生化過程參數(shù)的檢測和控制概要

2022/11/181第七章生化過程參數(shù)的檢測和控制2022/11/182教學時數(shù)：4學時教學目的與要求：了解生化過程參數(shù)的分類及生物傳感器的種類及特點，能利用生物傳感器對生化反應中的直接參數(shù)進行檢測，并通過參數(shù)判斷生產過程是否染菌，掌握雜菌染菌的途徑及挽救；教學重點：直接參數(shù)的檢測、生產過程中的染菌及其控制；教學難點：直接參數(shù)的檢測、生產過程中的染菌及其控制。2022/11/183本章主要內容第一節(jié)直接參數(shù)的檢測與控制第二節(jié)生物傳感器第三節(jié)生產過程中的染菌及其控制2022/11/184教學時數(shù)：4學時教學目的與要求：了解生化過程參數(shù)的分類及生物傳感器的種類及特點，能利用生物傳感器對生化反應中的直接參數(shù)進行檢測，并通過參數(shù)判斷生產過程是否染菌，掌握雜菌染菌的途徑及挽救；教學重點：直接參數(shù)的檢測、生產過程中的染菌及其控制；教學難點：直接參數(shù)的檢測、生產過程中的染菌及其控制；2022/11/185

在發(fā)酵工業(yè)中，除了要考慮已接種的微生物本身的特殊需要外，由于產品的要求還應適當考慮培養(yǎng)基的組成、pH值、溫度、水分、氧氣、雜菌污染等條件。這些條件的變化反映了發(fā)酵過程的動態(tài)。人們在實踐中，正是通過觀察和控制這些工藝條件從而控制和完成發(fā)酵過程。當然，這些條件之間是相互聯(lián)系的、相互影響的，認真研究發(fā)酵產物的調控機制，并創(chuàng)造所必需的分析和傳感儀表，以提供這些控制發(fā)酵工藝取得成效，顯然也是生化工程的重要課題。2022/11/186生化過程參數(shù)的分類

反映生化過程變化的參數(shù)分為兩大類：一類是可以直接采用特定的傳感器檢測的參數(shù)稱為直接參數(shù)，包括各種反映物理環(huán)境和化學環(huán)境變化的參數(shù)：如溫度、壓力、流量、攪拌功率、轉速、泡沫、黏度、濁度、pH、離子強度、溶解氧和基質濃度等。另一類是綜合參數(shù)，包括細胞生長速率、產物合成速率、呼吸商等。2022/11/187

用于發(fā)酵工業(yè)的傳感器，除了應滿足一般測量儀表的要求外，還應具有幾個方面的面的特征：（1）傳感器能安裝在發(fā)酵罐內耐受高壓蒸汽（120-135℃,30min以上）滅菌處理；（2）傳感器及二次儀表具有長期工作穩(wěn)定性，在1-2周內其測量誤差應小于5%；2022/11/188（3）最好能在使用過程中隨時校正；（4）材料不易老化，使用壽命長；（5）傳感器的探頭安裝和使用方便；（6）探頭不易被物料粘住、堵塞；（7）價格便宜。2022/11/189

第一節(jié)直接參數(shù)的檢測和控制一.溫度檢測和控制嚴格保持菌種的生長繁殖和生物合成所需的最適溫度，對穩(wěn)定發(fā)酵過程，縮短周期，提高產量，具有重要意義。通?？梢圆捎盟y溫度計、熱電阻監(jiān)測系統(tǒng)中的溫度。普遍使用的熱電阻有鉑電阻和銅電阻。2022/11/1810鉑電阻精度高、穩(wěn)定性好、性能可靠；銅電阻超過100℃時易被氧化。為了使生物反應在適當?shù)臏囟认逻M行，必須采取措施——在夾套或蛇管內通入冷卻水加以控制。發(fā)酵熱的測定(1)通過測量一定時間內冷卻水的流量和冷卻水的進出。Q發(fā)酵=GC(T2-T1)/VQ發(fā)酵-----------發(fā)酵熱;C-------冷卻水的比熱G-----------冷卻水的流量;T1T2------進出口冷卻水的溫度;V----------發(fā)酵液的體積2022/11/1812(2)通過罐溫度的自動控制，先使罐溫達到恒定，再關閉自控裝置，測量溫度隨時間上升的速率S。

Q發(fā)酵=(M1C1+M2C2)S/VM1----------發(fā)酵液重量;M2----------發(fā)酵罐重量;C1----------發(fā)酵液比熱;C2----------發(fā)酵罐材料比熱;S----------溫升速率Q發(fā)酵---------發(fā)酵熱2022/11/1813(3)根據(jù)化合物的燃燒值計算發(fā)酵過程中生物熱的近似值。根據(jù)赫斯定律，熱效應決定于系統(tǒng)的初態(tài)和終態(tài)，而與變化的途徑無關。反應的熱效應等于產物的生成熱總和減去作用物的生成熱總和，也可以用燃燒熱來計算熱效應，特別對于有機化合物，燃燒熱可直接測定，所以采用燃燒熱來計算更合適。2022/11/1814

反應熱效應等于作用物的燃燒熱總和（消耗培養(yǎng)基釋放的能）減去生成物的燃燒熱總和（產物和菌所具有的能），可用下式計算：(4)測定微生物生長代謝中的耗氧量。

--------發(fā)酵過程中生成的發(fā)酵熱數(shù)量；

---------基質完全氧化需氧量與菌體和產物完全氧化需氧量之差，即微生物在生長和代謝過程中所消耗的氧；2022/11/1816---------代表微生物呼吸（供氧）反應的焓變，若以有效電子轉移（物質在氧化過程中伴隨著能量釋放所進行的電子轉移）為基準，則：其中為有機化合物氧化時每轉移一個有效電子所平均釋放出的熱量；4為消耗１ｍｏｌＯ２相應的有效電子轉移數(shù)（當1ｍｏｌ葡萄糖2022/11/1817完全氧化時，需要消耗6ｍｏｌ氧氣，相應的有效電子轉移數(shù)為24，釋放的能量應為:所以：

由此可見，通風（耗氧）發(fā)酵過程生成的發(fā)酵熱數(shù)量與過程所消耗的氧是成正比。當測得發(fā)酵過程中氧的消耗（可根據(jù)氣體分析和通風量進行計算得到），就能把發(fā)酵過程中需要移去的熱量計算出來。2022/11/1818

根據(jù)理論推導和試驗驗證，可以用下式對通風發(fā)酵過程生成熱進行估算：QH=(0.106~0.124)QO2≈(1/10)QO2QO2----------比耗氧速率(mmolO2/g菌體.h)QH-----------發(fā)酵熱生成的比速(kcal/g菌體.h)

當通風發(fā)酵出現(xiàn)溶解氧不足時，有的的微生物能夠進行厭氧反應。則出現(xiàn):QH>>(0.106~0.124)QO2。如果出現(xiàn)這種情況，就可以得出溶氧不足的結論。二.pH的檢測和控制pH值可用耐滅菌的玻璃電極和銀-汞參比電極以及pH測量儀表的檢測系統(tǒng)檢測，可連續(xù)指示罐內酸堿變化。微生物反應過程中pH的變化具有一定規(guī)律。①在微生物細胞的生長階段，由于所用的微生物菌種不同，相對于接種后的起始pH值有上升或下降趨勢2022/11/1820②在生產階段，一般反應液的pH值趨于穩(wěn)定，維持在最適合產物形成的范圍。③在微生物細胞的自溶階段，隨著培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質的耗盡，微生物細胞內蛋白酶的積累和活躍，微生物自溶，引起培養(yǎng)液中的氨基氮等的增加，致使pH值有上升。引起反應液pH值下降的主要原因有：1.培養(yǎng)基中的碳/氮比例不當，碳源過多，特別是葡萄糖過量或者中間補糖過多或溶解氧不足，致使糖等物質氧化不完全，培養(yǎng)液中有機酸會大量積累，從而使pH值下降2.消泡油加得過多；3.微生物生理性物質的存在，使pH值下降。2022/11/1822引起反應液pH值上升的主要原因有：1.培養(yǎng)基中的碳/氮比例不當，碳源過多，氨基氮釋放會使pH值上升。2.生理堿性物質存在。3.中間補料液中氨水或尿素等堿性物質的加入過多。1.調節(jié)培養(yǎng)基中的原始pH值，或加入緩沖溶液制成緩沖能力強、pH值變化不大的培養(yǎng)基。2.可在反應過程中加入弱酸或弱堿進行pH值的調節(jié)，進而合理地控制發(fā)酵條件，也可通過調整通風量來控制pH值。3.進行補料，既調節(jié)了培養(yǎng)液的pH值，又可補充營養(yǎng)，增加培養(yǎng)液的濃度和減少阻遏作用，進一步提高產率。反應液中pH值的控制方法2022/11/18244.采用酸性銨鹽作為氮源時，由于NH4+被利用后，剩下的酸根會引起發(fā)酵液中的pH值下降，在培養(yǎng)液中可加入碳酸鈣來調節(jié)pH值。5.根據(jù)pH值的變化可用流加氨水的方法來調節(jié)，同時又可把氨水作為氮源供給。6.以尿素作為氮源進行流加調節(jié)pH值。三.泡沫的影響和控制太多的泡沫給反應帶來不利的影響1.使反應器的裝填系數(shù)減少；2.造成大量逃液，導致產物的損失；3.泡沫“頂罐”有可能使培養(yǎng)基從攪拌的軸封滲出，增加了染菌的機會。2022/11/18264.由于泡沫的液位變動，以及不同生長周期微生物隨泡沫漂浮，使微生物生長的環(huán)境發(fā)生了變化，影響了微生物群體的效果，增加了微生物群體的不均一性。5.影響了攪拌的正常進行，妨礙了微生物的呼吸。6.使微生物提早自溶。7.為了控制泡沫，需加入消泡劑。對產物的提取不利。微生物反應過程產生泡沫的原因1.由外界引進的氣流被機械地分散形成2.反應過程產生的氣體聚結生成的泡沫培養(yǎng)基的物理化學性質對泡沫形成的表面現(xiàn)象起決定作用，此外，培養(yǎng)基的溫度、酸堿度、濃度等對過程的泡沫也有一定的影響。培養(yǎng)基中的蛋白質含量越多，反應液的黏度也越大，越容易起泡，泡沫多而且持久穩(wěn)定。泡沫的控制化學消泡消泡機理：1.消泡劑是表面活性物質，降低氣泡表面張力，使氣泡破裂2.降低機械強度（降低液膜的彈性）3.降低膜表面的黏度。天然油脂類、高級醇類、聚醚類、硅酮類、氟化烷烴等2022/11/1829生產中的一些用法：(1)通過機械攪拌，使消泡劑更易于分散在反應液中。(2)將消泡劑與載體一起使用，使消泡劑溶于或分散于載體中，比如用聚氧丙烯甘油作消泡劑時，以豆油為載體的消泡增效作用明顯。(3)多種消泡劑并用可增強消泡作用。(4)使用乳化劑增強消泡劑的消泡作用，如消泡劑聚氧丙烯甘油用吐溫-80為乳化劑的增效作用可提高1~2倍。

機械消泡靠機械強烈振動和壓力的變化，促使細胞破裂，或借助機械力將排出氣體中的液體加以分離回收，從而達到消泡的作用。機械消泡的優(yōu)點是不需在發(fā)酵液中加入其他物質，減少了由于加入消泡劑所引起的染菌機會和對后續(xù)分離的影響。但是機械效果不如化學消泡迅速、可靠、不能根本上消除引起穩(wěn)定泡沫的因素，而且它還需要一定的設備和消耗一定的動力。液位電極控制消泡劑的流加液位電極是根據(jù)空氣與帶有發(fā)酵液的泡沫導電率不同的原理制造。采用雙位式的控制方法，當反應物液面達到一定的高度時，自動打開消泡劑的閥門，當液面降回到正常時，自動關閉消泡劑的閥門。2022/11/1832第二節(jié)生物傳感器傳感器（電極或探頭）：能感受規(guī)定的被測量并按照一定的規(guī)律將其轉換成可用信號的器件或裝置，它通常由敏感元件、轉化元件及相應的機械結構和線路組成。生物傳感器：是利用酶、抗體、微生物等作為敏感材料，將所感受的生物體信息轉換成電信號進行檢測的傳感器。2022/11/1833生物傳感器的應用領域臨床檢測：葡萄糖85%，乳酸鹽及其他4%，研究4%。藥物：3%環(huán)境：2%食品：2%機器人、國防及其他：<1%2022/11/1834生物傳感器的結構和原理

生物傳感器的結構一般是在基礎傳感器(電化學裝置）上再耦合一個生物敏感膜（稱為感受器或敏感元件）。生物敏感膜緊貼在探頭表面上，再用一種半滲透膜與被測溶液隔開。當待測溶液中的成分透過半透膜有選擇地附著于敏感物質時，形成復合體，隨之進行生化和電化學反應，產生普通電化學裝置能感知的O2、H2、NH4+、CO2等，并通過電化學裝置轉換為電信號生物傳感器的特點1)對被檢測物質具有極好的選擇性，噪音低。2)操作簡單，需用樣品少，能直接完成測定。3)經固定化處理后，可保持長期生物活性，傳感器可經得住反復使用。4)能在短時間內完成測定。5)不要求樣品具有透明度。6)主要缺點是壽命較短。2022/11/1836生物傳感器的種類酶傳感器微生物傳感器免疫傳感器細胞傳感器組織傳感器生物電子傳感器2022/11/1837發(fā)酵工業(yè)中的傳感器的特點1.傳感器能安裝在發(fā)酵罐內耐受高壓蒸汽（120~135℃、30min以上）滅菌處理；2.傳感器及二次儀表具有長期工作穩(wěn)定性，在1~2周內其測定誤差應小于5%；3.最好在使用過程中隨時校正；2022/11/18384.材料不易老化，使用壽命長；5.傳感器探頭安裝和使用方便；6.探頭不易被物料粘住、堵塞；7.價格便宜2022/11/1839第三節(jié)生產過程中的染菌及其控制生物反應過程染菌的分析1.種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象種子培養(yǎng)異常異常的主要表現(xiàn)有菌體生長緩慢、菌絲結團、菌體老化以及培養(yǎng)液的理化參數(shù)變化。發(fā)酵異常主要表現(xiàn)在菌體生長速度緩慢，形態(tài)不粗壯或過早老化，以及糖、氮、pH、泡沫、發(fā)酵產物、發(fā)酵濃度等理化參數(shù)不正常。2022/11/1840染菌的檢查與判斷

在發(fā)酵過程中，如何及早發(fā)現(xiàn)雜菌的污染并及時采取措施加以處理，是避免染菌造成嚴重經濟損失的重要手段。

1.顯微鏡檢查法（鏡檢法）對樣品進行涂片、染色，然后在顯微鏡下觀察微生物的形態(tài)特征，根據(jù)生產菌與雜菌的特征區(qū)別，判斷是否染菌。2022/11/1841

如發(fā)現(xiàn)有與生產菌形態(tài)特征不一樣的其他微生物的存在，就可斷定為發(fā)生了染菌。此法檢查雜菌最為簡單、最直接，也是最常用的檢查方法之一。必要時還可進行芽孢染色或鞭毛染色。2.肉湯培養(yǎng)法通常用組成為0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、0.5%氯化鈉、0.8%蛋白胨、0.4%的1%酚紅溶液（pH7.2）的葡萄糖酚紅肉湯作為培養(yǎng)基，將待檢樣品直接接入經完全滅菌后的肉湯培養(yǎng)基中，分別于37℃和27℃進行培養(yǎng)，觀察微生物生長情況，并進行鏡檢，判斷是否染菌。常用來檢查培養(yǎng)基和無菌空氣中是否帶菌。2022/11/18433.平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法將待檢樣品在無菌平板上劃線，分別于37℃和27℃下進行培養(yǎng)，一般24h后即可進行鏡檢觀察,檢查是否有雜菌。有時為了提高平板培養(yǎng)法的靈敏度，也可以將需要檢查的樣品先置于37℃條件下培養(yǎng)6小時，使雜菌迅速增殖后再劃線。4.發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象觀察法根據(jù)發(fā)酵過程出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象如溶解氧、pH值、排出氣中的CO2含量以及微生物菌體的酶活力等的異常變化來檢查發(fā)酵是否染菌。溶解氧水平異常變化，對于特定的發(fā)酵過程具有一定的溶解氧水平，而且在不同的發(fā)酵階段其溶解氧的水平也是不同的。如果發(fā)酵過程中的溶解氧水平發(fā)生了異常的變化，一般就是發(fā)酵染菌發(fā)生的表現(xiàn)。2022/11/1845谷氨酸正常發(fā)酵與異常發(fā)酵溶解氧變化

由于染菌的雜菌的好氧性不同，產生的溶解氧異常的現(xiàn)象也是不同的。當雜菌是好氣性微生物，溶解氧的變化是在短時間內下降，直至接近于零，且在長時間內不能回升；當雜菌是非好氣性微生物，而生產菌由于受污染而抑制生長，使耗氧量減少，溶解氧升高。排氣中的CO2異常變化，好氣性發(fā)酵排出的氣體中的CO2含量與糖的代謝有關。對于特定的發(fā)酵過程，工藝確定后，排出的氣體中的CO2含量的變化是有規(guī)律的。2022/11/1847染菌后，培養(yǎng)基中糖的消耗發(fā)生變化，引起排氣中CO2含量的異常變化，如雜菌污染時，糖消耗加快，CO2含量增加，噬菌體污染污染后，糖消耗減緩，CO2含量。還可根據(jù)其他一些現(xiàn)象，如泡沫異常增多、發(fā)酵液的顏色異常變化，代謝產物異常下跌、發(fā)酵周期拖長、黏度異常增加等來判斷染菌。

在眾多的方法中，應以無菌試驗和平板培養(yǎng)為主，其他方法為輔來進行染菌的判斷。無菌試驗時，如果肉湯培養(yǎng)基連續(xù)三次發(fā)生變色反應或產生混濁，或平板培養(yǎng)連續(xù)三次發(fā)現(xiàn)有雜菌菌落的出現(xiàn)，即可判斷為染菌。2022/11/1849有時肉湯培養(yǎng)的陽性反應不夠明顯，而發(fā)酵樣品的各項參數(shù)確有可疑的染菌反應，并經鏡檢等其他方法確認連續(xù)三次有相同類型的雜菌存在，也應該判斷為雜菌。無菌試驗期間應每六小時觀察一次無菌試驗樣品，以便能及早發(fā)現(xiàn)染菌。2022/11/1850雜菌染菌的途徑和防治1.種子帶菌及其防治（5%~10%）2.空氣帶菌及其防治（20~30%）3.設備的滲漏或死角造成的染菌及其防治（10%~25%）4.培養(yǎng)基滅菌不徹底導致的染菌（2%~5%）5.噬菌體及其防治2022/11/18512022/11/18522022/11/1853噬菌體染菌及其防治對于利用細菌或放線菌進行的發(fā)酵容易受噬菌體的污染，由于噬菌體的感染力非常強，傳播蔓延迅速，且較難防治，對發(fā)酵生產有很大的威脅。噬菌體是一種病毒，直徑0.1μm，可以通過環(huán)境污染、設備的滲漏或死角、空氣系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌不徹底、補料過程及操作失誤、菌種帶進噬菌體或本身是病源性菌株等途徑而染菌。2022/11/1854以谷氨酸生產過程染上了噬菌體為例：初期OD值不上升或回降；

pH值逐漸上升，可到8.0以上，且不再下降或pH值稍下降，停滯在7.0~7.2之間，氨的利用停止；糖耗、升溫緩慢或停止；產生大量泡沫，有時使發(fā)酵液呈現(xiàn)粘膠狀；谷氨酸的產量很少，增長緩慢或停止；鏡檢時