用熒光定量PCR檢測非洲豬瘟的病毒含量設(shè)計

用熒光定量PCR檢測非洲豬瘟的病毒含量設(shè)計1.前言近年來，對于在豬只養(yǎng)殖中爆發(fā)性，流行性的疫病大規(guī)模地在各個地區(qū)不斷發(fā)生。例如2020年5月，甘肅蘭州永登縣發(fā)生非洲豬瘟疫情，導(dǎo)致當(dāng)?shù)厣i發(fā)病率高達(dá)2.8%，死亡率高達(dá)1%，此病毒一經(jīng)出現(xiàn)，急性感染死亡率高達(dá)100%，不論是對于普通農(nóng)戶還是專業(yè)化的養(yǎng)殖場都將會是一場巨大的災(zāi)難。它對人類生命健康不會產(chǎn)生直接的影響，但是它間接的影響也是不可忽視的。一方面來說，養(yǎng)殖戶們，將會因為豬價行情不穩(wěn)定而導(dǎo)致失業(yè)。另一方面，豬價也會因供不應(yīng)求而飛速上漲，從而導(dǎo)致物價偏高、坐地起價的現(xiàn)象出現(xiàn)，最終導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失、因病毒出現(xiàn)的人心惶惶、人民生活水平得不到基本保障最終影響人民幸福度。因此，使用熒光定量PCR檢測方法對生豬在成長過成中是否感染病毒進(jìn)行實時監(jiān)測，能夠最大程度保證豬只健康性、安全性，可在很大程度上減少病毒爆發(fā)出現(xiàn)的一系列的經(jīng)濟(jì)損失。本文通過對熒光定量PCR技術(shù)檢測非洲豬瘟進(jìn)行方案設(shè)計，以探討該技術(shù)方法對生豬飼養(yǎng)的安全性和經(jīng)濟(jì)性的意義。1.1非洲豬瘟非洲豬瘟（ASF）是非洲豬瘟病毒（ASFV）感染家豬或野豬引起的一種急性、出血性、高度接觸性傳染病，其特征是病程短、高熱和出血性病變，急性感染死亡率高達(dá)100%。ASFV是一種大型雙鏈DNA病毒。1.2熒光定量PCR實時熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)能夠?qū)NA模板進(jìn)行定量分析，具有靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好，自動化程度高、無污染性等優(yōu)點，因此被認(rèn)為是目前最先進(jìn)核酸分子診斷技術(shù)。1.3研究意義實時熒光定量PCR技術(shù)能高效、快速而又能準(zhǔn)確地檢測出豬只身上攜帶的病毒，該方法可預(yù)防豬只生長中出現(xiàn)的疾病，實時監(jiān)控豬只健康情況和提高穩(wěn)定豬肉質(zhì)量有非常顯著地作用。研究該方法的主要意義在于，能夠避免在人體食用產(chǎn)品之后，通過其他渠道傳播到生豬，避免疫情通過這樣的方式發(fā)生，有利于流行病學(xué)研究與免疫程序制定和評估疫苗效果以及減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失和保障人民的身體健康。2.病原檢測基本流程2.1實驗試劑與器材不同量程移液槍及配套槍頭、槍盒、振蕩器、八連排管、96孔板、離心機、PE連卷袋、離心管、離心管架、75‰酒精、84消毒液、八連排表、標(biāo)簽紙、記號筆、記錄本、病原體核酸提取試劑盒（裂解液、生理鹽水0.9%氯化鈉溶液、漂洗液、洗脫液、離心柱），檢測試劑：引物(ZB2、MGF)熱聚合酶以及配套的緩沖液。2.2儀器與設(shè)備基礎(chǔ)操作臺（預(yù)處理）、超凈工作臺、紫外燈、冷藏柜（不同試劑需要嚴(yán)格控制貯藏溫度）、核酸提取儀、PCR儀、高壓殺菌鍋2.3實驗步驟樣品接收→樣品處理→樣品登記→提取核酸→PCR試劑配置→PCR擴增→結(jié)果比對2.3.1樣品接收接收到樣品時，了解樣品來源、類型、檢測項目、采樣是否規(guī)范，檢測項目是否合理。樣品登記信息整潔、清晰，送檢樣品信息與實驗室編號一一對應(yīng)。實驗員了解樣品信息后再做處理，避免樣品遺漏或混亂。若同時處理不同來源地樣品，切忌不可交叉處理。2.3.2樣品處理混樣指標(biāo)：混合樣品需要大于200ul，根據(jù)實際樣品平均分配。環(huán)境樣品：不超過3個一混（例如：欄舍地面，欄舍把手、出水口）血樣（全血或血清）：不超過10個一混豬拭子樣（口鼻、肛門、唾液）：不超過5個一混人員：全部單檢車輛：不超過5個一混（例如：前輪、后輪、車身、車箱內(nèi)、駕駛室）基礎(chǔ)操作：處理樣品前對操作臺進(jìn)行消毒整理，平鋪PE連卷袋，處理時分批次處理樣品，批次間消毒，（處理不同豬場樣品或不同類型樣品為一批次）并勤換手套。雙手開蓋或者使用器械（鑷子）開蓋，且器械需要經(jīng)常消毒處理兩者方法皆不能觸碰到樣品內(nèi)壁；使用移液槍時，一檔吸一檔打，避免反復(fù)吹吸，若端口污染，將移液槍端口放入1～2厘米的1:30的84消毒液中浸泡15分鐘后，用酒精棉消毒，潔凈的紙巾擦拭；及時更換擺放樣品的泡沫板或者96孔雙面板，處理完一個批次的樣品及時放入裝有1:30的84消毒液的醫(yī)療廢棄物箱或大桶里侵泡；處理完的樣品放置指定區(qū)域，以便于復(fù)檢，避免人員未及時溝通導(dǎo)致重復(fù)處理。樣品必須用振蕩器充分振蕩均勻，以保證實驗準(zhǔn)確性。2.3.3樣品登記樣品登記信息整潔、清晰，送檢樣品信息與實驗室編號一一對應(yīng)；實驗員了解樣品信息后再做處理，避免樣品遺漏或混亂。若同時處理不同來源地樣品，切忌不可交叉處理。2.3.4提取核酸（1）磁珠混勻（2）根據(jù)試劑盒排布加入蛋白酶K（20ul）裂解液（在天隆試劑盒的第一列與第七列打入）。（3）加入樣品（容量200ul）雙手開蓋搖勻，一個樣品一個槍頭，45度角打進(jìn)。側(cè)面檢查反應(yīng)體系高度，保持水平一致，防止遺漏。（4）放入核酸提取儀提取純化核酸分子，包括以下4個步驟：裂解、吸附、洗滌、洗脫。2.3.5PCR試劑配置1、體系配置:將探針、上下引物按要求稀釋值(根據(jù)Add×5的超純水）,混合配置成引物原液放置棕色管內(nèi)低溫保存。配置反應(yīng)體系時,將引物原液按要求稀釋成引物稀釋液,根據(jù)檢測數(shù)量配置相應(yīng)的PCR擴增液。分別配置ZB2、MGF、1V7等引物原液與稀釋液。引物稀釋液方法：病原名稱超純水引物原液ASFV1000ul80ul2、體系分裝：將現(xiàn)配的PCR擴增液分裝至無核酸酶的反應(yīng)管中。3、模板的加入：將提取完成的核酸模板加入已分裝有PCR擴增液的反應(yīng)管中,蓋上管蓋,做好編號,簡短離心。4、反應(yīng)體系需要檢查是否有氣泡，不得沾于管壁，應(yīng)全部位于管底。如果有就需用10000rpm離心30s—1min，取出反應(yīng)管看里面是否還有氣泡，如有將重新離心。主要試劑及qPCR體系配置試劑使用量備注PremixExTap12.5ul引物稀釋液7.5ul核酸模版5ulDNA總體系25ul此為一個樣品的量2.3.6PCR擴增PCR運行程序：新建創(chuàng)建名稱選擇運行模版參數(shù)運行孔數(shù)樣本設(shè)置（待測樣品、陰陽對照）選擇擴增通道開始實驗PCR儀設(shè)置溫度時間循環(huán)數(shù)預(yù)變性95℃30秒12步擴增法95℃5秒4060℃34秒①PCR儀的運行：PCR反應(yīng)管放入PCR儀中，操作程序完成后，PCR反應(yīng)按程序步驟進(jìn)行。圖片1:程序設(shè)置②PCR儀的反應(yīng)完成：裝有反應(yīng)體系的產(chǎn)物不可立即取出，需冷卻一段時間，否則出現(xiàn)氣溶膠污染，帶給實驗室不可預(yù)估的損失。③記錄實驗數(shù)據(jù)：在八連排表上清晰、準(zhǔn)確地記錄實驗數(shù)據(jù)，不可出現(xiàn)遺漏、混淆。結(jié)合數(shù)據(jù)分析結(jié)果是否準(zhǔn)確，是否出現(xiàn)異常，若出現(xiàn)結(jié)果異?，F(xiàn)象，必須進(jìn)行進(jìn)行復(fù)檢并驗證結(jié)果。保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確無誤，避免出現(xiàn)不必要的損失。2.3.7結(jié)果分析1.熒光域值：熒光擴增曲線上人為設(shè)定一個值，以PCR反應(yīng)的前15

個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，一般熒光域值定義為3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10

倍。2.閾值=基線信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差x103.CT值：又稱循環(huán)閾值.C代表Cycle（擴增曲線與循環(huán)閾值的交點）在PCR循環(huán)過程中熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點。注意：CT值越小，證明樣品病毒含量越高，呈反比關(guān)系。圖片二：擴增曲線4.引物使用路線：1.①號ZB2。若不起跳，樣品判為陰性。若起跳，判為陽性。需用②號引物MGF進(jìn)行下一步判定是為野毒或者疫苗毒。2.②號MGF。若起跳，則為野毒（ASFV）。若不起跳，樣品判為陰性，為疫苗毒。5.實例分析：圖片3:實驗結(jié)果①基礎(chǔ)分析此組實驗結(jié)果6條樣品，除陽性對照外，其余樣品的反應(yīng)體系全部未起跳，曲線無仍何異常，陰陽對照成立，結(jié)合豬群臨床背景。可判定此批實驗豬只未感染非瘟病毒。若豬只仍出現(xiàn)病變現(xiàn)象，需根據(jù)獸醫(yī)師，進(jìn)一步做其他相關(guān)檢查排除病害來治療豬只。②質(zhì)量控制：陽性對照是監(jiān)測整個檢測過程是否成功，即確認(rèn)核酸提取環(huán)節(jié)是否成立，同時確認(rèn)qPCR擴增是否成功。陽性質(zhì)控的濃度不宜過高，CT值在29–32之間！陰性對照又稱空白對照，在完全相同的檢測流程下，監(jiān)控整個實驗是否存在污染。若陰性對照結(jié)果呈陽性，則判定整個實驗過程污染，結(jié)果不成立；如陰性對照呈陰性，出現(xiàn)CT值大于37的樣品又異常的多，且與臨床豬群背景不符，則懷疑實驗室可能出現(xiàn)氣溶膠污染，需重新檢測。每次實驗必須建立在陰陽對照成立下，否則實驗不成立、實驗結(jié)果有誤，缺乏可信度。③其他情況若此組實驗中結(jié)果出現(xiàn)陽性樣品，CT值較高。如果樣品為混樣，必須根據(jù)樣品種類進(jìn)行拆樣進(jìn)行復(fù)檢，重新提取核酸，具體檢測出病變豬只。高CT值臨近樣品若出現(xiàn)CT值大于37，也需重新復(fù)檢。復(fù)檢情況一：仍檢測為陽性，但陽性很弱，屬弱陽性。需結(jié)合臨床豬群背景，綜合判斷，通知送檢方進(jìn)行洗消并重新送檢以確定最終結(jié)果。復(fù)檢情況二：檢測為陰性，可判斷樣品交叉污染、實驗材料污染、實驗操作人員的失誤或氣溶膠污染。此污染非常嚴(yán)重，實驗室必須進(jìn)行全方面的通風(fēng)、消毒。三、常見異常分析1.1問題一圖片三：非標(biāo)準(zhǔn)曲線導(dǎo)致原因：試劑沒有混勻。對策：很多試劑都是混合液，吸之前可震蕩混勻，也可以用槍吹打混勻。不然容易造成每管體系濃度不同，導(dǎo)致結(jié)果有異常。1.2問題二圖片四：非標(biāo)準(zhǔn)曲線（1）原因：檢測樣品大部分是拭子類，病毒含量低?？赡軝z測結(jié)果如上圖類似。（上圖CT值分別是39.5和36.1）。在排除污染的情況下，屬于弱陽性。探針的特異性很強，只要有擴增曲線，就是陽性。對策：出現(xiàn)這種情況，需要從核酸提取這步驟開始，拆單復(fù)檢！如果還是這樣，就判定為弱陽，建議豬場重新采樣送檢。（2）實驗結(jié)果誤差原因：模板提取環(huán)境和操作污染樣品；試劑被污染；移液槍污染等。對策:改善操作，設(shè)置陰性對照檢查實驗室環(huán)境是否存在污染;消毒處理，使用帶濾芯的移液槍頭。(校準(zhǔn)移液槍，正確使用移液槍)4.實驗室注意事項4.1實驗室分區(qū)（1）樣品處理室：潔凈區(qū):存放實驗耗材(槍盒、96孔板、離心管、保鮮袋等)（2）樣品接收區(qū):存放未處理的樣品（3）樣品存放區(qū):存放已處理的樣品（4）廢棄物存放區(qū):待高壓廢棄物、普通廢棄物（5）實驗操作區(qū):處理樣品（6）核酸處理室：實驗操作區(qū):超凈工作臺或?qū)嶒灢僮鲄^(qū):超凈工作臺或相對潔凈的實驗臺（7）試劑存放區(qū):試劑臺(柜)、冰箱等（8）儀器安置區(qū):放置核酸提取儀、離心機、渦旋振蕩器等廢棄（9）存放區(qū)：待高壓廢棄物、普通廢棄物（10）試劑存放區(qū):試劑臺(柜)、冰箱等（11）儀器安置區(qū):放置核酸提取儀、離心機、渦旋振蕩器等廢棄（12）存放區(qū):待高壓廢棄物、普通廢棄物(13)配液室(14)PCR擴增室：實驗操作區(qū)：相對潔凈的實驗臺(15)儀器安置區(qū)：PCR儀并連接電腦(16)廢物存放區(qū)：設(shè)置一個84消毒箱，冷卻后的擴增產(chǎn)物需進(jìn)行消毒。4.2實驗室污染處理措施和方法用84消毒液稀釋1:30的比例，對實驗操作臺面、實驗地面進(jìn)行消毒，作用5分鐘配合紫外燈照射。移液槍和槍盒專區(qū)專用，移液槍緩慢勻速移液，使用后移液槍嘴處及表面用75%的酒精清潔。若在使用過程中出現(xiàn)污染，及時對被污染的移液槍進(jìn)行消毒處理，將其浸泡在1:30的84消毒液，作用15分鐘；（3）超凈臺在使用后，用稀釋過的84消毒液浸潤的濕布擦拭超凈臺面，作用5分鐘，用酒精棉擦拭一遍，打開紫外；（4）實驗開始前，用酒精擦拭離心機（內(nèi)外部）。實驗結(jié)束后，用稀釋過的84消毒液噴灑離心機，再用潔凈的濕布擦洗，待干后蓋上機蓋；（5）定期消毒PCR儀，用酒精棉擦拭一起熱蓋和儀器表面。5.結(jié)論（1）通過對熒光定量PCR檢測非洲豬瘟的病毒（ASFV）含量的實驗研究，最終總結(jié)了一套系統(tǒng)完整的實驗程序并得出快速高效的實驗方法。樣品的檢測結(jié)果也因?qū)訉淤|(zhì)控，使它準(zhǔn)確性與可靠性大大加強。極大地減少了不必要的損失。（2）實時熒光定量PCR技術(shù)—具有靈敏度高，特異性和可靠性強，重復(fù)性好，自動化程度高、無污染性等突出特點。由于這些優(yōu)勢，它也成為非洲豬瘟病毒檢測的首選方法之一。高靈敏度，使得它能檢測到微弱的病毒，提前預(yù)防，控制病毒傳播，減少豬只損失。自動化程度高，節(jié)省更多時間，提高效率。也進(jìn)一步減少因環(huán)境、實驗人員帶