生物技術(shù)在園藝植物育種中的應(yīng)用課件

生物技術(shù)(Biotechnology):以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種或新品系，以及與工程原理相結(jié)合進行加工生產(chǎn)，為社會提供商品和服務(wù)的一個綜合性技術(shù)體系。生物技術(shù)是在分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代工程學(xué)的方法和原理而發(fā)展起來的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。生物技術(shù)(Biotechnology):以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利1第一節(jié)組織與器官培養(yǎng)第二節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)第四節(jié)體細胞雜交第五節(jié)植物細胞突變體的離體篩選第六節(jié)基因工程與育種第七節(jié)分子標記與育種主要內(nèi)容：第一節(jié)組織與器官培養(yǎng)第二節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)第三節(jié)原生質(zhì)體2植物組織培養(yǎng)

（PlantTissueCulture）將植物離體器官、組織或細胞等外植體，在適宜的人工培養(yǎng)基和無菌條件下，給予光照、溫度等環(huán)境條件并培養(yǎng)，使其生長、增殖、發(fā)育形成小植株的方法。狹義的組織培養(yǎng)僅指愈傷組織培養(yǎng)，廣義的組織培養(yǎng)指各種類型的植物無菌培養(yǎng)技術(shù)。組織培養(yǎng)概念多指廣義上的組織培養(yǎng)技術(shù)，包括胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)(愈傷組織培養(yǎng))、細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等。植物組織培養(yǎng)

（PlantTissueCulture）將3植物特殊倍性創(chuàng)造植物組織培養(yǎng)培育植物新品種種苗脫毒與快速繁殖體細胞雜交次生產(chǎn)物生產(chǎn)基礎(chǔ)研究植物特殊植物培育植物種苗脫毒與體細胞雜交次生產(chǎn)物基礎(chǔ)研究4第一節(jié)組織與器官培養(yǎng)組織與器官培養(yǎng)的類別組織與器官培養(yǎng)的應(yīng)用第一節(jié)組織與器官培養(yǎng)組織與器官培養(yǎng)的類別組織與器官培養(yǎng)的5莖尖和分生組織培養(yǎng)胚培養(yǎng)胚珠和子房培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)離體葉的培養(yǎng)組織與器官培養(yǎng)

(tissueandorganculture):莖尖和分生組織培養(yǎng)組織與器官培養(yǎng)

(tissueando6相關(guān)專業(yè)術(shù)語細胞全能性(totipotency):一個細胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有能力。外植體(explant):用于培養(yǎng)的離體材料。愈傷組織(callus):在培養(yǎng)過程中，從植物各種器官、組織的外植體增殖而形成的一種無特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞團。胚狀體(embryoid):由外植體或愈傷組織產(chǎn)生的,與正常受精發(fā)育方式類似的胚胎結(jié)構(gòu)。繼代培養(yǎng)(subculture)：對外植體增殖的培養(yǎng)物(包括細胞、組織或其切段)通過更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分離，進行連續(xù)多代培養(yǎng)。相關(guān)專業(yè)術(shù)語細胞全能性(totipotency):一個細胞7組織和器官培養(yǎng)全過程可分四個階段:無菌培養(yǎng)物的建立營養(yǎng)繁殖體的增殖生根植株移栽各個階段在培養(yǎng)基,生長調(diào)節(jié)劑的配比和濃度,培養(yǎng)方式和環(huán)境上都不同的要求.組織和器官培養(yǎng)全過程可分四個階段:無菌培養(yǎng)物的建立營養(yǎng)繁殖體8組織和器官培養(yǎng)在育種中的作用加快園藝植物新品種和良種繁殖速度培養(yǎng)無病毒苗木誘發(fā)和離體篩選突變體進行種質(zhì)資源長期保存和遠距離運輸獲得倍性不同的植株克服種子發(fā)育和萌發(fā)中的障礙克服遠源雜交困難提供育種中間材料組織和器官培養(yǎng)在育種中的作用加快園藝植物新品種和良種繁殖速度9第二節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)第二節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)10花藥培養(yǎng)：其外植體為植物雄性生殖器官的一部分，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講，屬于器官培養(yǎng)的范疇。花粉培養(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離，再加以離體培養(yǎng)。有時花粉培養(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)(microsporeculture)。從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面來講，它屬于細胞培養(yǎng)的范疇?；ㄋ幣囵B(yǎng)：其外植體為植物雄性生殖器官的一部分，就培養(yǎng)方法和技11花藥培養(yǎng)的基本程序外植體選擇→外植體(花蕾)預(yù)處理→外植體消毒→剝?nèi)』ㄋ帯臃N→誘導(dǎo)培養(yǎng)→分化培養(yǎng)花藥培養(yǎng)的基本程序12

在離體培養(yǎng)條件下要使花藥中的花粉改變其正常發(fā)育方向而形成單倍體植株，需要各種因素共同調(diào)節(jié)和控制。

外因：培養(yǎng)基的成分，外源激素的種類，糖的濃度

內(nèi)因：主要決定于花藥中花粉發(fā)育時期在離體培養(yǎng)條件下要使花藥中的花粉改變其正13培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基：MS（Murashigc&Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborgetal.，1976)。附加成分：蔗糖,激素。培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基：14花藥培養(yǎng)常用的激素細胞分裂素類：

BA—6-benzyladeninKT—kinetinZeatin

生長素類：

NAA—naphthaleneaceticacidIAA—indole-3-aceticacid2,4-D—2,4-dichlorophenoxyaceticacid花藥培養(yǎng)常用的激素15蔗糖:蔗糖在花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的功能主要是：提供C源；維持適宜的滲透壓；抑制花藥壁的分裂而促進花粉細胞分裂。

番茄花藥培養(yǎng)對蔗糖濃度的誘導(dǎo)反應(yīng)

蔗糖濃度（％）2346101317

誘導(dǎo)頻率（％）510121825458蔗糖:蔗糖在花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的功能主要是：提供C源；維持適宜16花粉發(fā)育時期四分體→小孢子→

單核花粉→雙核花粉最適期花粉發(fā)育時期17花粉及小孢子培養(yǎng)1．取材時期的確定

四分體—單核早期—單核晚期—雙核早期—雙核晚期—三核期小孢子花粉粒花粉及小孢子培養(yǎng)1．取材時期的確定小孢子花粉粒18花藥培養(yǎng)與小孢子培養(yǎng)的目的一樣，為獲得單倍體。單倍體(haploid):指具有配子體染色體數(shù)的孢子體(植物個體)。

diploid植物，其haploid即為monoploid

玉米2n=2x=20n=x=10

柑橘2n=2x=18n=x=9tetraploid植物，其haploid為dihaploid

馬鈴薯2n=4x=48n=2x=24hexaploid植物，其haploid為triploid

普通小麥2n=6x=42n=3x=21octoploid植物，其haploid為tetraploid

草莓2n=8x=56n=4x=28花藥培養(yǎng)與小孢子培養(yǎng)的目的一樣，為獲得單倍體。單倍體(hap19單倍體在育種中有特殊的地位，其作用表現(xiàn)在加倍后可迅速獲得純合型材料，縮短育種年限。獲得育種中間材料。與誘變育種相結(jié)合可以提高誘變頻率。與細胞融合相結(jié)合，使這一育種途徑更具有實際應(yīng)用意義，無籽三倍體。作為遺傳工程受體更為有效。用于基礎(chǔ)遺傳研究的各個領(lǐng)域

。獲得超雄植株（YY)。可獲得異源體附加系、代換系和易位系。單倍體在育種中有特殊的地位，其作用表現(xiàn)在加倍后可迅速獲得純合20第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交的步驟原生質(zhì)體培養(yǎng)（Protoplastculture）體細胞雜交（Somatichybridization）原生質(zhì)體融合（Protoplastfusion）第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交的步驟21一.原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細胞壁的細胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍的裸露細胞。

亞原生質(zhì)體(subprotoplast)：在原生質(zhì)體分離過程中，有時會引起細胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。它可以具有細胞核或沒有細胞核。

核質(zhì)體(nuclearplast)：由原生質(zhì)膜和薄層細胞質(zhì)包圍細胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體(miniprotoplast)。

胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細胞核而僅含有部分細胞質(zhì)的原生質(zhì)體。一.原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細22二.原生質(zhì)體的分離基礎(chǔ)材料準備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體活力測定原生質(zhì)體收集與純化二.原生質(zhì)體的分離基礎(chǔ)材料準備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體活力測定原231.分離原生質(zhì)體材料的準備無菌試管苗葉片上胚軸和子葉

培養(yǎng)細胞1.分離原生質(zhì)體材料的準備無菌試管苗葉片242.預(yù)處理及酶解酶酶解滲透壓調(diào)節(jié)劑2.預(yù)處理及酶解酶酶解滲透壓25材料預(yù)處理在游離原生質(zhì)體前對供體材料進行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可以提高某些材料原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。例如龍膽試管苗的葉片只有用4℃低溫處理，甘蔗植株必須先在黑暗條件下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂。材料預(yù)處理26原生質(zhì)體分離常用的商品酶

酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類onozukaR–10綠色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin綠色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果膠酶類MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纖維素酶RhozymeHP-150黑曲酶RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USA原生質(zhì)體分離常用的商品酶酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類27酶溶劑及其滲透壓

溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶溶劑及其滲透壓28酶處理

酶解溫度酶濃度酶解時間酶處理酶解溫29l3、原生質(zhì)體的分離純化l3、原生質(zhì)體的分離純化30原生質(zhì)體的收集和純化飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：常用甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，先將酶液洗出干凈，再用Percoll飄浮一次。

原生質(zhì)體的收集和純化飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percol314.原生質(zhì)體活力測定目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、流動性確定原生質(zhì)體活力。

FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細胞質(zhì)膜，在活細胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細胞的觀察確定細胞活性。伊凡藍法：伊凡藍不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴重損壞，細胞才能被染色，因而可以通過細胞被染色與否確定活性。4.原生質(zhì)體活力測定目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、流32

FDA熒光染色法(雙醋酸熒光素)

在熒光顯微鏡下，有活力的原生質(zhì)發(fā)熒光，無活力的不發(fā)熒光。生活力測定：FDA熒光染色法(雙醋酸熒光素)生活力測定：33影響原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)

酶解條件酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓分離條件離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時間環(huán)境條件操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響

影響原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)

34三、原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)方法三、原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)方法351.原生質(zhì)體培養(yǎng)基無機鹽大量元素濃度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+濃度有機成分

維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。1.原生質(zhì)體培養(yǎng)基無機鹽362、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)固-液體雙層培養(yǎng)瓊脂糖珠培養(yǎng)2、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)37

原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)38柑桔融合實例柑桔融合實例39生物技術(shù)在園藝植物育種中的應(yīng)用課件40第四節(jié)體細胞雜交定義：將兩個不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)融合并培養(yǎng)再生成株的過程，統(tǒng)稱為體細胞雜交（A+B）幾種不同的表述：體細胞雜交：Somatichybridization

細胞融合：Cellfusion

原生質(zhì)體融合：Protoplastfusion

無性雜交：asexualhybridization

超性雜交：Parasexualhybridization

超性融合：Parasexualfusion

細胞工程：Cellengineering第四節(jié)體細胞雜交定義：將兩個不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)41植物細胞雜交的幾個重要進展

1960年，Kocking用酶法制備高等植物原生質(zhì)體首次獲得成功；1971年，Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株；1972年，Carlson首次獲得粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜種，這是第一個植物細胞雜種；1974年，Kao將聚乙二醇誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細胞融合并建立了相應(yīng)的融合技術(shù)；1978年，Melchers獲得第1個屬間細胞雜種（番茄＋馬鈴薯）；1981年，Zimmerman發(fā)明電融合儀，并首次提出電融合概念；1987年，Schweiger建立單對原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。植物細胞雜交的幾個重要進展42體細胞雜交與有性雜交的異同比較內(nèi)容體細胞雜交有性雜交時間無季節(jié)限制花期限制，特別是母本的花期親緣關(guān)系一定程度上可以克服有性/嫁接不親和性受親和性影響結(jié)果細胞核、細胞質(zhì)均可以重組、倍性增加雙受精，一般無細胞質(zhì)重組，倍性不改變體細胞雜交與有性雜交的異同比較內(nèi)容體細胞雜交有性雜交時間無季43+體細胞雜交有性雜交+體細胞雜交有性雜交44原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-I對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質(zhì)均為100%）非對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質(zhì)不等（相對值）胞質(zhì)雜種（cytoplasmichybrid,Cybrid）：細胞質(zhì)重組，細胞核未重組對稱融合（symmetricfusion）也稱標準融合（Standardfusion）非對稱融合（asymmetricfusion）：融合前對一方進行處理，使其染色體丟失一部分原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-I對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質(zhì)45原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-II供-受體融合：Donor-recipientfusion體配融合（gameto-somaticfusion）（性細胞與體細胞融合）亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合：

Subprotoplast-protoplastfusion

小原生質(zhì)體：Miniprotoplast

微原生質(zhì)體：Microprotoplast

胞質(zhì)體：Cytoplast胞質(zhì)體-原生質(zhì)體融合:Cytoplast-protoplastfusion原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-II供-受體融合：Donor-rec46原生質(zhì)體融合的方式化學(xué)方法：聚乙二醇法

Polyethyleneglycol（PEG），與高pH高Ca結(jié)合使用物理方法：電融合法

Electrofusion,Electricallyinducedfusion原生質(zhì)體融合的方式化學(xué)方法：聚乙二醇法47

理論上，任何細胞都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源，這對種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。理論上，任何細胞都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源，48體細胞雜交的程序及方法原生質(zhì)體融合雜種細胞篩選方法：PEG，電融合，NaNO3營養(yǎng)互補選擇法，遺傳互補選擇法，機械選擇法，形態(tài)學(xué)方法細胞學(xué)方法同工酶方法分子標記法體細胞雜種植株的鑒定體細胞雜交的程序及方法原生質(zhì)體融合雜種細胞篩選方法：PEG，49親本A親本B原生質(zhì)體聚合融合處理分離的原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合融合體移植雜種融合體篩選雜種融合體移栽至不同的培養(yǎng)基體細胞雜交篩選親本A親本B原生質(zhì)體聚合融合處理分離的原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合融50原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交的應(yīng)用獲得新品種；創(chuàng)造新種質(zhì)；轉(zhuǎn)移有利性狀和克服遠源雜交的障礙；作為基因工程的良好受體及進行突變體篩選的優(yōu)良原始材料。原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交的應(yīng)用獲得新品種；51第五節(jié)植物細胞突變體的離體篩選

在離體培養(yǎng)條件下，誘發(fā)突變的突變型和自發(fā)突變沒有本質(zhì)上的差別。一般都在三個水平上發(fā)生：基因組突變：染色體數(shù)目的改變或細胞質(zhì)基因組的增減；染色體突變：染色體較大范圍的結(jié)構(gòu)變化，涉及多個基因；基因突變：指范圍在一個基因以內(nèi)分子結(jié)構(gòu)的改變。按DNA改變方式有堿基置換突變，移碼突變，缺失突變和插入突變。體細胞無性系變異：Somaclonalvariation一、突變體的產(chǎn)生第五節(jié)植物細胞突變體的離體篩選一、突變52二、突變細胞的篩選方法直接選擇法

正選擇/負選擇間接選擇法二、突變細胞的篩選方法直接選擇法間接選擇法53正選擇用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上只有突變細胞能夠生長，非突變細胞不能生長，從而直接篩選出突變體。如抗除草劑、抗鹽堿突變體的篩選，均可直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度的除草劑或增加滲透壓的物質(zhì)。目前采用這一途徑，已從多種植物中篩選出可利用的體細胞變異體。賈敬芬等以小麥幼胚愈傷組織為材料，在含有1.4％NaCl的N6培養(yǎng)基上直接篩選出小麥耐鹽系。分析顯示，耐鹽系游離氨基酸含量是供體親本的4.1倍。鄭企成等也曾將小麥“京花1號”花藥經(jīng)γ射線處理后，再經(jīng)0.5％NaCl培養(yǎng)基直接篩選獲得耐鹽再生株系。李愛賢等以甘薯“栗子香”為材料誘導(dǎo)胚性細胞系，從900個通過γ射線輻射的細胞團中，在含有2.0％NaCl的培養(yǎng)基中進行篩選，獲得22個抗鹽愈傷組織，并獲得20個抗鹽再生植株。正選擇用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上只有突變細54負選擇一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標的篩選方法。Dorffling等以Pro類似物羥脯氨酸（HYP）為選擇劑，獲得了耐HYP的體細胞變異系，其抗寒性比供體親本增強，且能穩(wěn)定遺傳。林定波等將錦橙株心細胞愈傷組織的懸浮細胞經(jīng)γ射線照射，然后在高濃度脯氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選，獲得了抗寒體細胞變異愈傷組織，并再生植株。鑒定顯示，抗寒愈傷組織及其再生植株的抗寒性分別比供體提高1.4℃和2.4℃，突變系體內(nèi)的Pro含量比供體增加了一倍。

負選擇一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標的篩選方法55三、突變性狀遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定遺傳基礎(chǔ)穩(wěn)定性三、突變性狀遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定遺傳基礎(chǔ)穩(wěn)定性56突變性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ)體細胞變異，除發(fā)生在染色體水平外，更多的是基因水平上的變異。從利用體細胞變異的角度，染色體變異大多是一些畸形變異，真正可利用的染色體變異十分有限?；蛩缴系淖儺愒诒硇蜕洗蠖嘀皇莻€別性狀的改變，不會影響再生植株的正常生長發(fā)育。因此，從再生植株的這些變異中有可能篩選有益的變異?；蛩缴系淖儺?，從根本上講是DNA的堿基突變或修飾狀態(tài)的改變。

突變性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ)體細胞變異，除發(fā)生在染色體水平外，更多的57突變性狀的穩(wěn)定性對于單基因控制的遺傳性狀，大多數(shù)堿基突變可以穩(wěn)定遺傳而且符合孟德爾遺傳分離規(guī)律，這一點已在水稻、煙草和玉米的體細胞變異中得以證實。Brettell等從645株玉米雜種胚培養(yǎng)再生植株中，發(fā)現(xiàn)了一個穩(wěn)定突變體Adh1（乙醇脫氫酶突變體），克隆基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因第七外顯子中一個編碼谷氨酸的GAG中的A轉(zhuǎn)換成為了T，使翻譯肽鏈中的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸。植物的許多性狀特別是經(jīng)濟性狀均由多基因控制，對于多基因控制性狀的堿基突變可能由于技術(shù)上的復(fù)雜性，目前還沒有關(guān)于多基因控制性狀的堿基突變報道。突變性狀的穩(wěn)定性對于單基因控制的遺傳性狀，大多數(shù)堿基突變可以58GeneticEngineeringandBreeding第六節(jié)基因工程與育種GeneticEngineeringandBreedi59植物基因工程（plantgeneticengineering）：指以類似工程設(shè)計的方法，按照人們的意志，通過一定的程序，將具有遺傳信息的DNA片斷，在離體條件下，用工具酶加以剪切、組合和拼接，再將人工重組的基因引入適當?shù)闹参锸荏w中進行復(fù)制和表達的技術(shù)。轉(zhuǎn)基因植物：transgenicplant轉(zhuǎn)基因技術(shù):Transgenictechnique植物基因工程（plantgeneticengineeri60一、Definition

指把不同生物有機體的DNA（或基因）分離提取出來，在體外進行酶切和連接，構(gòu)成重組DNA(recombinationDNA)分子，然后轉(zhuǎn)化到受體細胞（如,大腸桿菌），使外源基因在受體細胞中復(fù)制增殖，然后借助生物的或理化的方法將外源基因?qū)氲街参锛毎?，進行轉(zhuǎn)譯和表達?；蚬こ?一、Definition指把不同生物有機61基因分離、克隆農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因槍介導(dǎo)基因插入Ti/Ri質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌侵染植物包裹DNA的微粒彈質(zhì)粒DNA制備基因質(zhì)粒進入植物細胞DNA整合進植物染色體基因槍轟擊植物細胞檢測轉(zhuǎn)基因篩選轉(zhuǎn)基因細胞轉(zhuǎn)基因細胞再生植株檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌和基因槍介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化流程圖基因分離、克隆農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因槍介導(dǎo)基因插入Ti/Ri質(zhì)粒載體62基因工程的基本步驟和方法目的基因的分離與鑒定植物表達載體的構(gòu)建植物的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化植物細胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定基因工程的基本步驟和方法目的基因的分離與鑒定63各種來源目的基因的分離與克隆克隆基因的鑒定和分析有用基因的亞克隆待改良植物的選擇和預(yù)處理植物受體細胞系統(tǒng)制備植物細胞的遺傳轉(zhuǎn)化異源基因在植物細胞中的整合與表達轉(zhuǎn)基因植株的育成和轉(zhuǎn)化含異源基因的重組細胞的篩選和培養(yǎng)重組細胞的分裂與分化植物基因轉(zhuǎn)移的過程各種來源目的基克隆基因的鑒定和分析有用基因的亞克隆待改良植物64二、基因工程在園藝植物育種中的應(yīng)用改良品質(zhì)提高抗病蟲能力改良抗逆性提高光合作用和固氮效率創(chuàng)建雄性不育材料延遲成熟與保鮮選育抗除草劑品種二、基因工程在園藝植物育種中的應(yīng)用改良品質(zhì)65

提高抗病能力抗細菌基因工程途徑:☆過量表達法☆克隆轉(zhuǎn)化溶菌酶基因或殺菌肽基因抗真菌基因工程途徑:☆克隆并導(dǎo)入幾丁質(zhì)酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因☆克隆并導(dǎo)入抗毒素提高抗病能力抗細菌基因工程途徑:☆過量表達法抗真菌基因工程66過量表達來自番茄PR蛋白的甜橙抗腳腐病過量表達來自番茄PR蛋白的甜橙抗腳腐病67過量表達CTVCP蛋白的來檬抗CTVThep25coatprotein(CP)geneofCitrustristezavirus(CTV)wasincorporatedtoMexicanlimeplantsandforty-twotransgeniclineswereproduced,25containingthep25CPgeneofthesevereCTVstrainT-305and17withthatofthemildstrainT-317.Whenplantspropagatedfromeachtransgeniclineweregraft-inoculatedwithCTVT-305oraphidinoculatedwithT-300,twotypesofresponsetoviralchallengewereobserved:somelinesdevelopedCTVsymptomssimilartothoseofnon-transgeniccontrols,whereasothersexhibitedprotectionagainstthevirus.Thisprotectionconsistedofaproportionofplants,rangingfrom10to33%,thatwereresistanttoCTV,andtherestofthemthatshowedasignificantdelayinvirusaccumulationandsymptomonset.Protectionwasefficientagainstnon-homologousCTVstrainsandwasgenerallyaccompaniedbyhighaccumulationofp25CPintheprotectedlines,whichsuggestaCP-mediatedprotectionmechanisminmostcases.MolecularBreeding2002,10:1–10實例過量表達CTVCP蛋白的來檬抗CTVThep25coa68CTVsymptomsofdifferentintensityinyoungleavesaftergraft-inoculationwithCTVT-305.Severeleafdistortionandstuntingsymptomsinanon-transgeniccontrolplant(left),delayinvirusinfectionandsymptomattenuationinatransgenicplant(centre),andresistanceagainstCTVT-305inothertransgenicplant(right).CTVsymptomsofdifferentinte69

如.1986年Beachy等將煙草花葉病毒的外殼蛋白基因（TMV-CP)導(dǎo)入煙草中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株發(fā)病時間明顯延遲或病毒的癥狀明顯減輕?？共《净蚬こ掏緩?☆向植物中導(dǎo)入病毒外殼蛋白（CP）

☆轉(zhuǎn)移病毒的反義RNA,衛(wèi)星RNA,病毒復(fù)制酶基因和核酶基因等如.1986年Beachy等將煙草花葉病毒的外殼70轉(zhuǎn)病毒CP基因番木瓜CKTrans轉(zhuǎn)病毒CP基因番木瓜CKTrans71fireblight抗性:1000haapplewerekilledbyFBinMichiganin2000.Lyticprotein(LP)：RoyalGala,Galaxy和M26轉(zhuǎn)avianLP’sSB-37,T-4lysozyme：Gala轉(zhuǎn)harpin（來于Fireblight細菌）NPR1蛋白：過量表達SilencingtheDIPMkinasewhichisrelatedtotheoccurrenceofthedisease.實例：蘋果fireblight抗性:1000haapp72轉(zhuǎn)attacinLP基因的RoyalGala4年田間試驗表明：抗性增強，果實品質(zhì)正常。轉(zhuǎn)attacinLP基因的RoyalGala4年田間試驗73轉(zhuǎn)attacin基因的蘋果抗fireblight轉(zhuǎn)attacin基因的蘋果抗fireblight74轉(zhuǎn)avianlysozyme基因的RoyalGala轉(zhuǎn)avianlysozyme基因的RoyalGala75轉(zhuǎn)Harpin基因的蘋果與對比轉(zhuǎn)Harpin基因的蘋果與對比76抗感fireblight蘋果的比較抗感fireblight蘋果的比較77抗fireblight病的轉(zhuǎn)基因蘋果抗fireblight病的轉(zhuǎn)基因蘋果78提高抗蟲能力

蘇云金芽孢桿菌（Bt)制劑產(chǎn)生的原毒素－伴孢晶體毒蛋白（δ內(nèi)毒素），可在昆蟲幼蟲中腸道的水解酶作用下，轉(zhuǎn)化成小分子的毒素多肽，而對多種昆蟲有很強的毒殺作用。導(dǎo)入Bt毒蛋白基因提高抗蟲能力蘇云金芽孢桿菌（Bt)制劑產(chǎn)生的原79

Hinder等將編碼豇豆胰蛋白酶抑制物（CpTI)的基因轉(zhuǎn)移到煙草中，明顯增強了轉(zhuǎn)基因煙草對煙草夜蛾幼蟲的抗性。

如將蜘蛛殺蟲肽基因?qū)霟煵荩D(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出對棉鈴蟲有較強的抗性。利用一些昆蟲毒素基因?qū)氲鞍酌敢种苿〩inder等將編碼豇豆胰蛋白酶抑制物（Cp80改善抗逆性

如：甜菜堿醛脫氫酶（BADH)基因?qū)霟煵荨⒉葺退竞?，轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性明顯提高。向植物中導(dǎo)入熱休克基因，可提高其抗熱性將深海魚美洲擬鰈的抗凍基因通過柱頭導(dǎo)入番茄，獲得可耐受-4∽-5℃低溫的轉(zhuǎn)基因番茄。導(dǎo)入與脯氨酸或甜菜堿合成有關(guān)的酶的基因改善抗逆性如：甜菜堿醛脫氫酶（BADH)基因?qū)霟煵?、?1轉(zhuǎn)基因煙草的光合特性1℃處理4h，27℃測定光合作用，低溫導(dǎo)致的光合作用下降率為：轉(zhuǎn)擬南芥菜的為7％，轉(zhuǎn)南瓜的為88％，對照的為25％。轉(zhuǎn)基因煙草的光合特性1℃處理4h，27℃測定光82轉(zhuǎn)基因植株的脂肪酸的構(gòu)成轉(zhuǎn)入抗寒性強的擬南芥菜的基因，其不飽和脂肪酸的含量顯著增加轉(zhuǎn)入抗寒性弱的南瓜的基因，其飽和脂肪酸的含量顯著增加轉(zhuǎn)基因植株的脂肪酸的構(gòu)成轉(zhuǎn)入抗寒性強的擬南芥菜的基因，其不飽83轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性轉(zhuǎn)基因煙草在1℃下處理10d，25℃栽培2d，前者無黃化，后者有黃化。a.野生型；b.對照pBI121；c.南瓜；d.擬南芥菜轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性轉(zhuǎn)基因煙草在1℃下處理10d，25℃栽84

選育抗除草劑品種把除草劑作用的靶酶或靶蛋白質(zhì)的基因?qū)胫参?/p>

現(xiàn)已在矮牽牛、煙草、番茄、馬鈴薯、大豆、油菜、楊樹等植物上獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株。

轉(zhuǎn)移一種能以除草劑為底物的酶的基因

如bar基因編碼PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)入煙草，番茄和馬鈴薯等植物后，使作物獲得抗除草劑PPT的能力選育抗除草劑品種把除草劑作用的靶酶或靶蛋白質(zhì)的基因?qū)胫参?5

延遲成熟與保鮮改變果實細胞壁降解酶活性抑制成熟激素乙烯的生成

美國Calgene公司以將反義PGcDNA導(dǎo)入到番茄中，育成“FLAVRSAVE”轉(zhuǎn)基因品種，并已上市葉志彪等利用ACC氧化酶反義基因轉(zhuǎn)入番茄，抑制ACC合成酶的表達活性，抑制乙烯的合成，育成耐貯藏的轉(zhuǎn)基因番茄。延遲成熟與保鮮改變果實細胞壁降解酶活性86蘋果乙烯形成的沉默實例蘋果乙烯形成的沉默實例87對照轉(zhuǎn)基因蘋果乙烯生成減少70%需更長時間軟化硬度：高于CK比CK耐貯藏

轉(zhuǎn)基因蘋果對照轉(zhuǎn)基因蘋果轉(zhuǎn)基因蘋果88轉(zhuǎn)基因與對照蘋果室溫貯存

3個月

轉(zhuǎn)基因與對照蘋果室溫貯存89

提高產(chǎn)量☆提高光合作用效率和固氮效率☆克隆與雜種優(yōu)勢相關(guān)的植物雄性不育有關(guān)的基因

目前已克隆出許多種參與光合作用的基因和導(dǎo)致植物雄性不育的基因

Worral等報道用編碼?-1,3葡聚糖水解酶基因轉(zhuǎn)化煙草、矮牽牛獲得雄性不育植株提高產(chǎn)量☆提高光合作用效率和固氮效率90

改良品質(zhì)

☆將人工合成的富含必須氨基酸的DNA片段導(dǎo)入馬鈴薯，能有效地改善馬鈴薯貯藏蛋白的氨基酸成分。

☆通過導(dǎo)入淀粉粒結(jié)合的淀粉合成酶的反義RNA基因，可改變馬鈴薯支鏈淀粉和直鏈淀粉的比例。改良品質(zhì)☆將人工合成的富含必須氨基酸的DNA片段導(dǎo)入91☆陳章良將Chs的反義基因轉(zhuǎn)入矮牽牛中，導(dǎo)致Chs的mRNA水平以及Chs的酶活性都大大降低，可改變矮牽牛的顏色。☆異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)導(dǎo)入番茄可使果實可溶性固形物含量顯著增加?！铌愓铝紝hs的反義基因轉(zhuǎn)入矮牽牛中，導(dǎo)致Chs的mR92MdTFL（抑制芽分生組織identity基因）：蘋果頂端分生組織從營養(yǎng)期向生殖期的轉(zhuǎn)變

提前開花結(jié)實實例：蘋果早花早實MdTFL（抑制芽分生組織identity基因）：蘋果頂端分93嫁接后8個月嫁接后8個月94早花蘋果的花和果實早花蘋果的花和果實95轉(zhuǎn)Leafy基因楊樹早花轉(zhuǎn)Leafy基因楊樹早花96三、轉(zhuǎn)基因植株的篩選方法：形態(tài)學(xué)鑒定直接選擇法間接選擇法同工酶測定分子標記三、轉(zhuǎn)基因植株的篩選方法：97第七節(jié)分子標記與育種

Molecularmarker&breeding第七節(jié)分子標記與育種

Molecularmarker&98形態(tài)標記（morphologicalmarkers）細胞學(xué)標記（cytologicalmarkers）生化標記（biochemicalmarkers）分子標記（molecularmarkers）遺傳標記的種類遺傳標記（geneticmarkers）：鑒別基因組中基因位點(site)的手段，是易于識別且可遺傳的實體。種類：形態(tài)標記（morphologicalmarkers）遺傳標99形態(tài)標記形態(tài)標記：指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的外觀性狀，如株高、果形、花色、葉形、花瓣數(shù)多少、核有無或抗逆性、抗病性等。特點：簡單直觀，長期以來，作物種質(zhì)資源鑒定及育種材料的選擇一般都是根據(jù)形態(tài)標記進行的，但是形態(tài)標記數(shù)目少，多態(tài)性差，易受環(huán)境因素的影響。應(yīng)用實例：園藝植物品種識別枳在柑桔原生質(zhì)體融合中的應(yīng)用形態(tài)標記形態(tài)標記：指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的外觀性狀，如100細胞學(xué)標記細胞學(xué)標記：染色體的結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征是常見的細胞學(xué)標記，它們分別反映了染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。染色體結(jié)構(gòu)特征包括染色體的核型(染色體相對長度、臂指數(shù)、著絲粒指數(shù)、染色體臂數(shù)等)和帶型(Constitutiveheterochrom-ativebanding帶、Necleolarorganizerregionbanding帶、Giemsabanding帶等)。特點：可明確鑒定許多物種中任一染色體。操作復(fù)雜，信息量小。應(yīng)用實例：

資源分類與品種鑒別多倍體親緣關(guān)系與系統(tǒng)進化染色體組分析評價親緣關(guān)系原位雜交進行基因物理定位細胞學(xué)標記細胞學(xué)標記：染色體的結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征是常見的細胞101生化標記同工酶同工酶：指有同一底物專一性，催化同一化學(xué)反應(yīng)，結(jié)構(gòu)、組成不同的一類酶?；驹硎歉鶕?jù)電荷性質(zhì)的差異，通過蛋白質(zhì)電泳或色譜技術(shù)和專門染色反應(yīng)顯示出同工酶的不同形式，從而鑒別不同的基因型。特點：受環(huán)境因素影響小，呈共顯性，在分離世代中能反映各單株的基因型，檢測相對簡單快速，在種子和幼苗期就可以鑒定，費用不高。具有組織、發(fā)育和物種特異性。應(yīng)用實例：

品種質(zhì)量和純度鑒定遺傳多樣性研究生化標記同工酶同工酶：指有同一底物專一性，催化同一化學(xué)反應(yīng)，102分子標記分子標記：以直接檢測DNA堿基序列的差異為基礎(chǔ)的遺傳標記，又叫DNA分子標記。特點：數(shù)量多，遍布整個基因組；標記本身無害，很少與不良性狀連鎖；標記不需要基因表達，可用個體的任何材料進行檢測，不受環(huán)境條件的限制；多態(tài)性高，自然界存在著許多等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；有許多分子標記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息。多以DNA片段電泳譜帶形式表現(xiàn)。應(yīng)用：

種質(zhì)資源研究輔助育種功能基因組研究基因克隆分子標記分子標記：以直接檢測DNA堿基序列的差異為基礎(chǔ)的遺傳103RFLPRAPDSAPMacrosateliteMinisateliteAFLP遺傳特性共顯性顯性顯性/共顯性顯性共顯性顯性/共顯性多態(tài)性水平低中等低高高高可檢測座位數(shù)1～41～101幾十～100幾十100～200檢測基礎(chǔ)分子雜交隨機PCR專一PCR專一PCR分子雜交專一PCR檢測基因組部位單/低拷貝區(qū)整個基因組整個基因組重復(fù)序列區(qū)重復(fù)序列區(qū)整個基因組使用技術(shù)難度難易易易難易DNA質(zhì)量要求5～10ug<50ng<50ng50ng5~10ug<50ng是否使用測位數(shù)是否否否是否探針DNA短片斷隨機引物專一性引物專一性引物DNA短片斷專一性引物費用中等低高高中等高注：引自錢贏榮，鄭康樂。生物工程進展，1998，（3）：12幾種常用分子標記方法比較RFLPRAPDSAPMacrosateliteMinisa104RAPD標記鑒定5101100670bp75025050020001000bp1234567891011121314RAPD標記鑒定5101100670bp75025050105分子標記在園藝植物育種的應(yīng)用構(gòu)建遺傳圖譜分析親緣關(guān)系定位農(nóng)藝性狀分子標記輔助選擇種質(zhì)資源及雜種后代的鑒定分子標記在園藝植物育種的應(yīng)用構(gòu)建遺傳圖譜106復(fù)習(xí)題基本概念：生物技術(shù)、組織培養(yǎng)、外植體、體細胞雜交、體細胞無性系變異、基因工程、分子標記簡述各項生物技術(shù)方法在園藝植物育種中的主要應(yīng)用。復(fù)習(xí)題基本概念：生物技術(shù)、組織培養(yǎng)、外植體、體細胞雜交、體細107生物技術(shù)(Biotechnology):以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種或新品系，以及與工程原理相結(jié)合進行加工生產(chǎn)，為社會提供商品和服務(wù)的一個綜合性技術(shù)體系。生物技術(shù)是在分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代工程學(xué)的方法和原理而發(fā)展起來的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。生物技術(shù)(Biotechnology):以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利108第一節(jié)組織與器官培養(yǎng)第二節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)第四節(jié)體細胞雜交第五節(jié)植物細胞突變體的離體篩選第六節(jié)基因工程與育種第七節(jié)分子標記與育種主要內(nèi)容：第一節(jié)組織與器官培養(yǎng)第二節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)第三節(jié)原生質(zhì)體109植物組織培養(yǎng)

（PlantTissueCulture）將植物離體器官、組織或細胞等外植體，在適宜的人工培養(yǎng)基和無菌條件下，給予光照、溫度等環(huán)境條件并培養(yǎng)，使其生長、增殖、發(fā)育形成小植株的方法。狹義的組織培養(yǎng)僅指愈傷組織培養(yǎng)，廣義的組織培養(yǎng)指各種類型的植物無菌培養(yǎng)技術(shù)。組織培養(yǎng)概念多指廣義上的組織培養(yǎng)技術(shù)，包括胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)(愈傷組織培養(yǎng))、細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等。植物組織培養(yǎng)

（PlantTissueCulture）將110植物特殊倍性創(chuàng)造植物組織培養(yǎng)培育植物新品種種苗脫毒與快速繁殖體細胞雜交次生產(chǎn)物生產(chǎn)基礎(chǔ)研究植物特殊植物培育植物種苗脫毒與體細胞雜交次生產(chǎn)物基礎(chǔ)研究111第一節(jié)組織與器官培養(yǎng)組織與器官培養(yǎng)的類別組織與器官培養(yǎng)的應(yīng)用第一節(jié)組織與器官培養(yǎng)組織與器官培養(yǎng)的類別組織與器官培養(yǎng)的112莖尖和分生組織培養(yǎng)胚培養(yǎng)胚珠和子房培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)離體葉的培養(yǎng)組織與器官培養(yǎng)

(tissueandorganculture):莖尖和分生組織培養(yǎng)組織與器官培養(yǎng)

(tissueando113相關(guān)專業(yè)術(shù)語細胞全能性(totipotency):一個細胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有能力。外植體(explant):用于培養(yǎng)的離體材料。愈傷組織(callus):在培養(yǎng)過程中，從植物各種器官、組織的外植體增殖而形成的一種無特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞團。胚狀體(embryoid):由外植體或愈傷組織產(chǎn)生的,與正常受精發(fā)育方式類似的胚胎結(jié)構(gòu)。繼代培養(yǎng)(subculture)：對外植體增殖的培養(yǎng)物(包括細胞、組織或其切段)通過更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分離，進行連續(xù)多代培養(yǎng)。相關(guān)專業(yè)術(shù)語細胞全能性(totipotency):一個細胞114組織和器官培養(yǎng)全過程可分四個階段:無菌培養(yǎng)物的建立營養(yǎng)繁殖體的增殖生根植株移栽各個階段在培養(yǎng)基,生長調(diào)節(jié)劑的配比和濃度,培養(yǎng)方式和環(huán)境上都不同的要求.組織和器官培養(yǎng)全過程可分四個階段:無菌培養(yǎng)物的建立營養(yǎng)繁殖體115組織和器官培養(yǎng)在育種中的作用加快園藝植物新品種和良種繁殖速度培養(yǎng)無病毒苗木誘發(fā)和離體篩選突變體進行種質(zhì)資源長期保存和遠距離運輸獲得倍性不同的植株克服種子發(fā)育和萌發(fā)中的障礙克服遠源雜交困難提供育種中間材料組織和器官培養(yǎng)在育種中的作用加快園藝植物新品種和良種繁殖速度116第二節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)第二節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)117花藥培養(yǎng)：其外植體為植物雄性生殖器官的一部分，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講，屬于器官培養(yǎng)的范疇?；ǚ叟囵B(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離，再加以離體培養(yǎng)。有時花粉培養(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)(microsporeculture)。從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面來講，它屬于細胞培養(yǎng)的范疇?；ㄋ幣囵B(yǎng)：其外植體為植物雄性生殖器官的一部分，就培養(yǎng)方法和技118花藥培養(yǎng)的基本程序外植體選擇→外植體(花蕾)預(yù)處理→外植體消毒→剝?nèi)』ㄋ帯臃N→誘導(dǎo)培養(yǎng)→分化培養(yǎng)花藥培養(yǎng)的基本程序119

在離體培養(yǎng)條件下要使花藥中的花粉改變其正常發(fā)育方向而形成單倍體植株，需要各種因素共同調(diào)節(jié)和控制。

外因：培養(yǎng)基的成分，外源激素的種類，糖的濃度

內(nèi)因：主要決定于花藥中花粉發(fā)育時期在離體培養(yǎng)條件下要使花藥中的花粉改變其正120培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基：MS（Murashigc&Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborgetal.，1976)。附加成分：蔗糖,激素。培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基：121花藥培養(yǎng)常用的激素細胞分裂素類：

BA—6-benzyladeninKT—kinetinZeatin

生長素類：

NAA—naphthaleneaceticacidIAA—indole-3-aceticacid2,4-D—2,4-dichlorophenoxyaceticacid花藥培養(yǎng)常用的激素122蔗糖:蔗糖在花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的功能主要是：提供C源；維持適宜的滲透壓；抑制花藥壁的分裂而促進花粉細胞分裂。

番茄花藥培養(yǎng)對蔗糖濃度的誘導(dǎo)反應(yīng)

蔗糖濃度（％）2346101317

誘導(dǎo)頻率（％）510121825458蔗糖:蔗糖在花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的功能主要是：提供C源；維持適宜123花粉發(fā)育時期四分體→小孢子→

單核花粉→雙核花粉最適期花粉發(fā)育時期124花粉及小孢子培養(yǎng)1．取材時期的確定

四分體—單核早期—單核晚期—雙核早期—雙核晚期—三核期小孢子花粉?；ǚ奂靶℃咦优囵B(yǎng)1．取材時期的確定小孢子花粉粒125花藥培養(yǎng)與小孢子培養(yǎng)的目的一樣，為獲得單倍體。單倍體(haploid):指具有配子體染色體數(shù)的孢子體(植物個體)。

diploid植物，其haploid即為monoploid

玉米2n=2x=20n=x=10

柑橘2n=2x=18n=x=9tetraploid植物，其haploid為dihaploid

馬鈴薯2n=4x=48n=2x=24hexaploid植物，其haploid為triploid

普通小麥2n=6x=42n=3x=21octoploid植物，其haploid為tetraploid

草莓2n=8x=56n=4x=28花藥培養(yǎng)與小孢子培養(yǎng)的目的一樣，為獲得單倍體。單倍體(hap126單倍體在育種中有特殊的地位，其作用表現(xiàn)在加倍后可迅速獲得純合型材料，縮短育種年限。獲得育種中間材料。與誘變育種相結(jié)合可以提高誘變頻率。與細胞融合相結(jié)合，使這一育種途徑更具有實際應(yīng)用意義，無籽三倍體。作為遺傳工程受體更為有效。用于基礎(chǔ)遺傳研究的各個領(lǐng)域

。獲得超雄植株（YY)?？色@得異源體附加系、代換系和易位系。單倍體在育種中有特殊的地位，其作用表現(xiàn)在加倍后可迅速獲得純合127第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交的步驟原生質(zhì)體培養(yǎng)（Protoplastculture）體細胞雜交（Somatichybridization）原生質(zhì)體融合（Protoplastfusion）第三節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交的步驟128一.原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細胞壁的細胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍的裸露細胞。

亞原生質(zhì)體(subprotoplast)：在原生質(zhì)體分離過程中，有時會引起細胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。它可以具有細胞核或沒有細胞核。

核質(zhì)體(nuclearplast)：由原生質(zhì)膜和薄層細胞質(zhì)包圍細胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體(miniprotoplast)。

胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細胞核而僅含有部分細胞質(zhì)的原生質(zhì)體。一.原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細129二.原生質(zhì)體的分離基礎(chǔ)材料準備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體活力測定原生質(zhì)體收集與純化二.原生質(zhì)體的分離基礎(chǔ)材料準備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體活力測定原1301.分離原生質(zhì)體材料的準備無菌試管苗葉片上胚軸和子葉

培養(yǎng)細胞1.分離原生質(zhì)體材料的準備無菌試管苗葉片1312.預(yù)處理及酶解酶酶解滲透壓調(diào)節(jié)劑2.預(yù)處理及酶解酶酶解滲透壓132材料預(yù)處理在游離原生質(zhì)體前對供體材料進行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可以提高某些材料原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。例如龍膽試管苗的葉片只有用4℃低溫處理，甘蔗植株必須先在黑暗條件下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂。材料預(yù)處理133原生質(zhì)體分離常用的商品酶

酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類onozukaR–10綠色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin綠色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果膠酶類MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纖維素酶RhozymeHP-150黑曲酶RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USA原生質(zhì)體分離常用的商品酶酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類134酶溶劑及其滲透壓

溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶溶劑及其滲透壓135酶處理

酶解溫度酶濃度酶解時間酶處理酶解溫136l3、原生質(zhì)體的分離純化l3、原生質(zhì)體的分離純化137原生質(zhì)體的收集和純化飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：常用甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，先將酶液洗出干凈，再用Percoll飄浮一次。

原生質(zhì)體的收集和純化飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percol1384.原生質(zhì)體活力測定目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、流動性確定原生質(zhì)體活力。

FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細胞質(zhì)膜，在活細胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細胞的觀察確定細胞活性。伊凡藍法：伊凡藍不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴重損壞，細胞才能被染色，因而可以通過細胞被染色與否確定活性。4.原生質(zhì)體活力測定目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、流139

FDA熒光染色法(雙醋酸熒光素)

在熒光顯微鏡下，有活力的原生質(zhì)發(fā)熒光，無活力的不發(fā)熒光。生活力測定：FDA熒光染色法(雙醋酸熒光素)生活力測定：140影響原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)

酶解條件酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓分離條件離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時間環(huán)境條件操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響

影響原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)

141三、原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)方法三、原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)方法1421.原生質(zhì)體培養(yǎng)基無機鹽大量元素濃度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+濃度有機成分

維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。1.原生質(zhì)體培養(yǎng)基無機鹽1432、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)固-液體雙層培養(yǎng)瓊脂糖珠培養(yǎng)2、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)144

原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)145柑桔融合實例柑桔融合實例146生物技術(shù)在園藝植物育種中的應(yīng)用課件147第四節(jié)體細胞雜交定義：將兩個不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)融合并培養(yǎng)再生成株的過程，統(tǒng)稱為體細胞雜交（A+B）幾種不同的表述：體細胞雜交：Somatichybridization

細胞融合：Cellfusion

原生質(zhì)體融合：Protoplastfusion

無性雜交：asexualhybridization

超性雜交：Parasexualhybridization

超性融合：Parasexualfusion

細胞工程：Cellengineering第四節(jié)體細胞雜交定義：將兩個不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)148植物細胞雜交的幾個重要進展

1960年，Kocking用酶法制備高等植物原生質(zhì)體首次獲得成功；1971年，Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株；1972年，Carlson首次獲得粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜種，這是第一個植物細胞雜種；1974年，Kao將聚乙二醇誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細胞融合并建立了相應(yīng)的融合技術(shù)；1978年，Melchers獲得第1個屬間細胞雜種（番茄＋馬鈴薯）；1981年，Zimmerman發(fā)明電融合儀，并首次提出電融合概念；1987年，Schweiger建立單對原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。植物細胞雜交的幾個重要進展149體細胞雜交與有性雜交的異同比較內(nèi)容體細胞雜交有性雜交時間無季節(jié)限制花期限制，特別是母本的花期親緣關(guān)系一定程度上可以克服有性/嫁接不親和性受親和性影響結(jié)果細胞核、細胞質(zhì)均可以重組、倍性增加雙受精，一般無細胞質(zhì)重組，倍性不改變體細胞雜交與有性雜交的異同比較內(nèi)容體細胞雜交有性雜交時間無季150+體細胞雜交有性雜交+體細胞雜交有性雜交151原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-I對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質(zhì)均為100%）非對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質(zhì)不等（相對值）胞質(zhì)雜種（cytoplasmichybrid,Cybrid）：細胞質(zhì)重組，細胞核未重組對稱融合（symmetricfusion）也稱標準融合（Standardfusion）非對稱融合（asymmetricfusion）：融合前對一方進行處理，使其染色體丟失一部分原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-I對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質(zhì)152原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-II供-受體融合：Donor-recipientfusion體配融合（gameto-somaticfusion）（性細胞與體細胞融合）亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合：

Subprotoplast-protoplastfusion

小原生質(zhì)體：Miniprotoplast

微原生質(zhì)體：Microprotoplast

胞質(zhì)體：Cytoplast胞質(zhì)體-原生質(zhì)體融合:Cytoplast-protoplastfusion原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-II供-受體融合：Donor-rec153原生質(zhì)體融合的方式化學(xué)方法：聚乙二醇法

Polyethyleneglycol（PEG），與高pH高Ca結(jié)合使用物理方法：電融合法

Electrofusion,Electricallyinducedfusion原生質(zhì)體融合的方式化學(xué)方法：聚乙二醇法154

理論上，任何細胞都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源，這對種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。理論上，任何細胞都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源，155體細胞雜交的程序及方法原生質(zhì)體融合雜種細胞篩選方法：PEG，電融合，NaNO3營養(yǎng)互補選擇法，遺傳互補選擇法，機械選擇法，形態(tài)學(xué)方法細胞學(xué)方法同工酶方法分子標記法體細胞雜種植株的鑒定體細胞雜交的程序及方法原生質(zhì)體融合雜種細胞篩選方法：PEG，156親本A親本B原生質(zhì)體聚合融合處理分離的原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合融合體移植雜種融合體篩選雜種融合體移栽至不同的培養(yǎng)基體細胞雜交篩選親本A親本B原生質(zhì)體聚合融合處理分離的原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合融157原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交的應(yīng)用獲得新品種；創(chuàng)造新種質(zhì)；轉(zhuǎn)移有利性狀和克服遠源雜交的障礙；作為基因工程的良好受體及進行突變體篩選的優(yōu)良原始材料。原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交的應(yīng)用獲得新品種；158第五節(jié)植物細胞突變體的離體篩選

在離體培養(yǎng)條件下，誘發(fā)突變的突變型和自發(fā)突變沒有本質(zhì)上的差別。一般都在三個水平上發(fā)生：基因組突變：染色體數(shù)目的改變或細胞質(zhì)基因組的增減；染色體突變：染色體較大范圍的結(jié)構(gòu)變化，涉及多個基因；基因突變：指范圍在一個基因以內(nèi)分子結(jié)構(gòu)的改變。按DNA改變方式有堿基置換突變，移碼突變，缺失突變和插入突變。體細胞無性系變異：Somaclonalvariation一、突變體的產(chǎn)生第五節(jié)植物細胞突變體的離體篩選一、突變159二、突變細胞的篩選方法直接選擇法

正選擇/負選擇間接選擇法二、突變細胞的篩選方法直接選擇法間接選擇法160正選擇用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上只有突變細胞能夠生長，非突變細胞不能生長，從而直接篩選出突變體。如抗除草劑、抗鹽堿突變體的篩選，均可直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度的除草劑或增加滲透壓的物質(zhì)。目前采用這一途徑，已從多種植物中篩選出可利用的體細胞變異體。賈敬芬等以小麥幼胚愈傷組織為材料，在含有1.4％NaCl的N6培養(yǎng)基上直接篩選出小麥耐鹽系。分析顯示，耐鹽系游離氨基酸含量是供體親本的4.1倍。鄭企成等也曾將小麥“京花1號”花藥經(jīng)γ射線處理后，再經(jīng)0.5％NaCl培養(yǎng)基直接篩選獲得耐鹽再生株系。李愛賢等以甘薯“栗子香”為材料誘導(dǎo)胚性細胞系，從900個通過γ射線輻射的細胞團中，在含有2.0％NaCl的培養(yǎng)基中進行篩選，獲得22個抗鹽愈傷組織，并獲得20個抗鹽再生植株。正選擇用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上只有突變細161負選擇一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標的篩選方法。Dorffling等以Pro類似物羥脯氨酸（HYP）為選擇劑，獲得了耐HYP的體細胞變異系，其抗寒性比供體親本增強，且能穩(wěn)定遺傳。林定波等將錦橙株心細胞愈傷組織的懸浮細胞經(jīng)γ射線照射，然后在高濃度脯氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選，獲得了抗寒體細胞變異愈傷組織，并再生植株。鑒定顯示，抗寒愈傷組織及其再生植株的抗寒性分別比供體提高1.4℃和2.4℃，突變系體內(nèi)的Pro含量比供體增加了一倍。

負選擇一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標的篩選方法162三、突變性狀遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定遺傳基礎(chǔ)穩(wěn)定性三、突變性狀遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定遺傳基礎(chǔ)穩(wěn)定性163突變性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ)體細胞變異，除發(fā)生在染色體水平外，更多的是基因水平上的變異。從利用體細胞變異的角度，染色體變異大多是一些畸形變異，真正可利用的染色體變異十分有限?；蛩缴系淖儺愒诒硇蜕洗蠖嘀皇莻€別性狀的改變，不會影響再生植株的正常生長發(fā)育。因此，從再生植株的這些變異中有可能篩選有益的變異?；蛩缴系淖儺?，從根本上講是DNA的堿基突變或修飾狀態(tài)的改變。

突變性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ)體細胞變異，除發(fā)生在染色體水平外，更多的164突變性狀的穩(wěn)定性對于單基因控制的遺傳性狀，大多數(shù)堿基突變可以穩(wěn)定遺傳而且符合孟德爾遺傳分離規(guī)律，這一點已在水稻、煙草和玉米的體細胞變異中得以證實。Brettell等從645株玉米雜種胚培養(yǎng)再生植株中，發(fā)現(xiàn)了一個穩(wěn)定突變體Adh1（乙醇脫氫酶突變體），克隆基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因第七外顯子中一個編碼谷氨酸的GAG中的A轉(zhuǎn)換成為了T，使翻譯肽鏈中的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸。植物的許多性狀特別是經(jīng)濟性狀均由多基因控制，對于多基因控制性狀的堿基突變可能由于技術(shù)上的復(fù)雜性，目前還沒有關(guān)于多基因控制性狀的堿基突變報道。突變性狀的穩(wěn)定性對于單基因控制的遺傳性狀，大多數(shù)堿基突變可以165GeneticEngineeringandBreeding第六節(jié)基因工程與育種Gene