實驗準備與無菌操作規(guī)范

實驗準備與無菌操作規(guī)范實驗準備與無菌操作規(guī)范實驗準備與無菌操作規(guī)范xxx公司實驗準備與無菌操作規(guī)范文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設(shè)計，管理制度實驗2、實驗準備與無菌操作規(guī)范【實驗?zāi)康摹?.掌握細胞培養(yǎng)的基本概念2.了解細胞培養(yǎng)的基本條件3.掌握清洗和消毒的基本方法4.學習細胞培養(yǎng)使用液的配制及準備方法【實驗原理】1.體外培養(yǎng)（invitroculture)的基本概念將活體結(jié)構(gòu)成分（甚至個體）從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。按照體外培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)成分，可將體外培養(yǎng)人為地分為：組織培養(yǎng)（tissueculture）、器官培養(yǎng)（organculture）、細胞培養(yǎng)（cellculture)（1）器官培養(yǎng)（OrganCulture）培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。（2）組織培養(yǎng)(TissueCulture)是指從生物體內(nèi)取出活的組織（多指組織塊）在模擬體內(nèi)生理環(huán)境下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。（3）細胞培養(yǎng)(CellCulture)是指將活細胞（尤其是分散的細胞）在體外進行培養(yǎng)的方法。2.組織細胞培養(yǎng)的優(yōu)點能夠長時間觀察細胞的生命活動容易控制實驗條件，有利于生物學研究容易直接采集細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)的圖象便于各種細胞染色處理和標記培養(yǎng)細胞的單一性，有利于排除干擾因素3.體外培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：基礎(chǔ)研究：細胞生物學乃至整個生命科學研究中最基本的實驗技術(shù)之一。被培養(yǎng)的組織或細胞是良好的實驗材料。細胞培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)學和生物科學研究之中生產(chǎn)實踐：疫苗生產(chǎn)、藥物研制與腫瘤防治等醫(yī)學實踐提供了全新的手段4.組織細胞培養(yǎng)的基本條件（1）無污染的環(huán)境條件（2）適當?shù)臏囟?由酶和蛋白質(zhì)所需要的最適溫度決定35－37℃(人和哺乳動物細胞)（3）氣體環(huán)境與pH環(huán)境：(人和哺乳動物細胞)（4）營養(yǎng)條件（5）其它條件：等滲條件、附著底物5.無污染的環(huán)境條件凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應(yīng)視為污染。污染的種類A．物理污染:溫度:解決對策：孵箱放在溫度較恒定的房間中,培養(yǎng)液從冰箱取出后在室溫放置.放射線與輻射:解決對策：試劑周圍不能放同位素,盡量不放在帶有玻璃門的冰箱中.振動:解決對策：孵箱周圍不能放引起振動的設(shè)備.其他：塵土、玻璃殘渣等.解決對策：嚴格清洗.B.化學污染水:解決對策：用雙蒸和三蒸水配液和清洗容器（現(xiàn)在用純水儀millipore超純水）容器:生產(chǎn)過程中有毒物質(zhì)殘留（鉛、砷）;消毒劑和清洗劑的殘留;鋁箔和包裹紙殘留解決對策：培養(yǎng)用各種器皿的嚴格清洗（泡酸）培養(yǎng)箱:co2混有有毒氣體;消毒劑和清洗劑的殘留解決對策：購置高質(zhì)量的CO2C.生物污染

細菌、霉菌和酵母:易被發(fā)現(xiàn),易造成隱性污染

病毒:最難發(fā)現(xiàn)和清除,嚴格的宿主性,自限性

支原體：污染嚴重,難發(fā)現(xiàn),難清除

原蟲、昆蟲：

其它細胞系：

解決對策：實驗用品嚴格滅菌，無菌操作同一時間只傳同

一種細胞,每種細胞要有單獨的液體

建立細胞庫，每三個月更換一次細胞6.清洗與滅菌

除去各種玻璃或塑料器皿上對細胞生長有影響的各種雜質(zhì)以及消除附著在其上的各種微生物及化學物質(zhì)，改善玻璃表面性質(zhì)，有利于細胞的粘著和生長。

清洗和消毒是否徹底直接關(guān)系到體外培養(yǎng)的成敗。（1）清洗玻璃器皿：培養(yǎng)瓶、吸管、滴管、試管等浸泡在清水中，刷洗→烘干→浸酸→沖洗（15遍自來水后3遍蒸餾水→倒置烤干→包裝→干熱消毒膠塞（舊）：用加入適量洗滌靈的水溶液煮沸30分鐘，自來水沖洗→蒸餾水漂洗3次→晾干→包裝→濕熱滅菌→烘干備用膠塞（新）：水中浸泡→2%NaOH煮10-20min→自來水沖洗10次→1%HCl浸泡30min→自來水沖10次，蒸餾水洗3次→晾干→包裝→濕熱滅菌→烘干備用。金屬器械：自來水洗→75%酒精擦→濕熱滅菌、包裝→烘干備用或者自來水沖10次，蒸餾水3次→晾干→包裝→濕熱滅菌→烘干備用（2）細胞及組織培養(yǎng)用品的包裝1．局部包裝：濾器，培養(yǎng)瓶口2.全包裝：膠塞、瓶蓋、金屬器械、注射器、小的瓶皿等（3）細胞及組織培養(yǎng)用品的消毒與滅菌射線消毒:用鈷60等發(fā)出的射線消毒滅菌。適宜用于量大或不適做高壓、干熱或過濾處理的培養(yǎng)用品，如塑料制品等。紫外線消毒:DNA損傷，臭氧，雙氧水。適用于空氣、主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒.【注意事項】：空氣消毒時燈管應(yīng)距地面m以內(nèi)；臺面的消毒應(yīng)在80cm以內(nèi)；培養(yǎng)器皿的消毒在30cm以內(nèi)。不要讓紫外線照射人的皮膚。干熱滅菌:高溫變性，160℃保溫90－120min適用于玻璃器皿【注意事項】溫度降至100℃之下才能開烤箱門。濕熱滅菌:高溫變性。121度，15磅30分或115度，10磅20分。適用于膠塞、瓶蓋、玻璃器皿、濾器、槍頭塑料物品、PBS、LB等不易產(chǎn)生沉淀的液體過濾除菌：適用于培養(yǎng)基、胰酶、TdR、秋水仙素、谷氨酰胺、抗生素等對熱不穩(wěn)定的試劑及藥物化學消毒:來蘇%)、新潔爾滅（%）、乙醇（70-75%）、乳酸、過氧乙酸%)火焰消毒：僅限于無菌操作過程，在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。用于培養(yǎng)瓶、滴管、試管、吸管等。注意：等用品冷卻后放可接觸活的組織和細胞?？股氐囊志饔茫呵嗝顾亍㈡溍顾馗?00單位/mL培養(yǎng)基7.平衡鹽D–Hanks緩沖液的配制平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS）主要是由無機鹽、葡萄糖組成。它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。D-Hank‘s與Hank’s的一個主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液。D–Hanks的配制配方（1000mL）：KCl；KH2PO4g；NaCL8g；g；NaHCO3g；酚紅（2%，1mL）————可不加【實驗儀器、材料、試劑及用品】1.細胞培養(yǎng)用品：玻璃器皿；濾器；塑料及橡膠制品;濾膜；棉花；酒精燈等2.藥品及試劑：KCl;KH2PO4;NaCl;Na2HPO4;NaHCO3酒精;新潔爾滅【實驗步驟】1.無菌室及互動顯微鏡室、儀器的使用規(guī)則2.針頭濾器的安裝與滅菌：安裝濾膜（μm光滑面朝上），高壓滅菌。–Hanks緩沖液的配制及滅菌處理。4.練習清洗培養(yǎng)瓶。5.練習包瓶子、塞子、插槍頭、切蓋玻片，移液管塞棉花等。%酒精配置、酒精棉球制作以及酒精燈內(nèi)酒精添加。7.配新潔爾滅消毒水。8.練習培養(yǎng)基瓶蓋的開啟與蓋上。9.無菌室的打掃：自來水拖地、擦桌子及超凈臺，然后%新潔爾滅擦。CO2培養(yǎng)箱滅菌：新潔爾滅擦，然后75%乙醇擦?！舅伎碱}】1.干燥箱滅菌的溫度是多少滅菌結(jié)束后要注意什么答：干熱滅菌:高溫變性，160℃保溫90－120min適用于玻璃器皿【注意事項】溫度降至100℃之下才能開烤箱門。濕熱滅菌:高溫變性。121度，15磅30分或115度，10磅20分。適用于膠塞、瓶蓋、玻璃器皿、濾器、槍頭塑料物品、PBS、LB等不易產(chǎn)生沉淀的液體2.二氧化碳培養(yǎng)箱的使用注意事項是什么培養(yǎng)箱:co2混有有毒氣體;消毒劑和清洗劑的殘留解決對策：購置高質(zhì)量的CO23.哪些物品適合于高壓滅菌