【教學課件】第2節(jié) 基因工程的基本操作程序 第3課時 示范課件1

第2節(jié)基因工程的基本操作程序

（第3課時）第3章基因工程新課引入1．基因工程的四個操作步驟是什么？（1）目的基因的篩選與獲??；（2）基因表達載體的構建；（3）將目的基因導入受體細胞；（4）目的基因的檢測與鑒定。2．獲取目的基因的方法有哪些？PCR獲取和擴增目的基因、基因文庫、人工合成。3．基因表達載體需要具備哪些成分？目的基因、標記基因、啟動子、終止子。新課引入4．導入不同的受體細胞采用的方法分別是什么？（1）植物細胞：花粉管通道法、農桿菌轉化法（2）動物細胞：顯微注射法（3）原核生物細胞：Ca2+處理法5．目的基因的檢測和鑒定有哪些水平？（1）分子水平檢測：DNA和mRNA用PCR等技術、蛋白質用抗原-抗體雜交（2）個體生物學水平的鑒定一、實驗原理

閱讀教材84頁前兩段的內容，了解PCR和電泳鑒定的基本原理。學生活動

基因工程的操作是DNA水平，那如何對DNA片段進行擴增和鑒定呢？一、實驗原理1．DNA片斷的擴增

（1）PCR可以在體外進行DNA片斷的擴增。（2）PCR利用了DNA的熱變性原理，可以調節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。注意：復性時不一定均為引物與DNA模板結合，也存在DNA解開的兩條單鏈的結合，因此一般在PCR實驗中引物的投入量遠大于產物量。

（3）PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，一次PCR一般要經過30次循環(huán)。一、實驗原理2．DNA片段的電泳鑒定（1）DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH條件下，這些基團可以帶上正電荷和負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動。這個過程就是電泳。

（2）PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。DNA分子的遷移速率與其大小成反比二、材料用具1．試劑

可直接從公司購買，PCR反應體系的配方見教材或試劑盒的說明書。PCR試劑盒電泳緩沖液凝膠載樣緩沖液瓊脂糖核酸染料二、材料用具2．用具電泳裝置制膠用的模具電泳槽連接線黑色陰極紅色陽極一次性吸液槍頭微量移液器微量離心管梳子二、材料用具2．用具PCR儀微量移液器微量離心管推動桿調節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度0.2mL微量離心管吸液桿二、材料用具拓展1PCR中幾種實驗用具的作用名稱作用PCR儀自動調控溫度，實現DNA的擴增微量離心管實際上是進行PCR反應的場所微量移液器用于向微量離心管中轉移PCR配方中的液體，每吸取一種試劑后，其上的槍頭都必須更換三、方法步驟閱讀教材84~85頁的方法步驟，按照“DNA片段的擴增”和“DNA片段的電泳鑒定”兩個環(huán)節(jié)，嘗試以關鍵詞的形式畫出實驗流程。學生活動三、方法步驟1．DNA片斷的擴增準備移液離心反應（1）準備

按照PCR反應需要的物質和條件，將需要的試劑和儀器準備好。三、方法步驟1．DNA片斷的擴增（2）移液

用微量移液器按照配方或PCR試劑盒的說明書在微量離心管中依次加入各組分。三、方法步驟拓展2微量移液器的使用方法容量設定吸液槍頭安裝預洗吸液槍頭吸液放液卸取吸液槍頭①吸液槍頭安裝：應采取旋轉安裝法，用力不能過猛。②吸液：先向下按壓推動桿，至第一停點，然后將吸液槍頭垂直浸入液面，再平穩(wěn)松開。三、方法步驟微量移液器的使用方法③放液：將吸液槍頭緊貼容器壁，先向下按壓推動桿，至第一停點，稍作停頓后再按至第二停點，確保吸液槍頭內沒有液體殘留。注意：在使用過程中，不能超量程使用微量移液器。使用一次性屏蔽式吸液槍頭有助于防止吸取的液體流入微量移液器，從而減少實驗過程中的交叉污染。拓展2三、方法步驟1．DNA片斷的擴增（3）離心

待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管底部。三、方法步驟（4）反應參照下表的參數設置，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃，5min//30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min1．DNA片斷的擴增三、方法步驟配置瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳觀察結果1．DNA片斷的擴增三、方法步驟2．DNA片斷的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液

根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液（一般質量體積比為0.8%~1.2%）。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后加入適量的核酸染料混勻。三、方法步驟將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。制備凝膠2．DNA片斷的電泳鑒定加樣三、方法步驟將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔，加入指示分子大小的標準參照物。2．DNA片斷的電泳鑒定三、方法步驟接通電源，設定電壓（一般為1~5V/cm），待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。電泳觀察結果在紫外燈下觀察和照相，并與核酸分子量標準參照物比較被擴增產物的大小。2．DNA片斷的電泳鑒定四、結果分析與評價1．你是否成功擴增出DNA片段，判斷的依據是什么？可通過在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。2．你進行電泳鑒定的結果是幾條帶，如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。一次成功的DNA片段擴增應產生與預期大小一致的DNA片段。若出現不一致的結果可能的原因兩類。四、結果分析與評價2．你進行電泳鑒定的結果是幾條帶，如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。（1）如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應組分，各反應組分的用量不當，PCR程序設置不當等。（2）擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好。四、結果分析與評價（1）將凝膠放入電泳槽后，應確保加樣孔內充滿電泳緩沖液，且沒有氣泡，否則會影響加樣。（2）DNA可發(fā)生兩性解離，當電泳緩沖液的pH值大于其等電點時，DNA分子帶負電；當電泳緩沖液的pH小于其等電點時，DNA分子帶正電。一般使用的電泳緩沖液調pH為8，DNA分子帶負電，向正極泳動。注意事項四、結果分析與評價（3）為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。（4）該實驗所需的材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。（5）在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑，移液器的槍頭都必須更換。（6）在進行操作時一定要戴好一次性手套。注意事項課堂小結實驗原理實驗用具實驗步驟DNA片段的擴增電泳鑒定準備移液離心反應DNA片段的擴增電泳鑒定試劑用具配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳觀察結果課堂檢測1．進行PCR反應的具體實驗操作順序應為（

）（1） 離心使反應液集中在試管底部（2）用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分（3） 按配方準備好各組分（4）進行PCR反應（5）設計好PCR反應的循環(huán)流程A．（2）（3）（5）（4）（1）B．（1）（5）（3）（2）（4）C．（4）（2）（5）（3）（1）D．（3）（2）（1）（5）（4）D課堂檢測