課題2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段

視頻一：魔術

小時候，我們經常為魔術師的經典魔術所驚嘆，他們可以把一只鴿子放入帽子里，然后變出許多鴿子。新課導入

美國科學家穆里斯就變了這樣一個魔術，不過他變魔術的材料不是鴿子，而是是DNA。

他發(fā)明的PCR技術可以使DNA在反應30次后變?yōu)楝F在的109倍。專題五DNA和蛋白質技術課題2教學目標知識目標1.理解PCR原理。2.了解PCR的應用。3.掌握PCR的基本步驟。能力目標1.掌握PCR技術的基本操作。2.體驗分子生物學實驗方法。過程與方法基本知識的闡述。2.學生在實驗過程中鞏固。情感態(tài)度與價值觀1.激發(fā)學生對科學的興趣。2.培養(yǎng)學生善于思考的創(chuàng)新精神。教學重難點課題重點的原理。的基本操作。課題難點PCR的原理。內容解析基礎知識DNA復制的條件解旋酶：打開DNA雙鏈DNA母鏈：提供DNA復制模板4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈引物：使DNA連接脫氧核苷酸思考：能否在體外模擬體內DNA復制條件，進行DNA擴增？PCR技術PCR技術的原理打開DNA雙鏈在80-100℃溫度范圍內，DNA變性，雙螺旋結構解體，雙鏈打開DNA母鏈解體后的雙鏈為兩條母鏈合成子鏈原料四種脫氧核苷酸引物與兩條模板鏈結合的兩種引物DNA聚合酶耐高溫的TaqDNA聚合酶溫度變性溫度94℃復性溫度72℃延伸溫度55℃溫度＞90℃，雙鏈解旋為兩條單鏈PCR過程變性90℃溫度≈50攝氏度，兩種引物分別與兩條單鏈DNA結合復性50℃溫度≈70℃，在DNA聚合酶的作用下，根據堿劑互補配對原則合成新的DNA鏈延伸70℃PCR反應詳細解析第一輪變性ＡＢ復性ＡＢ延伸ＡＢ第二輪Ａ變性Ａ1Ａ2A鏈PCR復性Ａ1Ａ2延伸Ａ1Ａ2PCR終產物B鏈PCR變性BB1B2復性B1B2PCR終產物延伸B1B2第三輪A1B2同A鏈第二輪PCR反應同B鏈第二輪PCR反應試驗設計利用PCR技術擴增雙歧桿菌的DNA的片段實驗器材雙歧桿菌培養(yǎng)基離心機微量移液器化學試劑PCR儀1.雙歧桿菌的培養(yǎng)培養(yǎng)24h培養(yǎng)基配方：大豆蛋白胨5g酵母提取物10g微量鹽溶液40ml葡萄糖10g半膀氨酸鹽酸鹽0.5g0.1%胰胨5g刃天青1mlPH=7實驗過程操作菌液離心，保留底部雙歧桿菌沉淀在雙歧桿菌沉淀中加入裂解液，使細胞裂解，釋放DNA處理2.提取DNA55℃加熱孵育3h90℃加熱10min冷冰中冷卻離心1.菌體處理4.其它組分添加DNA上清液10μL10倍擴增緩沖液5μL25mmol/LMgCl2溶液3μL20mmol/L4種脫氧核苷酸的均勻混合液1μLTaq聚合酶1μL兩種引物各蒸餾水29μL預變性94℃，5min30次重復反應94℃，30s55℃，30s最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min72℃，1min反應變性復性延伸產物檢驗分光光度計法取2μLPCRDNA溶液，加入98μLH2O，使DNA５０倍稀釋以蒸餾水為對照，在260nm處測樣品DNA的光吸收值根據公式計算DNA含量DNA含量（μg/mL）=50×（260nm度數）×稀釋倍數結果分析與評價根據公式計算DNA片段的含量比擴增前增加了了多少倍。相關鏈接瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA含量1.配制濃度為１％的瓊脂糖凝膠，倒入電泳槽中，插好梳子2.向電泳槽中加入電泳緩沖溶液，移去梳子3.在DNA中加入載樣緩沖液，混勻后，滴加到樣品孔中4.接通電源，電泳20-40min+-5.EB溶液染色，在紫外儀上觀察電泳帶及其位置，判斷擴增情況觀察電泳帶的粗細以及分布評價擴增的效果。課堂小結在體外制造與體內相同的環(huán)境，進行DNA復制反應緩沖溶液DNA模板與兩條模板鏈結合的兩種引物PCR原理PCR反應條件四種脫氧核苷酸耐熱的DNA聚合酶合適的溫度變性復性延伸PCR反應過程DNA含量檢測紫外分光光度計法凝膠電泳法高考鏈接1.2006.廣東下列關于基因工程應用的敘述，正確的是（）A．基因治療就是把缺陷基因誘變成正?；駼．基因診斷的基本原理是DNA分子雜交C．一種基因探針能檢測水體中的各種病毒D．原核基因不能用來進行真核生物的遺傳改良B解析：基因治療是把健康的外源基因導入到有缺陷基因的細胞中；一種基因探針能檢測相應的某一種特定的病毒；原核基因可以用來進行真核生物的遺傳改良，例如用蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因改良棉花。2.2005.全國卷Ⅱ檢測基因序列所必須的酶是（）

A.解旋酶

連接酶

C.限制性內切酶

聚合酶C解析：A.解旋可以用加熱法。B.DNA連接酶是在取得目的基因、并打開運載體后把它們組合起來時使用的。D.RNA聚合酶是在轉錄或者RNA自我復制時使用3.2002.廣東判斷：DNA復制中單個脫氧核苷酸在DNA酶的作用下連接合成新的子鏈()×解析

DNA酶包括DNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA內切酶等，此處應當指DNA聚合酶。課堂練習填空題1.PCR儀加熱使（）變性,復性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料合成新鏈。2.PCR經（）三個階段為一個循環(huán)。DNA互補72℃Tap酶4種dNTP變性、復性、延伸選擇題反應產物的特異性取決于()A退火溫度B引物堿基組成和長度C循環(huán)次數D.A+B+CD2.PCR實驗的特異性主要取決于（）聚合酶的種類B.反應體系中模板DNA的量C.引物序列的結構和長度D.四種dNTP的濃度C簡答題1.PCR反應包括引物與DNA模板鏈間的解鏈與復性。討論循環(huán)溫度范圍對引物-DNA雙螺旋穩(wěn)定性的影響及對PCR產率的影響。答：由于GC對間是三個氫鍵的作用力，比兩個氫鍵作用力的AT對要穩(wěn)定，因此DNA的解鏈與退火都是依賴于G+C的含量與A+T的含量的比例。GC對普遍比AT對更傾向于非特異性的復性，所以GC含量高的引物比AT含量高的引物更適合于PCR反應。2.你打算擴增下圖所示的兩段序列之間的DNA，請從所列出引物中選出合適的一對，5’-GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG-3’3’-CTGGACACCTTCGGTATGCCCTAAC-5’引物1

引物25’-GACCTGTGGAAGC5’-CATACGGGATTG5’-CTGGACACCTTCG5’-GTATGCCCTAAC5’-CGAAGGTGTCCAG5’-GTTAGGGCATAC5’-GCTTCCACAGGTC5’-CAATCCCGTATG答：引物1：5’-GACCTGTGGAAGC引物2：5’-CAATCCCGTATG的基本原理是什么？用PCR擴增某一基因，必須預先得到什么樣的信息？答：（1）利用DNA半保留復制的原理，在體外進行DNA的變性、復性和引物延伸。（2）至少要預先知道足夠合成一對引物的靶DNA序列。教學習題答案1.請繪圖表示PCR反應的前三個循環(huán)步驟。假設在PCR反應中，只有一個DNA片段作為膜拜，請計算在30次循環(huán)反應后，反應物中大約有多少個這樣的DNA片段。答：（1）前三個循環(huán)步驟詳見課件“基礎知識”部分。（2）PCR反應中