四小件-微生物遺傳m.g第四章

轉(zhuǎn)第四章、細(xì)菌

移和

重組第一節(jié)、轉(zhuǎn)化第二節(jié)、接合第一節(jié)、轉(zhuǎn)化一、轉(zhuǎn)化因子的特性及感受態(tài)二、轉(zhuǎn)化DNA的進(jìn)入三、轉(zhuǎn)化DNA的整合四、轉(zhuǎn)化技術(shù)在遺傳分析中的應(yīng)用一、轉(zhuǎn)化因子的特性及感受態(tài)特性:1、轉(zhuǎn)化因子必需是雙鏈DNA(證明見下圖)2、單鏈DNA可使細(xì)胞轉(zhuǎn)化(證明)3、轉(zhuǎn)化因子的大小從0.5－15

kb證明：單鏈的DNA可以使受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化單鏈DNA可使細(xì)胞轉(zhuǎn)化的證明：非轉(zhuǎn)化因子DNA對于轉(zhuǎn)化因子DNA的轉(zhuǎn)化有干擾作用。如：strs

DNA

對strr

DNA。如果將兩種DNA

混合在一起，加熱使其變性，逐漸冷卻復(fù)性，形成strs

DNA

和strr

DNA雜合的雙鏈分子，對轉(zhuǎn)化不再有干擾作用。證明只要一條單鏈帶有抗性信息足以使受體細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。感受態(tài)（Competence）感受態(tài)是指細(xì)胞能夠接受轉(zhuǎn)化DNA的生理狀態(tài)感受態(tài)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生流感 桿菌，

大腸桿菌感受態(tài)因子DNA結(jié)合蛋白（細(xì)胞膜）細(xì)胞壁自溶素單鏈DNA結(jié)合蛋白（

Competence-Specific

）多種核酸酶感受態(tài)細(xì)胞特征細(xì)胞表面正電荷增加細(xì)胞壁通透性加大細(xì)胞表面分解DNA的能力加強(qiáng)這些特征均由感受態(tài)因子引起，使細(xì)胞有利于吸收外源DNA。二、轉(zhuǎn)化DNA的進(jìn)入革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)化（圖9－14）細(xì)胞 感受態(tài)因子，出現(xiàn)感受態(tài)。雙鏈DNA吸附細(xì)胞表面特異受體。受體大約有50個(gè)。雙鏈DNA被內(nèi)切酶切成4－5MD的片段，外切酶將一條鏈降解。另一條鏈與感受態(tài)蛋白接合進(jìn)入細(xì)胞。三、轉(zhuǎn)化DNA的整合轉(zhuǎn)化的隱晦期轉(zhuǎn)化因子被吸收進(jìn)受體細(xì)胞后失去轉(zhuǎn)化活性，這段時(shí)間稱為轉(zhuǎn)化的隱晦期DNA的同源部分整合分為2個(gè)過程：1、轉(zhuǎn)化因子ssDNA與受體形成供體－受體復(fù)合物。2、供體DNA

與受體DNA

形成共價(jià)鍵?？赏ㄋ倪^共、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化分技析術(shù)連在鎖遺的

析中的應(yīng)用共轉(zhuǎn)化（Cotransformation）:

2個(gè)連鎖的同時(shí)被轉(zhuǎn)化。判斷連鎖的標(biāo)準(zhǔn)：觀察轉(zhuǎn)化DNA濃度下降時(shí)，轉(zhuǎn)化頻率的改變。若a,b連鎖，DNA濃度下降時(shí)，a,b

共轉(zhuǎn)化＝a,b單獨(dú)轉(zhuǎn)化；若a,b不連鎖，DNA濃度下降時(shí)，a,b

共轉(zhuǎn)化的下降幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于a,b單獨(dú)轉(zhuǎn)化。（見圖4－3）利用轉(zhuǎn)化繪制遺傳圖實(shí)例：枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（見下表）枯草芽孢桿菌中trp2,his2

及tyr1

三列順序及其圖距:的排trp2

his2

tyr134

1340第二節(jié)、接合作用一、細(xì)菌接合的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)二、細(xì)菌接合的遺傳學(xué)分析單向轉(zhuǎn)移現(xiàn)象與性因子F高頻重組品系HfrF

+

X

F-

Hfr

X

F-F’

轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的過程稱為接合作用（Conjugation）。特點(diǎn)：菌通過性菌毛，的短肽而刺激細(xì)1供體與受體需直接接觸。革蘭氏革蘭氏陽性菌通過

類似胞接合?？赊D(zhuǎn)移質(zhì)粒的大小在不同的細(xì)菌中差別較大。質(zhì)粒不但可以自身轉(zhuǎn)移，還能帶動供體

轉(zhuǎn)移。一、細(xì)菌接合的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)1、發(fā)現(xiàn)Yalu

University :Lederberg(1925

-

)Tatum(1909

-

1975)實(shí)驗(yàn)材料：E.coli

k12

58-161

met

–

bio

–the

+

leu

+E.coli

k12

w677

met

+

bio

+

the

–

leu

–一、細(xì)菌接合的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)2、

重組的證實(shí)

—非選擇性標(biāo)記

的分離分析選擇性標(biāo)記：指實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)加以考慮的、使重組體子代成活的標(biāo)記，即被用來選擇重組子的。選擇性培養(yǎng)基：用來選擇重組子的培養(yǎng)基，與選擇性標(biāo)記是相應(yīng)的。在這種條件下，任何親本均不能生長。二、細(xì)菌接合的分析兩個(gè)菌株貢獻(xiàn)是否相等？有無1、單向轉(zhuǎn)移現(xiàn)象與性因子FHayes

所用菌株：met

-

bio

-

strsthr

-

leu

-

vb1

-

strs之分？從A

B菌株中分別篩選鏈霉素抗性突變型

strrA菌株:

met

-

bio

-

strrB菌株:

thr

-

leu

-

vb1

-

strr對正反雜交實(shí)驗(yàn)的解釋：A實(shí)驗(yàn)：菌株A被殺死，仍有子代，故認(rèn)為菌株A為供體（donors）,相當(dāng)于雄性親本，表示為F+。B實(shí)驗(yàn)：菌株B被殺死，沒有子代，故認(rèn)為菌株

B為受體（recipients）,相當(dāng)于雌性親本，表示為F－。證明遺傳物質(zhì)是單向轉(zhuǎn)移的，2個(gè)菌株是供體和受體的關(guān)系2、高頻重組品系Hfr(High

frequency

of

bination)Hayes

分離到一株菌，重組頻率為10－3，命名Hfr

H。Hfr

H

與F+相同：來源于F+，仍是供體，可與F－雜交。具有F因子，具有性纖毛（pili）Hfr

H

與F+不相同：1)

與F－雜交重組頻率比F＋高1000倍。2）與F－雜交時(shí)，F(xiàn)因子不能隨細(xì)胞接觸而轉(zhuǎn)移。3) Hfr

H

中的F因子不能被消除掉。4）Hfr

H

中的

轉(zhuǎn)移是非隨機(jī)的。上述特點(diǎn)證明，

Hfr與F＋中的F因子存在形式不同：

Hfr

中的F因子是整合進(jìn)

的，而F＋中的F因子是游離形式的。F因子遺傳圖（圖9－11）3、

F

因子轉(zhuǎn)移（

F+

x

F－

）雜交時(shí)性菌毛（pili）使F+與F－識別和接觸，形成接合橋，誘發(fā)了F+

DNA從轉(zhuǎn)移起點(diǎn)（ori

T）的轉(zhuǎn)移。雜交誘發(fā)了F+

DNA上編碼內(nèi)切酶

（traE）表達(dá)，切開一條鏈。切開的一條鏈從5’端開始向F－轉(zhuǎn)移，通過滾環(huán)

，在兩個(gè)細(xì)胞中形成兩個(gè)雙鏈、閉合、環(huán)狀的F

因子。F因子轉(zhuǎn)移速