融合蛋白及其應用課件

融合蛋白及其應用融合蛋白及其應用1主要內容融合蛋白的概念融合蛋白技術概況融合蛋白技術的臨床應用常見的幾種融合蛋白主要內容融合蛋白的概念2一、融合蛋白的概念

在基因工程迅速發(fā)展的基礎上，有目的地把兩段或多段編碼功能蛋白的基因連接在一起，進而表達所需蛋白，這種通過在人工條件下將兩個或多個基因的編碼區(qū)首尾連接，由同一調控序列控制構成的基因表達后所得的蛋白質產(chǎn)物稱為融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn)P)。一、融合蛋白的概念在基因工程迅速發(fā)展的基3二、融合蛋白技術概況

融合蛋白技術是為獲得大量標準融合蛋白而進行的有目的性的基因融合和蛋白表達方法。利用融合蛋白技術，可構建和表達具有多種功能的新型目的蛋白。二、融合蛋白技術概況融合蛋白技術是為4（一）融合蛋白技術的特點融合基因可在原核細胞(如大腸桿菌)也可在真核細胞中進行表達。原核表達系統(tǒng)的特點是時程短，費用低，是科研中的主要工具。其缺點是真核蛋白表達沒有得到確切修飾；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵體聚合物，需要復雜的變性和復性過程；大量蛋白的分泌較困難。（一）融合蛋白技術的特點融合基因可在原核細胞(如大腸桿菌)5（一）融合蛋白技術的特點真核表達系統(tǒng)的特點是蛋白翻譯后加工機會多，甚至可被改造成人源型；真核細胞易被轉染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性；產(chǎn)物可被分泌，提純簡單，成本低。

（一）融合蛋白技術的特點真核表達系統(tǒng)的特點是蛋白翻譯后加工機6（二）融合蛋白技術的內容構建融合蛋白的基本原則是，將第一個蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個蛋白基因，以實現(xiàn)兩個基因的共同表達。具體步驟有：1.進行目的基因的克隆：根據(jù)基因序列互補原則，設計合適的引物序列，以cDNA為模板，利用PCR技術擴增不同的目的DNA片段。（二）融合蛋白技術的內容構建融合蛋白的基本原則是，將第一個7（二）融合蛋白技術的內容2.在載體中進行重組：通過限制內切酶將兩個DNA片段進行酶切并回收，然后通過連接酶將兩個具有相同末端酶切位點的基因片段進行體外連接，并克隆到高表達質粒載體中，構建重組質粒。（二）融合蛋白技術的內容2.在載體中進行重組：通過限制內切酶8（二）融合蛋白技術的內容3.將重組表達載體轉染宿主細胞并利用選擇標志進行篩選及測序。4.融合基因的誘導表達及表達蛋白的純化。（二）融合蛋白技術的內容3.將重組表達載體轉染宿主細胞并利用9（三）融合蛋白技術的關鍵在構建融合蛋白中，一個關鍵的問題是兩蛋白間的接頭序列(Linker)，即連接肽。它的長度對蛋白質的折疊和穩(wěn)定性非常重要。如果接頭序列太短，可能影響兩蛋白高級結構的折疊，從而相互干擾；如果接頭序列太長，又涉及免疫原性的問題，因為接頭序列本身就是新的抗原。（三）融合蛋白技術的關鍵在構建融合蛋白中，一個關鍵的問題是兩10（三）融合蛋白技術的關鍵

一般來說，3-5個氨基酸的Linker可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。有人嘗試在融合蛋白間加入一段有疏水性和一定伸展性的較長肽鏈，如(Gly4Ser1)，目的是將兩者分開，以緩解相互干擾作用，并獲得了滿意的結果。（三）融合蛋白技術的關鍵一般來說，3-5個氨基酸的Li11（三）融合蛋白技術的關鍵

但具體涉及到每種蛋白時，需具體分析。當我們構建融合蛋白時，應多選擇幾種融合方式，從中優(yōu)化出理想的連接方式。另外，大量研究表明連接肽的柔性和疏水性對不擾亂蛋白質的功能結構域是十分重要的。（三）融合蛋白技術的關鍵但具體涉及到每種蛋白時，需具體分析12（三）融合蛋白技術的關鍵遺憾的是，目前對于連接肽序列的設計還沒有可靠的選擇標準。現(xiàn)在，大多數(shù)連接肽序列的設計和選擇仍主要依賴于直覺。盡管依賴于蛋白質的一級結構來預測其二級結構已經(jīng)產(chǎn)生了重大的進步，但是我們對于序列和結構之間的關系的了解還是很有限的。（三）融合蛋白技術的關鍵遺憾的是，目前對于連接肽序列的設計還13三、融合蛋白技術的臨床

應用DNA疫苗雙功能酶（多功能酶）定向藥物溶栓劑抗菌肽三、融合蛋白技術的臨床

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（一）DNA疫苗

目前，疫苗已經(jīng)經(jīng)歷了三代：第一代疫苗是用減毒或殺死的病原體來激活機體免疫系統(tǒng)；第二代疫苗是用生物技術和重組DNA技術研制的組分疫苗注射機體誘導免疫應答；第三代疫苗是直接注射基因重組的抗原基因來激活人體免疫系統(tǒng)，即DNA疫苗。（一）DNA疫苗目前，疫苗15

（一）DNA疫苗DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢，如易于生產(chǎn)，穩(wěn)定性強，成本低廉等，并可同時誘導體液與細胞免疫應答。（一）DNA疫苗DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯16

（一）DNA疫苗DNA疫苗的免疫方法是將帶有目的基因并能在真核細胞中表達的細菌質粒直接導入動物體內，通過在體內表達目的蛋白以引起機體對該蛋白的免疫應答。

（一）DNA疫苗DNA疫苗的免疫方法是將帶有目17

（一）DNA疫苗目前利用基因工程成功制成的多價重組抗體融合蛋白CYF196(國內尚未上市)就是一種DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因為CYF196對病毒的主要受體-位于呼吸道上皮中的細胞間黏附分子有高度親和力，對鼻病毒感染有較強的防御功能。（一）DNA疫苗目前利用基因工程成功制成的多價18（二）雙功能酶（多功能酶）

以往研究發(fā)現(xiàn)，在利用基因融合所構建的大的酶分子中，如果用以構成融合蛋白的各個酶分子的整個編碼序列均保留于新的酶分子中，則融合蛋白一般均保留所構成的酶分子各自的酶活性。（二）雙功能酶（多功能酶）以往研究發(fā)現(xiàn)19（二）雙功能酶（多功能酶）

并且發(fā)現(xiàn)在這些新構建的融合蛋白中，蛋白的正確折疊以及各個酶的活性部位均未受到影響，與單個酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對于催化連續(xù)反應的兩種或幾種酶，利用基因融合的方法構成的融合蛋白可產(chǎn)生“鄰近效應”（proximityeffect）。（二）雙功能酶（多功能酶）并且發(fā)現(xiàn)在這些新20（二）雙功能酶（多功能酶）目前研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯(lián)反應產(chǎn)生NADH的速度是同時加入這兩種酶的反應速度的兩倍以上。同時過渡態(tài)時間縮短近四倍。（二）雙功能酶（多功能酶）目前研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶-半21（三）定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結合的配基。通過融合蛋白技術將這兩部分融合在一起，即可構成一個具有獨特構象與功能的蛋白質。（三）定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部22（三）定向藥物特點：它可以特異性地與靶細胞或致病因子結合，并把藥物引導至病灶處，從而大大提高藥物的效力。可以選擇性地殺傷相應的抗原相關細胞或受體相關細胞，對其他無關細胞影響較少或無影響。（三）定向藥物特點：它可以特異性地與靶細胞或致病因子結合，并23（三）定向藥物配基常是腫瘤特異性抗體、細胞因子或激素等導向物質，藥物常是毒性分子（如動植物毒素、放療、化療藥物或細菌毒素等）。

（三）定向藥物配基常是腫瘤特異性抗體、細胞因子或激素等導向物24（四）溶栓劑新型溶栓劑的要求是具有多種功能，既有較高的溶栓活性，又有較強的纖維蛋白的親和性或抑制血栓的功能，從而使溶栓劑具有較高的纖維蛋白專一性，減少出血副作用，降低溶栓藥物使用后再栓塞形成的可能性。（四）溶栓劑新型溶栓劑的要求是具有多種功能，既有較高的溶栓活25（四）溶栓劑

凝血酶在血小板激活后促進纖維蛋白酶原轉化為纖維蛋白，在凝血過程中起主要作用，在動物模型和人體中，肝素是凝血酶間接抑制劑，水蛭素則是其直接抑制劑。單克隆抗體mAb59D能靶向血塊，mAb59D8與纖溶酶原活化因子偶合能達到靶向治療和有效溶栓的目的。（四）溶栓劑凝血酶在血小板激活后促進纖維26（四）溶栓劑但兩者化學結合不僅產(chǎn)量低，而且在生產(chǎn)過程中部分損失了水蛭素的溶栓活性。利用基因融合技術，把水蛭素和mAb59D8的纖維蛋白原片段融合，融合蛋白在穩(wěn)態(tài)時無作用，只有用凝血酶原激酶(Ax)對它進行切割激活后，才有活性。（四）溶栓劑但兩者化學結合不僅產(chǎn)量低，而且在生產(chǎn)過程中部分損27（四）溶栓劑利用分子克隆技術，這種融合蛋白能成功轉錄并高效表達于59D8雜交瘤細胞系，這種策略結合了靶向溶栓和Ax因子激活，有效地在血栓處發(fā)揮作用，對全身的副作用很小。（四）溶栓劑利用分子克隆技術，這種融合蛋白能成功轉錄并高28（五）抗菌肽肽類抗生素又名抗菌肽，機體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其對耐藥菌的強大抗菌作用而受到人們關注。它廣泛存在于動植物體內，是由生物體特定基因編碼的一類陽離子小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，是機體天然免疫的重要組成部分。（五）抗菌肽肽類抗生素又名抗菌肽，機體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其29（五）抗菌肽研究結果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制HIV-1的基因表達，減少HIV-1的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外，也具有抗病毒的特性，已有研究證實人源溶菌酶具有抗HIV-1的作用。（五）抗菌肽研究結果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制HI30（五）抗菌肽目前已有人構建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達載體。并成功表達出了具有抗菌和抗病毒雙重活性的重組蛋白。（五）抗菌肽目前已有人構建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達31四、常見的幾種融合蛋白

（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白（二）甲狀旁腺激素（PTH）融合蛋白（三）細胞因子重組融合蛋白四、常見的幾種融合蛋白（一）32（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白Ig融合蛋白是指在基因水平將目的基因同Ig部分片段基因相連，并在真核或原核細胞中表達出的具有上述兩部分結構域的重組蛋白。據(jù)目的蛋白與Ig不同片斷相連，可將其分為二大類：一類為Fab(Fv)融合蛋白；另一類為Fc融合蛋白。

（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白Ig融合蛋白是指在基因水平將331、Fab(Fv)融合蛋Fab(Fv)融合蛋白主要是將Fab(Fv)段與其他生物活性蛋白結合，利用抗體對抗原的特異識別功能將活性蛋白導向特定部位。使活性蛋白在特定部位發(fā)揮生物作用。常見的與Fab融合的蛋白有毒素、細胞因子、受體、酶等。1、Fab(Fv)融合蛋Fab(Fv)融合蛋白主要是將34腫瘤靶向免疫治療將一些生物活性蛋白(如毒素、細胞因子等)與抗腫瘤抗體的Fab段融合，利用抗體對腫瘤抗原的識別作用而進行靶向免疫治療。腫瘤靶向免疫治療將一些生物活性蛋白(如毒素、細胞因子等)與35腫瘤靶向免疫治療如ForsbergG等利用抗癌胚抗原(CEA)抗體的Fab段與葡萄球菌腸毒素(SEA)融合組成一個超抗原，融合超抗原可導向腫瘤細胞并激活T細胞殺死表達有癌胚抗原腫瘤細胞。腫瘤靶向免疫治療如ForsbergG等利用抗癌胚抗原(C36腫瘤靶向免疫治療而將T細胞共刺激分子B7與抗瘤抗體結合就可將B7導向腫瘤細胞。B7-抗瘤抗體，一方面與腫瘤細胞表面抗原結合，一方面提供共刺激信號給T細胞能有效觸發(fā)腫瘤特異細胞毒T細胞反應。腫瘤靶向免疫治療而將T細胞共刺激分子B7與抗瘤抗體結合就可將372、Fc融合蛋白Fc融合蛋白主要是將生物活性蛋白與Ig的絞鏈區(qū)及CH2、CH3區(qū)結合。與Fc段融合的蛋白種類很多，其作用也各不相同，歸納起來有如下幾方面：2、Fc融合蛋白Fc融合蛋白主要是將生物活性蛋白與Ig的絞38（1）抗病毒感染目前發(fā)現(xiàn)使用DNA疫苗加上IL-2-Ig融合蛋白注射到實驗用的恒河猴，然后高劑量靜脈內給恒河猴注射SHIV病毒。雖然它們不能阻止猴被SHIV病毒感染，但確實可控制病毒血癥到幾乎測不到的水平，并預防免疫缺陷和臨床癥狀。（1）抗病毒感染目前發(fā)現(xiàn)使用DNA疫苗加上IL-2-Ig融39（1）抗病毒感染目前IL-2已用于臨床治療HIV和癌癥，但由于IL-2在活體內半衰期短，有毒性作用及成本高，其臨床治療作用受限。而用IL2-Ig融合蛋白，它有IL-2的免疫刺激活性且半衰期長，用它注入健康恒河猴可誘導T細胞數(shù)目增加并表達CD25。（1）抗病毒感染目前IL-2已用于臨床治療HIV和癌癥，但由40（2）治療痛覺過敏Etanercept，一個重組TNFR-Fc融合蛋白，可競爭性抑制TNF，它已成功用于治療類風濕性關節(jié)炎的病人，能減少疼痛和炎癥，在神經(jīng)損傷后，由于局部產(chǎn)生前炎性細胞因子對疼痛產(chǎn)生起一個主要作用。給坐骨神經(jīng)慢性壓縮性損傷的鼠注射Etanercept可減少熱痛覺過敏和機械性異常性疼痛。（2）治療痛覺過敏Etanercept，一個重組TNF41（2）治療痛覺過敏實驗誘導豬神經(jīng)根損傷，同時給豬注射Etanercept7天后顯示Etanercept能預防神經(jīng)傳導速度的減低，限制神經(jīng)纖維損傷，防止毛細血管內血栓和神經(jīng)內水腫形成。預示Etanercept可用于治療椎間盤突出和坐骨神經(jīng)痛。（2）治療痛覺過敏實驗誘導豬神經(jīng)根損傷，同時給豬注射Et42（3）類風濕性關節(jié)炎的治療類風濕性關節(jié)炎(RA)是一個系統(tǒng)性疾病，以關節(jié)滑膜慢性炎癥反應為特征并有軟骨變性和關節(jié)旁骨的侵蝕。（3）類風濕性關節(jié)炎的治療類風濕性關節(jié)炎(RA)是一個系統(tǒng)43（3）類風濕性關節(jié)炎的治療已知TNF與RA的發(fā)病機理有很大關系，許多實驗證實用人可溶性重組TNF受體與IgFc段蛋白融合可完全競爭性抑制TNF結合到細胞表面受體，使TNF無生物活性。給病人注射Etanercept可減少關節(jié)腫脹及炎癥，減少關節(jié)腔狹窄。臨床上已用于治療類風濕性關節(jié)炎。（3）類風濕性關節(jié)炎的治療已知TNF與RA的發(fā)病機理有很大關44（4）用于其他科學研究融合蛋白還可以作為一種研究工具應用于許多方面的研究，如人表皮生長因子受體2蛋白(HER2)向上調節(jié)血管促白細胞生成素(Ang-2)的表達，而利用酪氨酸蛋白激酶受體-2-Fc(Tie-2/Fc)融合蛋白將減少腫瘤細胞釋放血管促白細胞生成素，這樣就可研究HER2對微血管的折除(dismantle)作用。（4）用于其他科學研究融合蛋白還可以作為一種研究工具應用于45（二）PTH融合蛋白甲狀旁腺激素(ParathyroidHormone，PTH)是由甲狀旁腺主細胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，成熟PTH含84個氨基酸殘基，分子量約為9500，是人體內調節(jié)鈣磷代謝及骨轉換的最為重要的激素之一。它主要通過作用于靶細胞膜上腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，增加胞漿內cAMP及焦磷酸鹽(PPi)的水平來發(fā)揮作用。（二）PTH融合蛋白甲狀旁腺激素(Parathyroid46蛋白類藥物的分子量若小于20kD在代謝過程中易被腎小球濾過，且在體內的半衰期較短，皮下給藥或肌肉注射的半衰期一般在12h左右。因此，長效蛋白藥物的研制已成為對第一代基因工程產(chǎn)品進行二次開發(fā)的一個重要方向，而增加分子量則是一個通用的策略。人們已經(jīng)采用多種方法來對PTH的性質進行改進，以在保留它的活性的同時提高半衰期。其中包括構建突變體、化學修飾以及基因融合等，而基因融合技術為最突出的。蛋白類藥物的分子量若小于20kD在代謝過程中易被腎小球濾過47常用的融合蛋白的載體有人血清白蛋白(Humaserumalbumin，HSA)融合蛋白、β-半乳糖苷酶融合蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合蛋白以及硫氧還蛋白(Trx)融合蛋白等。而人血清白蛋白(HSA)則由于本身特殊的優(yōu)點，更適合于充當長效融合蛋白類藥物的融合載體。常用的融合蛋白的載體有人血清白蛋白(Humaseru48HSA是包含585個氨基酸殘基的單鏈無糖基化的球形蛋白質，分子量65kD。它是人血漿中含量最高的單一蛋白質(達40g/L)，在體內有維持血液滲透壓，運輸營養(yǎng)和其它重要生物物質的作用。HSA本身是許多內源因子和外源藥物的載體。藥物和血清白蛋白結合后。可以減少其生物利用度，增加在體內的半衰期至19d之久。HSA是包含585個氨基酸殘基的單鏈無糖基化49人血清白蛋白融合技術具有明顯的優(yōu)點，包括：HSA與目標蛋白在胞內經(jīng)蛋白翻譯系統(tǒng)通過肽鍵連接，不需額外的體外處理；HSA表達水平較高，融合后可以提高目的蛋白的表達水平；HSA是一個穩(wěn)定的“惰性”蛋白，融合后可以提高目的蛋白的穩(wěn)定性；HAS融合蛋白具有比PEG修飾的蛋白藥物更長的半衰期。人血清白蛋白融合技術具有明顯的優(yōu)點，包括50（三）細胞因子重組融合蛋白細胞因子重組融合蛋白是一類利用基因工程的方法將編碼細胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接并表達相應蛋白質融合產(chǎn)物。其結構特點為將細胞因子功能活性域與其他分子的活性域融合，各組分可發(fā)揮協(xié)同作用，使融合蛋白的生物學活性較各單體大大增強。（三）細胞因子重組融合蛋白細胞因子重組融合蛋白是一類利用基因51按生物學功能的不同可分為：細胞因子與抗體的融合蛋白、細胞因子與毒素的融合蛋白、不同細胞因子的融合蛋白、細胞因子與細胞因子受體的融合蛋白以及細胞因子與其他分子的融合蛋白。這些兼具特異性與高效性的新型重組融合蛋白有些已走向臨床，在抗腫瘤、抗風濕病、抗HIV感染等領域發(fā)揮作用，為人類疾病的治療提供新的手段。

按生物學功能的不同可分為：細胞因子與抗體521、細胞因子與毒素的融合蛋白在一些腫瘤細胞表面存在許多細胞因子受體，可利用細胞因子作為靶向載體將細胞毒素運送到腫瘤微環(huán)境以殺傷腫瘤細胞。白喉毒素與細胞因子的重組融合蛋白便是這樣一類能直接殺傷靶細胞的免疫制劑。1、細胞因子與毒素的融合蛋白在一些腫瘤細胞表面存在許多細胞因53體外試驗表明，白喉毒素-IL-2的融合蛋白(DAB389IL-2)對表達高親和力IL-2受體的細胞株起毒性作用，而缺乏完整的高親和力受體的細胞株(有p55亞單位而無p75亞單位)則對該融合毒素相對耐受。細胞結合該融合毒素后，可觀察到類似于IL-2刺激之后的情況，即IL-2、IL-2受體的mRNA的表達增高，蛋白合成在4-6h內開始受抑制，繼發(fā)的凋亡則在40-72h內發(fā)生。體外試驗表明，白喉毒素-IL-2的融合蛋白(DAB389I54Saleh等報道DAB389IL-2在皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneousTcelllymphoma，CTCL)1期臨床試驗中單獨使用顯示出顯著的臨床治療效果。DAB389IL-2已成為美國食品與藥品管理局(FDA)核準的臨床治療藥物。

Saleh等報道DAB389IL-2在皮膚T細胞淋巴瘤(c552、細胞因子與細胞因

子受體的融合蛋白通過將在體內發(fā)揮作用時相互依賴或者所具有的協(xié)同作用細胞因子與細胞因子受體基因重組，可大大促進其生物學活性的發(fā)揮。IL-6在肝細胞的增殖中起著增強作用。IL-6和IL-6Rα(gp80)的結合使其易于和另一個受體IL-6Rβ(gpl30)結合。2、細胞因子與細胞因

子受體的融合蛋白通過將在體內56Fischer等用基因重組的方法構建了一種IL-6-slL-6R融合蛋白hyper-IL-6。在gpl30細胞上，該融合蛋白表現(xiàn)出了完全的生物學活性，而所需濃度僅為非融合形式的IL-6和slL-6R的100至1000分之一，因而被用于在體外有效的擴增造血祖細胞，且該作用具有劑量依賴關系。進一步的大鼠體內試驗表明，hyper-IL-6可逆轉亞致死性或致死性肝毒性損傷，且此作用不可被IL-6替代。Fischer等用基因重組的方法構建了一種IL-6-slL573、細胞因子與其他

分子的融合蛋白細胞因子還被設計與其他生物活性分子如某些腫瘤相關抗原，信號轉導途徑中的相關分子等融合。Aqeilan等報道了一個新的人融合蛋白IL-2-Bax用于靶向治療。Bax屬于Bcl-2蛋白家族，為促凋亡因子。3、細胞因子與其他

分子的融合蛋白細胞因子還被設計58誘導Bax表達便可介導細胞凋亡而不需要附加的細胞死亡刺激信號，且通過凋亡途徑殺傷靶細胞可使組織損傷和全身性反應降至最低。研究表明，該融合蛋白介導的靶細胞凋亡呈劑量依賴關系。靶向性細胞因子和凋亡蛋白融合產(chǎn)物在體內及體外可選擇性殺傷特定類型細胞，開創(chuàng)了疾病靶向治療新視野。誘導Bax表達便可介導細胞凋亡而不需要附加的細胞死亡刺激信59目前，細胞因子融舍蛋白在腫瘤治療研究中取得了很大進展，已成為細胞因子研究中的一個熱點領域。由于機體很多功能是由細胞因子共同作用、相互協(xié)調完成的。因此，雙因子的協(xié)同作用能夠實現(xiàn)細胞因子與其它功能分子之間作用的優(yōu)化，為腫瘤治療提供了新的途徑。目前，細胞因子融舍蛋白在腫瘤治療研究中取得了很大進展，60

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61融合蛋白及其應用融合蛋白及其應用62主要內容融合蛋白的概念融合蛋白技術概況融合蛋白技術的臨床應用常見的幾種融合蛋白主要內容融合蛋白的概念63一、融合蛋白的概念

在基因工程迅速發(fā)展的基礎上，有目的地把兩段或多段編碼功能蛋白的基因連接在一起，進而表達所需蛋白，這種通過在人工條件下將兩個或多個基因的編碼區(qū)首尾連接，由同一調控序列控制構成的基因表達后所得的蛋白質產(chǎn)物稱為融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn)P)。一、融合蛋白的概念在基因工程迅速發(fā)展的基64二、融合蛋白技術概況

融合蛋白技術是為獲得大量標準融合蛋白而進行的有目的性的基因融合和蛋白表達方法。利用融合蛋白技術，可構建和表達具有多種功能的新型目的蛋白。二、融合蛋白技術概況融合蛋白技術是為65（一）融合蛋白技術的特點融合基因可在原核細胞(如大腸桿菌)也可在真核細胞中進行表達。原核表達系統(tǒng)的特點是時程短，費用低，是科研中的主要工具。其缺點是真核蛋白表達沒有得到確切修飾；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵體聚合物，需要復雜的變性和復性過程；大量蛋白的分泌較困難。（一）融合蛋白技術的特點融合基因可在原核細胞(如大腸桿菌)66（一）融合蛋白技術的特點真核表達系統(tǒng)的特點是蛋白翻譯后加工機會多，甚至可被改造成人源型；真核細胞易被轉染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性；產(chǎn)物可被分泌，提純簡單，成本低。

（一）融合蛋白技術的特點真核表達系統(tǒng)的特點是蛋白翻譯后加工機67（二）融合蛋白技術的內容構建融合蛋白的基本原則是，將第一個蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個蛋白基因，以實現(xiàn)兩個基因的共同表達。具體步驟有：1.進行目的基因的克?。焊鶕?jù)基因序列互補原則，設計合適的引物序列，以cDNA為模板，利用PCR技術擴增不同的目的DNA片段。（二）融合蛋白技術的內容構建融合蛋白的基本原則是，將第一個68（二）融合蛋白技術的內容2.在載體中進行重組：通過限制內切酶將兩個DNA片段進行酶切并回收，然后通過連接酶將兩個具有相同末端酶切位點的基因片段進行體外連接，并克隆到高表達質粒載體中，構建重組質粒。（二）融合蛋白技術的內容2.在載體中進行重組：通過限制內切酶69（二）融合蛋白技術的內容3.將重組表達載體轉染宿主細胞并利用選擇標志進行篩選及測序。4.融合基因的誘導表達及表達蛋白的純化。（二）融合蛋白技術的內容3.將重組表達載體轉染宿主細胞并利用70（三）融合蛋白技術的關鍵在構建融合蛋白中，一個關鍵的問題是兩蛋白間的接頭序列(Linker)，即連接肽。它的長度對蛋白質的折疊和穩(wěn)定性非常重要。如果接頭序列太短，可能影響兩蛋白高級結構的折疊，從而相互干擾；如果接頭序列太長，又涉及免疫原性的問題，因為接頭序列本身就是新的抗原。（三）融合蛋白技術的關鍵在構建融合蛋白中，一個關鍵的問題是兩71（三）融合蛋白技術的關鍵

一般來說，3-5個氨基酸的Linker可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求。有人嘗試在融合蛋白間加入一段有疏水性和一定伸展性的較長肽鏈，如(Gly4Ser1)，目的是將兩者分開，以緩解相互干擾作用，并獲得了滿意的結果。（三）融合蛋白技術的關鍵一般來說，3-5個氨基酸的Li72（三）融合蛋白技術的關鍵

但具體涉及到每種蛋白時，需具體分析。當我們構建融合蛋白時，應多選擇幾種融合方式，從中優(yōu)化出理想的連接方式。另外，大量研究表明連接肽的柔性和疏水性對不擾亂蛋白質的功能結構域是十分重要的。（三）融合蛋白技術的關鍵但具體涉及到每種蛋白時，需具體分析73（三）融合蛋白技術的關鍵遺憾的是，目前對于連接肽序列的設計還沒有可靠的選擇標準。現(xiàn)在，大多數(shù)連接肽序列的設計和選擇仍主要依賴于直覺。盡管依賴于蛋白質的一級結構來預測其二級結構已經(jīng)產(chǎn)生了重大的進步，但是我們對于序列和結構之間的關系的了解還是很有限的。（三）融合蛋白技術的關鍵遺憾的是，目前對于連接肽序列的設計還74三、融合蛋白技術的臨床

應用DNA疫苗雙功能酶（多功能酶）定向藥物溶栓劑抗菌肽三、融合蛋白技術的臨床

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（一）DNA疫苗

目前，疫苗已經(jīng)經(jīng)歷了三代：第一代疫苗是用減毒或殺死的病原體來激活機體免疫系統(tǒng)；第二代疫苗是用生物技術和重組DNA技術研制的組分疫苗注射機體誘導免疫應答；第三代疫苗是直接注射基因重組的抗原基因來激活人體免疫系統(tǒng)，即DNA疫苗。（一）DNA疫苗目前，疫苗76

（一）DNA疫苗DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢，如易于生產(chǎn)，穩(wěn)定性強，成本低廉等，并可同時誘導體液與細胞免疫應答。（一）DNA疫苗DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯77

（一）DNA疫苗DNA疫苗的免疫方法是將帶有目的基因并能在真核細胞中表達的細菌質粒直接導入動物體內，通過在體內表達目的蛋白以引起機體對該蛋白的免疫應答。

（一）DNA疫苗DNA疫苗的免疫方法是將帶有目78

（一）DNA疫苗目前利用基因工程成功制成的多價重組抗體融合蛋白CYF196(國內尚未上市)就是一種DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因為CYF196對病毒的主要受體-位于呼吸道上皮中的細胞間黏附分子有高度親和力，對鼻病毒感染有較強的防御功能。（一）DNA疫苗目前利用基因工程成功制成的多價79（二）雙功能酶（多功能酶）

以往研究發(fā)現(xiàn)，在利用基因融合所構建的大的酶分子中，如果用以構成融合蛋白的各個酶分子的整個編碼序列均保留于新的酶分子中，則融合蛋白一般均保留所構成的酶分子各自的酶活性。（二）雙功能酶（多功能酶）以往研究發(fā)現(xiàn)80（二）雙功能酶（多功能酶）

并且發(fā)現(xiàn)在這些新構建的融合蛋白中，蛋白的正確折疊以及各個酶的活性部位均未受到影響，與單個酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對于催化連續(xù)反應的兩種或幾種酶，利用基因融合的方法構成的融合蛋白可產(chǎn)生“鄰近效應”（proximityeffect）。（二）雙功能酶（多功能酶）并且發(fā)現(xiàn)在這些新81（二）雙功能酶（多功能酶）目前研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯(lián)反應產(chǎn)生NADH的速度是同時加入這兩種酶的反應速度的兩倍以上。同時過渡態(tài)時間縮短近四倍。（二）雙功能酶（多功能酶）目前研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶-半82（三）定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結合的配基。通過融合蛋白技術將這兩部分融合在一起，即可構成一個具有獨特構象與功能的蛋白質。（三）定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部83（三）定向藥物特點：它可以特異性地與靶細胞或致病因子結合，并把藥物引導至病灶處，從而大大提高藥物的效力?？梢赃x擇性地殺傷相應的抗原相關細胞或受體相關細胞，對其他無關細胞影響較少或無影響。（三）定向藥物特點：它可以特異性地與靶細胞或致病因子結合，并84（三）定向藥物配基常是腫瘤特異性抗體、細胞因子或激素等導向物質，藥物常是毒性分子（如動植物毒素、放療、化療藥物或細菌毒素等）。

（三）定向藥物配基常是腫瘤特異性抗體、細胞因子或激素等導向物85（四）溶栓劑新型溶栓劑的要求是具有多種功能，既有較高的溶栓活性，又有較強的纖維蛋白的親和性或抑制血栓的功能，從而使溶栓劑具有較高的纖維蛋白專一性，減少出血副作用，降低溶栓藥物使用后再栓塞形成的可能性。（四）溶栓劑新型溶栓劑的要求是具有多種功能，既有較高的溶栓活86（四）溶栓劑

凝血酶在血小板激活后促進纖維蛋白酶原轉化為纖維蛋白，在凝血過程中起主要作用，在動物模型和人體中，肝素是凝血酶間接抑制劑，水蛭素則是其直接抑制劑。單克隆抗體mAb59D能靶向血塊，mAb59D8與纖溶酶原活化因子偶合能達到靶向治療和有效溶栓的目的。（四）溶栓劑凝血酶在血小板激活后促進纖維87（四）溶栓劑但兩者化學結合不僅產(chǎn)量低，而且在生產(chǎn)過程中部分損失了水蛭素的溶栓活性。利用基因融合技術，把水蛭素和mAb59D8的纖維蛋白原片段融合，融合蛋白在穩(wěn)態(tài)時無作用，只有用凝血酶原激酶(Ax)對它進行切割激活后，才有活性。（四）溶栓劑但兩者化學結合不僅產(chǎn)量低，而且在生產(chǎn)過程中部分損88（四）溶栓劑利用分子克隆技術，這種融合蛋白能成功轉錄并高效表達于59D8雜交瘤細胞系，這種策略結合了靶向溶栓和Ax因子激活，有效地在血栓處發(fā)揮作用，對全身的副作用很小。（四）溶栓劑利用分子克隆技術，這種融合蛋白能成功轉錄并高89（五）抗菌肽肽類抗生素又名抗菌肽，機體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其對耐藥菌的強大抗菌作用而受到人們關注。它廣泛存在于動植物體內，是由生物體特定基因編碼的一類陽離子小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，是機體天然免疫的重要組成部分。（五）抗菌肽肽類抗生素又名抗菌肽，機體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其90（五）抗菌肽研究結果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制HIV-1的基因表達，減少HIV-1的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外，也具有抗病毒的特性，已有研究證實人源溶菌酶具有抗HIV-1的作用。（五）抗菌肽研究結果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制HI91（五）抗菌肽目前已有人構建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達載體。并成功表達出了具有抗菌和抗病毒雙重活性的重組蛋白。（五）抗菌肽目前已有人構建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達92四、常見的幾種融合蛋白

（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白（二）甲狀旁腺激素（PTH）融合蛋白（三）細胞因子重組融合蛋白四、常見的幾種融合蛋白（一）93（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白Ig融合蛋白是指在基因水平將目的基因同Ig部分片段基因相連，并在真核或原核細胞中表達出的具有上述兩部分結構域的重組蛋白。據(jù)目的蛋白與Ig不同片斷相連，可將其分為二大類：一類為Fab(Fv)融合蛋白；另一類為Fc融合蛋白。

（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白Ig融合蛋白是指在基因水平將941、Fab(Fv)融合蛋Fab(Fv)融合蛋白主要是將Fab(Fv)段與其他生物活性蛋白結合，利用抗體對抗原的特異識別功能將活性蛋白導向特定部位。使活性蛋白在特定部位發(fā)揮生物作用。常見的與Fab融合的蛋白有毒素、細胞因子、受體、酶等。1、Fab(Fv)融合蛋Fab(Fv)融合蛋白主要是將95腫瘤靶向免疫治療將一些生物活性蛋白(如毒素、細胞因子等)與抗腫瘤抗體的Fab段融合，利用抗體對腫瘤抗原的識別作用而進行靶向免疫治療。腫瘤靶向免疫治療將一些生物活性蛋白(如毒素、細胞因子等)與96腫瘤靶向免疫治療如ForsbergG等利用抗癌胚抗原(CEA)抗體的Fab段與葡萄球菌腸毒素(SEA)融合組成一個超抗原，融合超抗原可導向腫瘤細胞并激活T細胞殺死表達有癌胚抗原腫瘤細胞。腫瘤靶向免疫治療如ForsbergG等利用抗癌胚抗原(C97腫瘤靶向免疫治療而將T細胞共刺激分子B7與抗瘤抗體結合就可將B7導向腫瘤細胞。B7-抗瘤抗體，一方面與腫瘤細胞表面抗原結合，一方面提供共刺激信號給T細胞能有效觸發(fā)腫瘤特異細胞毒T細胞反應。腫瘤靶向免疫治療而將T細胞共刺激分子B7與抗瘤抗體結合就可將982、Fc融合蛋白Fc融合蛋白主要是將生物活性蛋白與Ig的絞鏈區(qū)及CH2、CH3區(qū)結合。與Fc段融合的蛋白種類很多，其作用也各不相同，歸納起來有如下幾方面：2、Fc融合蛋白Fc融合蛋白主要是將生物活性蛋白與Ig的絞99（1）抗病毒感染目前發(fā)現(xiàn)使用DNA疫苗加上IL-2-Ig融合蛋白注射到實驗用的恒河猴，然后高劑量靜脈內給恒河猴注射SHIV病毒。雖然它們不能阻止猴被SHIV病毒感染，但確實可控制病毒血癥到幾乎測不到的水平，并預防免疫缺陷和臨床癥狀。（1）抗病毒感染目前發(fā)現(xiàn)使用DNA疫苗加上IL-2-Ig融100（1）抗病毒感染目前IL-2已用于臨床治療HIV和癌癥，但由于IL-2在活體內半衰期短，有毒性作用及成本高，其臨床治療作用受限。而用IL2-Ig融合蛋白，它有IL-2的免疫刺激活性且半衰期長，用它注入健康恒河猴可誘導T細胞數(shù)目增加并表達CD25。（1）抗病毒感染目前IL-2已用于臨床治療HIV和癌癥，但由101（2）治療痛覺過敏Etanercept，一個重組TNFR-Fc融合蛋白，可競爭性抑制TNF，它已成功用于治療類風濕性關節(jié)炎的病人，能減少疼痛和炎癥，在神經(jīng)損傷后，由于局部產(chǎn)生前炎性細胞因子對疼痛產(chǎn)生起一個主要作用。給坐骨神經(jīng)慢性壓縮性損傷的鼠注射Etanercept可減少熱痛覺過敏和機械性異常性疼痛。（2）治療痛覺過敏Etanercept，一個重組TNF102（2）治療痛覺過敏實驗誘導豬神經(jīng)根損傷，同時給豬注射Etanercept7天后顯示Etanercept能預防神經(jīng)傳導速度的減低，限制神經(jīng)纖維損傷，防止毛細血管內血栓和神經(jīng)內水腫形成。預示Etanercept可用于治療椎間盤突出和坐骨神經(jīng)痛。（2）治療痛覺過敏實驗誘導豬神經(jīng)根損傷，同時給豬注射Et103（3）類風濕性關節(jié)炎的治療類風濕性關節(jié)炎(RA)是一個系統(tǒng)性疾病，以關節(jié)滑膜慢性炎癥反應為特征并有軟骨變性和關節(jié)旁骨的侵蝕。（3）類風濕性關節(jié)炎的治療類風濕性關節(jié)炎(RA)是一個系統(tǒng)104（3）類風濕性關節(jié)炎的治療已知TNF與RA的發(fā)病機理有很大關系，許多實驗證實用人可溶性重組TNF受體與IgFc段蛋白融合可完全競爭性抑制TNF結合到細胞表面受體，使TNF無生物活性。給病人注射Etanercept可減少關節(jié)腫脹及炎癥，減少關節(jié)腔狹窄。臨床上已用于治療類風濕性關節(jié)炎。（3）類風濕性關節(jié)炎的治療已知TNF與RA的發(fā)病機理有很大關105（4）用于其他科學研究融合蛋白還可以作為一種研究工具應用于許多方面的研究，如人表皮生長因子受體2蛋白(HER2)向上調節(jié)血管促白細胞生成素(Ang-2)的表達，而利用酪氨酸蛋白激酶受體-2-Fc(Tie-2/Fc)融合蛋白將減少腫瘤細胞釋放血管促白細胞生成素，這樣就可研究HER2對微血管的折除(dismantle)作用。（4）用于其他科學研究融合蛋白還可以作為一種研究工具應用于106（二）PTH融合蛋白甲狀旁腺激素(ParathyroidHormone，PTH)是由甲狀旁腺主細胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，成熟PTH含84個氨基酸殘基，分子量約為9500，是人體內調節(jié)鈣磷代謝及骨轉換的最為重要的激素之一。它主要通過作用于靶細胞膜上腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，增加胞漿內cAMP及焦磷酸鹽(PPi)的水平來發(fā)揮作用。（二）PTH融合蛋白甲狀旁腺激素(Parathyroid107蛋白類藥物的分子量若小于20kD在代謝過程中易被腎小球濾過，且在體內的半衰期較短，皮下給藥或肌肉注射的半衰期一般在12h左右。因此，長效蛋白藥物的研制已成為對第一代基因工程產(chǎn)品進行二次開發(fā)的一個重要方向，而增加分子量則是一個通用的策略。人們已經(jīng)采用多種方法來對PTH的性質進行改進，以在保留它的活性的同時提高半衰期。其中包括構建突變體、化學修飾以及基因融合等，而基因融合技術為最突出的。蛋白類藥物的分子量若小于20kD在代謝過程中易被腎小球濾過108常用的融合蛋白的載體有人血清白蛋白(Humaserumalbumin，HSA)融合蛋白、β-半乳糖苷酶融合蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合蛋白以及硫氧還蛋白(Trx)融合蛋白等。而人血清白蛋白(HSA)則由于本身特殊的優(yōu)點，更適合于充當長效融合蛋白類藥物的融合載體。常用的融合蛋白的載體有人血清白蛋白(Humaseru109HSA是包含585個氨基酸殘基的單鏈無糖基化的球形蛋白質，分子量65kD。它是人血漿中含量最高的單一蛋白質(達40g/L)，在體內有維持血液滲透壓，運輸營養(yǎng)和其它重要生物物質的作用。HSA本身是許多內源因子和外源藥物的載體。藥物和血清白蛋白結合后?？梢詼p少其生物利用度，增加在體內的半衰期至19d之久。HSA是包含585個氨基酸殘基的單鏈無糖基化110人血清白蛋白融合技術具有明顯的優(yōu)點，包括：HSA與目標蛋白在胞內經(jīng)蛋白翻譯系統(tǒng)通過肽鍵連接，不需額外的體外處理；HSA表達水平較高，融合后可以提高目的蛋白的表達水平；HSA是一個穩(wěn)定的“惰性”蛋白，融合后可以提高目的蛋白的穩(wěn)定性；HAS融合蛋白具有比PEG修飾的蛋白藥物更長的半衰期。人血清白蛋白融合技術具有明顯的優(yōu)點，包括111（三）細胞因子重組融合蛋白細胞因子重組融合蛋白是一類利用基因工程的方法將編碼細胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接并表達相應蛋白質融合產(chǎn)物。其結構特點為將細胞因子功能活性域與其他分子的活性