廣西柑橘碎葉病和葉斑病調(diào)查及其病原的遺傳多樣性分析

廣西柑橘碎葉病和葉斑病調(diào)查及其病原的遺傳多樣性分析

張金珠鄒承武黃俊源鄧崇嶺陳保善張木清摘

要：調(diào)查了廣西南寧、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、賀州及防城港等主要柑橘種植區(qū)的柑橘碎葉病和葉斑病的發(fā)生情況，并對其病原柑橘碎葉病毒（Citrustatterleafvirus，CTLV）、蘋果莖溝病毒（Applestemgroovingvirus，ASGV）和柑橘葉斑病毒（Citrusleafblotchvirus，CLBV）進(jìn)行了RT-PCR檢測、病毒序列測定和遺傳多樣性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有疑似柑橘病毒病樣品中，CTLV檢出率為7.3%，CLBV檢出率為5.5%，ASGV檢出率為3.0%。其中在南寧、桂林和玉林3個(gè)主要柑橘種植區(qū)采集的疑似柑橘病毒病樣品的3種病毒病檢出率合計(jì)分別為21.2%、28.6%和7.6%，且存在多種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。將克隆到的上述3個(gè)病毒分離物的病毒片段，分別與已報(bào)道的相應(yīng)病毒的代表性分離物的病毒片段進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，ASGV和CTLV的中國分離物在進(jìn)化關(guān)系上均呈寄主相關(guān)性，ASGV的日本分離物則與地理位置相關(guān)性更強(qiáng)，而韓國和印度的分離物未表現(xiàn)出明顯的寄主相關(guān)性和地理位置相關(guān)性。柑橘和蘋果的ASGV和CTLV分離物均表現(xiàn)與地理位置相關(guān)，而梨的ASGV和CTLV分離物卻與地理位置和寄主均不相關(guān);CLBV分離物則呈明顯的寄主相關(guān)性。本研究首次報(bào)道了廣西柑橘碎葉病和柑橘葉斑病的發(fā)生情況及其病原的遺傳多樣性與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為柑橘病毒病的診斷和防治提供參考依據(jù)。Key：柑橘;病毒病調(diào)查;病毒檢測;遺傳多樣性分析：S436.661.1

：AAbstract：TheoccurrenceofcitrustatterleafdiseaseandcitrusleafspotdiseasewereinvestigatedinthemainplantingareasofcitrusinNanning，Chongzuo，Liuzhou，Guilin，Yulin，Hechi，Hezhou，andFangchenggangofGuangxi.RT-PCRdetection，viralgenomesequencingandgeneticdiversityanalysiswerecarriedoutforthepathogenicviruses，includingCitrustatterleafvirus（CTLV），Applestemgroovingvirus（ASGV），andCitrusleafblotchvirus（CLBV）.TheresultsshowedthatthedetectionratesofCTLV，ASGV，andCLBVinsuspectedviralsamplescollectedfromtheci-trus-producingareasinNanning，Guilin，andYulinwas21.2%，28.6%，and7.6%，respectively.Additionally，themixedinfectionofmultipleviruseswasdetected.Amongthesamplestested，thedetectionrateofCTLVwasthehighest（7.3%），followedbyCLBV（5.5%），andASGV（3.0%）.Thegeneticdiversityanalysisandphylogeneticanalysiswerecarriedoutbycomparingthesequencesofthethreevirusisolatesclonedinthisstudywiththoseofseveralrepre-sentativevirusesreported.TheresultsdemonstratedthatbothASGVandCTLVisolatesinChinapresentedhostcorrelationintheevolutionaryrelationship，whileASGVisolatesinJapanshowedastrongerassociationwithgeographicallocation.Still，thestrainsinSouthKoreaandIndiadidnotshowsignificanthostorgeographicallocationcorrelation.TheisolatesofASGVandCTLVoncitrusandapplepresentedarelationshipwithgeographiclocation，whiletheirisolatesonpearshowednoassociationwithgeographiclocationorhost.Moreover，allstrainsofCLBVshowedadistinctrelationshipwiththehost.ItisthefirsttimetoreporttheoccurrenceofcitrustatterleafdiseaseandcitrusleafspotdiseaseinGuangxiandthegeneticdiversityoftheirpathogenicviruses，whichwouldprovideareferenceforthediagnosisandcontrolofcitrusvirusdiseases.Keywords：citrus;viraldiseaseinvestigation;virusdetection;analysisofgeneticdiversityDOI：10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.030近年來廣西柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，種植面積和產(chǎn)量均居全國首位。但是生產(chǎn)上大量使用嫁接苗，容易導(dǎo)致柑橘病毒病流行，嚴(yán)重威脅柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。已報(bào)道的廣西柑橘病毒病的病原主要有柑橘碎葉病毒（Citrustatterleafvirus，CTLV）[2-4]、柑橘黃化脈明病毒（Citrusyellowveinclearingvirus，CYVCV）[5]、柑橘衰退病毒（Citrustristezavirus，CTV）[6]、柑橘裂皮?。–itrusexocortisviroid，CEV）[7]、溫州蜜柑萎縮?。⊿atsumadwarfvirus，SVD）[8]等。柑橘碎葉病的病原有2種，分別是CTLV和蘋果莖溝病毒（Applestemgroovingvirus，ASGV）[9]，其中最早于1908年在加利福尼亞的“邁耶”檸檬上發(fā)現(xiàn)了CTLV[4]。CTLV屬于β線性病毒科（Betafexiviridae）、發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）的正義單鏈RNA病毒，大小為600～700nm×15nm，呈線性彎曲狀[10]。CTLV易于機(jī)械傳播，尚無通過介體傳播的證據(jù)。該病毒在我國浙江、廣東、廣西、福建、臺灣及湖南等地均有發(fā)現(xiàn)，在澳大利亞、南非和美國等國家也有發(fā)現(xiàn)[11]。該病毒對以枳及枳的雜種為砧木的柑橘樹危害最大。感染特征為枳砧嫁接口腫大，結(jié)合處不親和，截面呈黃褐色，易斷裂，葉脈黃化，葉片易脫落，植株矮化等，嚴(yán)重時(shí)整株枯死。CTLV的外殼蛋白（coatprotein，CP）基因序列的進(jìn)化關(guān)系與宿主和地理來源均無明顯相關(guān)性[9]。ASGV是β線性病毒科發(fā)狀病毒屬的代表種，其病毒粒子長為620～680nm，直徑為12nm的彎曲線狀[12]。ASGV在世界各地均普遍存在，是果樹上一種重要的潛在病毒，該病毒寄主范圍廣泛，侵染率高，可以侵染蘋果、梨、柑橘等果樹。ASGV在蘋果植株上的為害癥狀不明顯[13-14]，但對植株生長、果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)等造成嚴(yán)重危害，導(dǎo)致產(chǎn)量下降[15]。Hilf等[16]用ASGV抗體在柑橘碎葉病樣品中檢測到ASGV，其CP基因序列的同源性與宿主及地理位置無顯著相關(guān)性[17-18]。柑橘葉斑病毒（Citrusleafblotchvirus，CLBV）是近年來國內(nèi)新報(bào)道的一種柑橘病毒[19]，該病毒屬于β線性病毒科柑橘病毒屬（Citrivirus）的正義單鏈RNA病毒，其病毒粒子為絲狀顆粒，大小約為960nm×14nm[20]。目前中國對該病毒的報(bào)道較少，在自然條件下，CLBV主要侵染柑橘屬（CitrusL.）和獼猴桃屬（ActinidiaL.）[21]。近年來，發(fā)現(xiàn)CLBV可侵染柑橘[22]、檸檬[13]、獼猴桃[23]、櫻桃[24]、芍藥[25]、煙草[26-27]等植物。CLBV主要通過嫁接感染的方式進(jìn)行傳播，獼猴桃感染初期癥狀不明顯，后期葉片表現(xiàn)為不規(guī)則褪綠癥狀，且發(fā)病葉片小于健康葉片[28]。在美國加利福尼亞首次發(fā)現(xiàn)該病毒可引起橘橙（‘Dweettangor，Citrustangerine×C.sinensis）葉片出現(xiàn)黃色斑駁，隨后在西班牙發(fā)現(xiàn)金橘（Fortunellamargarita）也可感染該病毒。CLBV在我國重慶、湖南、浙江、四川、湖北、云南均有報(bào)道，在廣西尚無該病毒的報(bào)道。項(xiàng)周等[29]通過分析15個(gè)CLBV分離物的CP基因部分序列，結(jié)果顯示CLBV分離物分組不明顯，與其寄主及地理來源無明顯相關(guān)性。近年來，廣西柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但是由于部分種植區(qū)田間管理不規(guī)范，病毒病日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致果品及產(chǎn)量逐年下降。對廣西多個(gè)柑橘種植區(qū)的柑橘碎葉病和葉斑病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，采集疑似病毒病樣品進(jìn)行病原分子鑒定和遺傳多樣性分析，將初步明確廣西柑橘碎葉病和葉斑病發(fā)生情況及其病原的遺傳多樣性，為進(jìn)一步研究和防治柑橘病毒病奠定基礎(chǔ)。1

材料與方法1.1

田間調(diào)查及采樣2018年12月至2019年11月，對廣西南寧、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、賀州及防城港等8個(gè)主要柑橘種植區(qū)的不同品種進(jìn)行柑橘病毒病調(diào)查。根據(jù)植株嫁接口腫大、葉片偏小且邊緣不規(guī)則、葉片皺縮、葉脈變黃等表觀特征，采集疑似病毒病樣品，以及少量無癥狀樣品，樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。1.2

方法1.2.1

柑橘葉片總RNA的提取

剪取50～100mg柑橘葉片樣品，置于備有2顆無菌鋼珠的2mLRNasefree離心管中，使用研磨儀研成粉末狀，用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后取1μL純化的總RNA樣品，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳以檢測提取的總RNA質(zhì)量，剩余RNA樣品保存于-80℃冰箱備用。1.2.2

引物合成

CTLV和ASGV同屬于發(fā)狀病毒屬（Capillovirus），具有高度同源性。本研究使用檢測引物ASGV-U/ASGV-2[30]對所采集疑似樣品進(jìn)行CTLV和ASGV檢測，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的CLBV檢測引物CLBV-1F/CLBV-5R[31]對所采集疑似樣品進(jìn)行CLBV檢測（表1）。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2.3

RT-PCR擴(kuò)增

以柑橘葉片總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系：4×gDNAwiperMix4μL，RNA模板1μL，RNase-freeddH2O11μL，瞬時(shí)離心，42℃水浴2min;再加5×HiscriptIIIqRTSuperMix4μL，瞬時(shí)離心。反轉(zhuǎn)錄程序：37℃15min;85℃5s;4℃保存。所得cDNA稀釋1倍，保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，分別使用CLBV、ASGV檢測引物CLBV1F/5R和ASGV-U/-2對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在干凈的PCR管中，加入2×RapidTaqMasterMix12.5μL，ddH2O9.5μL;上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL;已稀釋的cDNA模板1μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃，3min;變性94℃，15s;退火56℃，15s;延伸72℃，15s;35個(gè)循環(huán);72℃徹底延伸5min;于4℃保存。1.2.4

RT-PCR產(chǎn)物電泳及測序

取5μL的擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TAE緩沖液中，于1.5%瓊脂糖凝膠（含GoldViewI型核酸染色劑）中以120V、20min，檢測其完整性，用BIORAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。目的條帶清晰明亮的片段采用PCR產(chǎn)物直接測序法，目的條帶較暗淡的片段采用PCR產(chǎn)物純化法，提高產(chǎn)物濃度。本研究所有陽性樣品的PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行正反鏈雙向測序，對目標(biāo)片段內(nèi)正反向序列完全吻合的序列加以采用。所得核酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLAST程序（http：//www.ncbi./blast/Blast.cgi）進(jìn)行比對分析。1.2.5

CTLV、ASGV和CLBV基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了分析CTLV、ASGV和CLBV基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，首先從GenBank基因組數(shù)據(jù)庫（http：///genbank/）中分別檢索了所有與ASGV、CTLV和CLBV相關(guān)的序列，然后分別選擇具有代表性的ASGV、CTLV和CLBV分離物的CP基因序列，分別與本研究獲得的ASGV、CTLV和CLBV分離株的CP基因序列通過ClustalW程序與默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對分析（表2）。序列對齊后，分別在序列的5和3端裁掉不對應(yīng)的部分堿基以及刪去本研究中一致性較高的序列，利用MEGA7.0.26軟件采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，校檢次數(shù)（bootstrap）為1000次。再根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析各分離物的寄主和地理位置的相關(guān)性。2

結(jié)果與分析2.1

廣西柑橘碎葉病和柑橘葉斑病的調(diào)查2018年12月至2019年11月，在廣西南寧、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、賀州、及防城港等8個(gè)主要柑橘種植區(qū)調(diào)查柑橘病毒病的發(fā)生情況，共采集了165個(gè)樣品，其中沃柑82個(gè)、青柚23個(gè)、砂糖橘30個(gè)、甜橙7個(gè)、早熟溫州柑7個(gè)、貢柑7個(gè)、茂谷柑5個(gè)、蜜柚4個(gè)。調(diào)查結(jié)果顯示，在玉林市的調(diào)查點(diǎn)只發(fā)現(xiàn)柑橘葉斑病，發(fā)病率為0%～7.7%;在桂林市的調(diào)查點(diǎn)發(fā)現(xiàn)柑橘葉斑病和柑橘碎葉病，發(fā)病率為3.8%;南寧市調(diào)查點(diǎn)也發(fā)現(xiàn)柑橘葉斑病和柑橘碎葉病，且發(fā)病率最高，為4.2%～11.7%;其中發(fā)病最嚴(yán)重的區(qū)域是南寧市邕寧區(qū)百濟(jì)鎮(zhèn)壇里祝柑果園，發(fā)病率高達(dá)73%;在柳州、賀州、河池、崇左和防城港的調(diào)查點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)柑橘病毒病。本研究檢測到感染CTLV的柑橘葉片表現(xiàn)為黃脈、葉片黃化、葉片不規(guī)則等癥狀。檢測到感染ASGV、CTLV、CLBV的植株均有嫁接口不親和、腫大的共同特征（圖1A1）。檢測到感染ASGV的植株葉片表現(xiàn)為褪綠、葉小等癥狀;檢測到感染CLBV的柑橘葉片表現(xiàn)為葉片邊緣不規(guī)則;檢測到ASGV和CLBV復(fù)合侵染的植株表現(xiàn)為葉片皺縮、畸形、葉脈變黃、植株矮化等癥狀;檢測到CLBV和CTLV復(fù)合侵染的植株表現(xiàn)為葉片皺縮、畸形、葉面有斑點(diǎn)等癥狀（圖1A2）。2.2

RT-PCR檢測CLBV和ASGV用引物ASGV-U/ASGV-2和CLBV-1F/CLBV-5R對采集的疑似樣品進(jìn)行RT-PCR檢測。大部分樣品中都擴(kuò)增出499bp（ASGV-U/ASGV-2）和425bp（CLBV-1F/CLBV-5R）左右的特異目的條帶，而健康葉片和陰性對照無目標(biāo)條帶（圖2）。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，結(jié)果顯示利用引物ASGV-U/ASGV-2擴(kuò)增獲得的序列與GenBank上的ASGV和CTLV序列具有高度相似性，在93.07%～99.31%之間;而引物CLBV-1F/CLBV-5R擴(kuò)增獲得的序列與GenBank上的CLBV序列相似性高達(dá)98.06%～99.86%。2.3

廣西柑橘碎葉病和柑橘葉斑病的病原病毒種類及分布田間病害調(diào)查時(shí)共采集165份葉片樣品，包括有癥狀和無癥狀的植株樣品，其中檢測出26個(gè)樣品含有CTLV、ASGV和CLBV（表3）。在南寧市（邕寧區(qū)、馬山縣、園博園、武鳴區(qū)）和桂林市采集的12個(gè)樣品上檢測到CTLV病毒，檢出率為7.3%;在南寧市（邕寧區(qū)和上林縣）和桂林市采集的5個(gè)樣品上檢測到ASGV病毒，檢出率為3.0%;在南寧市（邕寧區(qū)）和玉林市采集的9個(gè)樣品上檢測到CLBV，檢出率為5.5%;此外，發(fā)現(xiàn)一些樣品存在2種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，CTLV和ASGV復(fù)合侵染的樣品有3份，占1.8%;CTLV和CLBV復(fù)合感染的樣品2份，占1.2%;ASGV和CLBV復(fù)合侵染的樣品1份，占0.6%。廣西各地的柑橘病毒檢出種類不同，檢出率差異較大。南寧和桂林是廣西的柑橘主要產(chǎn)區(qū)，病毒病發(fā)病率較高。南寧地區(qū)的病毒病發(fā)生情況也比較復(fù)雜，3種病毒均檢出，其中ASGV4份，占4.2%，CTLV11份，占11.7%，CLBV5份，占5.3%。桂林的26份樣品檢測出CTLV和ASGV各1份。玉林的柑橘葉斑病檢出率較高，14份樣品中有4份檢測為陽性，占28.6%（表3）。這3種病毒病目前在南寧、桂林和玉林的柑橘種植區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，其他地區(qū)的樣品未檢出，但仍需引起重視。2.4

CTLV和ASGV分離株的系統(tǒng)發(fā)育分析由于ASGV和CTLV的序列高度同源，將本研究獲得的ASGV基因組序列（表2）與NCBI的GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，可從中檢索出所有的ASGV和CTLV序列，通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3，圖4），結(jié)果表明，CTLV的寄主以柑橘類為主，而ASGV的寄主則以蘋果和梨為主，獼猴桃次之。并且CTLV和ASGV分離物主要來源于中國。為了揭示系統(tǒng)發(fā)育之間的關(guān)系，基于ASGV和CTLV基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對病毒分離物按不同地理來源和不同寄主來源進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，ASGV、CTLV與宿主種類或地理來源均有一定關(guān)系。2.4.1

地理位置分析

從地理位置進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，來源于中國的ASGV和CTLV主要以柑橘、蘋果、梨、獼猴桃4種寄主為主（圖3A），并按寄主類型聚類共聚為8組，分別命名為A、B、C、D、E、F、G、H組。聚類分支為A組的分離物全部來源于柑橘，包括來自湖南、重慶、廣東、廣西、臺灣等?。▍^(qū)）和本研究獲得的1個(gè)來源于廣西的分離物（MS-1）;聚類分支為B組的分離物均來源于武漢的梨;C組分為2個(gè)副組，部分來源于重慶、四川、湖北的柑橘聚為C1副組，部分來源于武漢獼猴桃的病毒為C2副組;D組和E組的分離物均來自湖北的梨;F組來源于湖南和臺灣的柑橘分離物;G組來源于吉林蘋果的分離物;H組大部分是本研究來自廣西柑橘上的分離物，只有1個(gè)是來源于遼寧蘋果上的分離物（A1）。因此，在中國的ASGV和CTLV2種病毒與地域分布顯著相關(guān)。ASGV在韓國主要寄生在梨和蘋果植株上，沒有檢索到與CTLV相關(guān)的序列，也沒有明顯的寄主聚類支（圖3B），但分別聚為5組，分別命名為A、B、C、D、E組。分支為A組的ASGV分離物均來自蘋果;B組的分離物有蘋果和梨;ASGV-SGS是來源于梨的分離物，單獨(dú)聚為C組;本研究分離物MS-1與韓國蘋果的分離物A211和梨的分離物KP2聚為D組;本研究所獲得的其他3個(gè)CTLV分離物和1個(gè)ASGV分離物全部聚在E組。在日本，ASGV和CTLV主要寄生在柑橘上，按地理位置聚為2組（圖3C），分別命名為A、B組。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，來源于日本柑橘上的ASGV和CTLV分離物聚為A組，本研究的ASGV和CTLV分離物聚為B組。值得一提的是，本研究的分離物MS-1與日本柑橘分離物聚為一組，其余7個(gè)分離物聚為另一組。從印度的系統(tǒng)發(fā)育分析來看，印度未檢索到CTLV相關(guān)分離物，檢測到的病毒以ASGV為主。ASGV的寄主有蘋果、獼猴桃、梨、柑橘等，但沒有寄主相關(guān)性，主要聚類為2個(gè)組（圖3D），分別命名為A、B組。其中A組又聚為A1、A2、A3三個(gè)副組，A1、A3均為印度分離物，而A2為本研究的中國廣西分離物。本研究的5個(gè)分離物分為2組，分離物MS-1既不與廣西分離物聚類，也不與印度分離物聚類，本地所有分離物與印度分離物不相關(guān)，包括較特異的MS-1。2.4.2

寄主相關(guān)性分析

從寄主相關(guān)性角度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以柑橘為寄主的大多為CTLV，而ASGV較少，以印度分離物為主，中國和日本分離物只有少數(shù)，經(jīng)NCBI檢索同樣可以證明這一點(diǎn)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，將基因型分為4個(gè)聚類（圖4A），Ⅰ組由14個(gè)成員組成，其中大部分來自中國臺灣和重慶的分離物，但本研究的MS-1與它們聚類在一組。由于在本研究中所評估的基因序列在聚類中表現(xiàn)出較大差異，因此它們的類群劃分并無明確界限。有8個(gè)分離物聚為Ⅱ組，Ⅱ組又細(xì)分為3個(gè)亞組。Ⅱ組最明顯的亞群為Ⅱ1，是來自中國的分離物（BJNM、YHC-1、SXH-1），Ⅱ2的2個(gè)CTLV分離物（Meyerlemon、TL110）來自美國，3個(gè)來自印度的ASGV分離物聚類在Ⅱ3，在Ⅱ組中明顯按地理位置聚類。因此，柑橘寄主上的CTLV和ASGV與地理位置具有一定相關(guān)性。來自中國重慶的2個(gè)分離物和來自中國廣西的2個(gè)分離物聚類在Ⅲ組，由于它們的遺傳距離較為相似，廣西的2個(gè)病毒分離物有可能是在重慶引種時(shí)隨著接穗帶到廣西。剩下的6個(gè)本地分離物（MS-4、XD-D、WM-7、SL-8、ZG-4、ZG-11）聚類在Ⅳ組。這6個(gè)樣品來自廣西5個(gè)不同的地點(diǎn)，CTLV分離物MS-4是馬山縣果園采集的樣品，CXD-D是來自桂林的樹苗移栽至廣西大學(xué)的樣品，WM-7樣品采自武鳴區(qū);ASGV分離物SL-8來自上林縣，ZG-4和ZG-11樣品采自邕寧區(qū)祝柑果園，南寧市區(qū)內(nèi)的3個(gè)分離物聚為1個(gè)分支，上林和桂林的分離物聚為另一個(gè)分支，在廣西同樣具有一定地理位置關(guān)系。以上6個(gè)分離物均采自沃柑，而沃柑是廣西的主要柑橘品種，ASGV和CTLV2種病毒已經(jīng)開始危害廣西的柑橘產(chǎn)業(yè)，因此，應(yīng)該重視這2種病害，加強(qiáng)檢疫，減少該病毒對柑橘的危害。利用本研究的11個(gè)分離物序列分別對來自中國、韓國和印度等國家的24個(gè)梨分離物和28個(gè)蘋果分離物進(jìn)行基因系統(tǒng)樹分析（圖4B，圖4C）。這些基因聚類為幾個(gè)主要組別，而且本研究基因序列與NCBI檢索的基因明顯分開，以蘋果為寄主的主要聚類為4個(gè)組群（圖4B），Ⅰ組主要是6個(gè)中國分離物和4個(gè)印度分離物，以及1個(gè)韓國分離物，還包括1個(gè)本地的柑橘分離物MS-1。MS-1與韓國蘋果分離物K211聚為1個(gè)分支，本地CTLV柑橘分離物MS-1很有可能來源于韓國。9個(gè)韓國分離物和1個(gè)巴西分離物以及2個(gè)印度分離物聚類為Ⅱ組，巴西的分離物為一個(gè)分支，印度分離物單獨(dú)一個(gè)分支，來自同一地理位置的分離物聚為一個(gè)分支，呈現(xiàn)出地理位置相關(guān)性。Ⅲ組由印度分離物和巴西分離物組成，各自又單獨(dú)為一個(gè)分支，具有地理位置相關(guān)性。由本地柑橘的8個(gè)分離物與1個(gè)遼寧分離物（A1）聚類為Ⅳ組。以梨為寄主的呈現(xiàn)2個(gè)分歧很大的分支（圖4C），所有分離物聚為2個(gè)組，其中本研究的10個(gè)分離物聚為Ⅱ組，本研究的其余1個(gè)分離物MS-1與NCBI數(shù)據(jù)庫檢索的24個(gè)分離物聚為Ⅰ組，并且MS-1與韓國梨分離物KP2聚在一個(gè)分支?？偟膩碚f，不管是蘋果還是梨，所有的組群都是由不同地區(qū)的ASGV組成，值得注意的是，本研究的分離物MS-1既與來自韓國蘋果分離物K211聚類，又與韓國梨分離物KP2聚類。再次表明本地CTLV柑橘分離物MS-1可能來源于韓國，并且與寄主種類無相關(guān)性。2.5

CLBV分離株的系統(tǒng)發(fā)育分析本研究共獲得9個(gè)柑橘葉斑病毒分離物的CP基因序列，序列登錄號見表2，基于CLBV部分CP基因核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖5），主要聚為3組（A、B、C），A組主要是前期報(bào)道來自中國（8個(gè)）、新西蘭（2個(gè)）以及韓國（1個(gè)）的分離物。其中，中國分離物包括本地柑橘的4個(gè)分離物，這些分離物來自不同的柑橘種植區(qū)，ZG-10和ZG-7采自南寧祝柑果園的樣品，YBY-10采自園博園，而BB-8采自玉林。源于中國的獼猴桃分離物HZ、F1-N、F-HY聚為B組，再次證明了CLBV的遺傳進(jìn)化與寄主有關(guān)。而中國櫻桃分離物（Prunus）單獨(dú)聚在C組，表明該組群在某種程度上與CLBV的寄主呈一定相關(guān)性。3

討論柑橘碎葉病是普遍發(fā)生的一種柑橘病毒病，在全球主要柑橘種植區(qū)均有報(bào)道，其中在中國CTLV為害較嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，ASGV和CTLV都可通過嫁接傳播[32-33]。用于嫁接的枝條或砧木帶毒，以及嫁接工具未消毒是導(dǎo)致ASGV和CTLV傳播的重要因素[34-35]。本研究對采自廣西8個(gè)柑橘主要種植區(qū)的165份葉片樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3.0%的樣品檢出ASGV，7.3%的樣品檢出CTLV，5.5%的樣品檢出CLBV（表3）。與項(xiàng)周等[29]調(diào)查中國7個(gè)省的CLBV和CTLV檢出率（9.6%、11.0%）相比，廣西柑橘碎葉病和葉斑病的檢出率略低。癥狀相同的植株攜帶的病毒種類可能不同，如南寧的ZG-2、ZG-7樣品植株表觀癥狀同為嫁接口腫大、葉片黃化偏小且邊緣不規(guī)則，ZG-2檢測到ASGV和CLBV，而ZG-7檢測到CTLV和CLBV。廣西柑橘病毒病復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍存在，同時(shí)檢測到ASGV和CLBV的植株表現(xiàn)為葉片皺縮、畸形、葉脈變黃、植株矮化等癥狀;同時(shí)檢測到CLBV和CTLV的植株表現(xiàn)為葉片皺縮、畸形、葉面有斑點(diǎn)等癥狀;且未表現(xiàn)癥狀的植株樣品也可能檢測到病毒的存在。因此，在柑橘種苗繁殖過程中，開展病毒早期診斷極為重要，應(yīng)在柑橘健康種苗的培育和生產(chǎn)中加強(qiáng)病毒檢測，加強(qiáng)專業(yè)技術(shù)指導(dǎo)，規(guī)范嫁接過程，減少病毒感染和傳播的機(jī)會。本研究首次在廣西南寧、玉林的柑橘樣品中檢測到CLBV，是近年來國內(nèi)新報(bào)道的一種柑橘病毒[19]。2017年項(xiàng)周等[29]首次報(bào)道該病毒在湖北、江西、四川和云南等省份的柑橘上發(fā)生。CTLV與CLBV屬于不同病毒科，它們在受到復(fù)合侵染的柑橘植株中的關(guān)系如何，其共同侵染是否會在致病過程中產(chǎn)生協(xié)同作用，均值得進(jìn)一步研究。為了比較來自世界各地的基因組序列與中國廣西分離株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，按不同寄主和不同地理來源分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3，圖4）。結(jié)果表明，ASGV和CTLV與宿主或地理起源均呈一定相關(guān)性。經(jīng)Blast結(jié)果證實(shí)，發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）的CTLV與ASGV2個(gè)分離株密切相關(guān)。姬盼等[36]在云南蘋果上ASGV的研究表明，分子變異與寄主或地域來源存在一定的相關(guān)性。本研究從地理位置進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖3A～圖3D），ASGV和CTLV在中國與寄主呈遺傳相關(guān)性，這與Liebenberg等[37]研究發(fā)現(xiàn)ASGV的多樣性與寄主存在一定相關(guān)性的結(jié)論一致。據(jù)報(bào)道，ASGV在西洋梨上的遺傳進(jìn)化也揭示了與寄主具有相關(guān)性[38]。在日本分離物的進(jìn)化樹中2種病毒的遺傳關(guān)系呈現(xiàn)出與地理區(qū)域有關(guān)，這一結(jié)論在本領(lǐng)域研究甚少。在韓國和印度都未檢索到CTLV，ASGV的遺傳關(guān)系也與寄主無關(guān)。從寄主上進(jìn)行分析，根據(jù)所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)（圖4a～圖4c），以柑橘為寄主的CTLV和ASGV沒有明顯分組，但亞組中明顯按地理位置聚類;在蘋果寄主上的Ⅱ組和Ⅲ組有一定的地理位置相關(guān)性，但不顯著;這一結(jié)論與李正男等[17]在沙果上ASGV全基因組的分析一致。在寄主梨上既無地理位置相關(guān)性也無寄主相關(guān)性，鄭銀英等[18]通過分析ASGV的CP基因序列也表明其遺傳關(guān)系與寄主及地理來源無明顯相關(guān)性。綜上分析，與來自不同寄主和不同國家無關(guān)的系統(tǒng)發(fā)育簇可能是無性繁殖、國家間種質(zhì)交換以及繁殖材料長距離運(yùn)輸或是一棵樹上多次嫁接所導(dǎo)致的。本研究的分離物MS-1不與其他本地分離物聚類而與韓國、日本分離物聚類，可能是在進(jìn)行種質(zhì)交換時(shí)，病毒通過引進(jìn)種苗傳播到廣西。而其他本地分離物始終聚在一起，與不同寄主、不同來源的分離物都具有較遠(yuǎn)的遺傳距離，說明本地砧木可能存在感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在引進(jìn)柑橘品種過程中，不僅只檢疫柑橘苗木，而且要對砧木進(jìn)行檢疫。本研究對廣西不同地理來源的柑橘植株上的CLBV分離物進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，該病毒遺傳變異很小，這與Vives等[39]報(bào)道的結(jié)論一致，這表明該組群在某種程度上與CLBV的寄主呈一定相關(guān)性。本研究的CLBV系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，廣西柑橘上CLBV的CP基因核苷酸序列與來源不同寄主的基因序列具有明顯的寄主相關(guān)性。Chavan等[31]在獼猴桃基因組分析得出CLBV與其寄主來源有關(guān)。有研究表明，CLBV主要的傳播途徑包括無性繁殖材料和種苗運(yùn)輸過程[40]，還可通過種子侵染柑橘[41]。因此，為了防止該病毒擴(kuò)散，應(yīng)加強(qiáng)對種苗及繁殖材料的檢疫。目前有關(guān)這3種病毒的遺傳多樣性及其在中國柑橘上的危害特性研究相對缺乏，本研究分離了17個(gè)柑橘病毒基因序列，可為柑橘病毒遺傳多樣性研究提供更加豐富的病毒基因信息，同時(shí)，為后續(xù)病毒重組事件分析提供基因數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，以此獲得更全面的病毒基因遺傳情況，解析病毒的遺傳變異。Reference[1]崔一平，彭埃天，李子力，等.海南省柑橘主產(chǎn)區(qū)黃龍病和病毒病的發(fā)生危害情況調(diào)研初報(bào)[J].植物保護(hù)，2019，45（4）：236-242.[2]孫現(xiàn)超，周常勇，青

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