細(xì)胞色素C含量測定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：取1mL細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品（80mg/mL）加水稀釋至25mL。取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于試管中，加水至4mL，加入50L連二亞硫酸鈉，搖勻后，于520nm測光吸收值，做2個(gè)平行。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品的測定：根據(jù)制得樣品溶液顏色（與標(biāo)準(zhǔn)品比較）決定是否稀釋，取1mL原液或稀釋液加3mL水，加入50L連二亞硫酸鈉，搖勻后，于520nm測光吸收值，做2個(gè)平行，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到濃度。七、應(yīng)用 細(xì)胞色素C是一種重要的細(xì)胞呼吸激活劑，常作為組織缺氧治療的急救用藥和輔助用藥，如CO中毒、安眠藥中毒、初生嬰兒窒息、嚴(yán)重休克期缺氧、麻醉前處理以及肺部疾患引起的呼吸困難、高山缺氧、各種腦部疾病引起的腦缺氧、各種心臟疾患的缺氧。也用于腦血管障礙，中風(fēng)后遺癥、乙型腦炎后遺癥等的治療。另外細(xì)胞色素C還能促進(jìn)受損肝細(xì)胞的再生、骨髓造血機(jī)能修復(fù)以及顯著減輕由放療引起的白細(xì)胞減少