儀器分析-第四章-熒光光譜

第四章分子發(fā)光（熒光及磷光）分子熒光:Fluorescence分子磷光:Phosphorescence第一節(jié)分子熒光和磷光分析的基本原理一、熒光(Fluorescence)的發(fā)現(xiàn)當(dāng)紫外線照射到某些物質(zhì)時，這些物質(zhì)會發(fā)射各種顏色和不同強度的可見光，而當(dāng)外光源停止照射時，所發(fā)射的光線隨之消失，這種光線稱之為熒光。1757年西班牙醫(yī)生及植物學(xué)家N.Monardes第一次記錄熒光現(xiàn)象。但此后進展緩慢。１８５２年Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)在吸收光能后能重新發(fā)射不同波長的光，從而引入了熒光是光發(fā)射的概念。他是第一個提出熒光作為分析手段的人。1867年，Goppelsroder首次利用鋁-桑色素配合物的熒光對鋁進行測定，首次熒光分析工作19世紀以前，熒光的觀察是靠肉眼進行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺熒光計二、分子熒光的發(fā)生(產(chǎn)生）過程（一）分子能級與電子能級的多重性

1、分子能級的躍遷（1）每個分子具有嚴格分立的電子能級（其中包括振動及轉(zhuǎn)動能級）（2）基態(tài)分子吸收了特征頻率能量之后，從低能級向高能級躍遷，即處于不同的激發(fā)態(tài)。hνE0E1ΔE=

E1-E02、分子的激發(fā)態(tài)①基態(tài)時，電子在各原子或分子軌道中成對存在，即某一給定的軌道中兩個電子自旋配對。②所有的電子自旋配對的分子電子態(tài)稱為基態(tài)單重態(tài)（S0）。③處于S0配對電子中，某一個電子受激躍遷到高能級，自旋不變，稱為激發(fā)單重態(tài)（S1,S2,S3

）④如果S0配對電子中，某一個電子受激躍遷到高能級，自旋方向改變，稱為激發(fā)三重態(tài)（T1,T2….）10-8s10-4~1sS0S*允許躍遷S0T*禁阻躍遷電子的自旋多重態(tài)(光譜項多重性)：M=2S+1激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和非輻射躍遷等方式失去能量輻射躍遷無輻射躍遷熒光磷光能量傳遞途徑系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移振動弛預(yù)激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大；（二）熒光和磷光的產(chǎn)生非輻射能量傳遞方式

振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)電子能級中，等能級的兩個電子態(tài)間

的無輻射能級交換。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而

轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫BACK1BACK2輻射能量傳遞過程熒光(Fluorescence)發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷）。產(chǎn)生過程：S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)換→振動弛豫→發(fā)射熒光（S1→S0）發(fā)射波長為2’的熒光；10-7～10-9s。

由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；2’>2

>1磷光發(fā)射(Phosphorescence)：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）；

電子由S0進入T1的過程S0→T1

是禁阻躍遷，因此發(fā)生T1→

S0

躍遷也比較難，需要經(jīng)歷如下過程：

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1

發(fā)光速度很慢：10-4～100s。

光照停止后，可持續(xù)一段時間。三．分子發(fā)光的類型按照提供激發(fā)能的方式：光致發(fā)光；化學(xué)發(fā)光；生物發(fā)光（特殊類型的化學(xué)發(fā)光）熒光在電磁輻射中所處的波段范圍：X射線熒光；紫外熒光；可見熒光；紅外熒光第二節(jié)熒光光譜的類型（熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜）１.熒光(磷光)的激發(fā)光譜

固定發(fā)射波長,化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射（激發(fā)）光波長的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大（選擇最佳激發(fā)波長）２．熒光(磷光)的發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長，化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。（選擇最佳發(fā)射波長熒光和磷光屬于光致發(fā)光，因此涉及兩種輻射躍遷過程，因此任何有熒光的分子都具有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜兩個特征光譜３．激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間有波長的差異。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，稱為Stokes位移

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2

,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如2’)。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的激發(fā)光譜形狀一樣，成鏡像對稱關(guān)系。鏡像規(guī)則的解釋基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的第二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。第三節(jié)熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系一.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件2.具有合適的結(jié)構(gòu)強熒光的有機化合物結(jié)構(gòu)通常具備以下特征:①具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)；②具有剛性的平面結(jié)構(gòu)；③具有最低的單重電子激發(fā)態(tài)為S1為π*

→π型；④取代基團為給電子取代基。1.具有一定的熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)相關(guān)熒光壽命：τ=1/kf激發(fā)光切斷后，熒光強度衰減到原強度的1/e所經(jīng)歷的時間共軛效應(yīng)產(chǎn)生熒光的有機物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於∈∥焓ˇ薳xmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，有利于熒光發(fā)射。剛性平面結(jié)構(gòu)芴聯(lián)苯F=1F=0.2不產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光F=0.92萘VAF(萘)=5F(VA)

熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯1）給電子取代劑加強熒光取代基效應(yīng)—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生p→π共軛二苯甲酮：弱熒光、強磷光S1→T1的系間竄躍產(chǎn)率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax

(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相對熒光強度10182020202）得電子取代基減弱熒光、加強磷光—C=0，—COOH，—NO2不產(chǎn)生p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光、弱磷光空間位阻對熒光發(fā)射的影響取代基的位置反式二苯乙烯強熒光物質(zhì)F=0.75F=0.03立體異構(gòu)體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質(zhì)含有重原子的溶劑，由于重原子效應(yīng)熒光減弱、磷光增強。重原子取代基效應(yīng)—Cl，—Br，—IS1→T1的系間竄躍由于重原子的存在增強化合物萘1-甲基萘1-氟萘1-氯萘1-溴萘1-碘萘λFmax(nm)315318316319320~λPmax

(nm)470476473483484488P/F0.0930.0530.0685.26.4>1000τ

F(s)2.62.51.40.230.0140.0023二影響熒光強度的因素1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；溶劑極性增大，熒光光譜紅移．熒光強度減弱。2.溫度的影響

熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。熒光量子產(chǎn)率下降．熒光強度減弱。3.溶液pH

對具有有酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制４．內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收熒光的組分．使熒光分子的熒光強度減弱（如重鉻酸鉀正好吸收色氨酸的激發(fā)和發(fā)射光，使得色氨酸熒光強度顯著下降）５．自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。（濃度越大，影響越大）１－萘酚－６－磺酸

無熒光

藍色熒光α－萘胺

藍色熒光

無熒光pH5~12;分子狀態(tài)，有熒光pH<5或>12；陽離子或陰離子無熒光６．熒光淬滅熒光物質(zhì)分子與溶劑或溶質(zhì)分子之間相互作用，導(dǎo)致熒光強度下降的現(xiàn)象稱為熒光淬滅．與熒光物質(zhì)分子相互作用而引起熒光強度下降的物質(zhì)，稱為熒光淬滅劑．動態(tài)淬滅：激發(fā)態(tài)熒光分子與淬滅劑分子相互碰撞失去能量，無輻射回到基態(tài)．靜態(tài)淬滅：熒光分子與淬滅劑分子相互作用生成不能產(chǎn)生熒光的絡(luò)合物．電荷轉(zhuǎn)移淬滅：淬滅劑與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而引起的，指激發(fā)態(tài)分子是比基態(tài)分子更強的電子受體或電子供體.更容易與其他物質(zhì)發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移N’N’-二甲基苯胺N,N’-二乙基苯胺光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移:PET(Photo-inducedElectronTransfer)H+熒光分子開關(guān)on-off分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT)

推電子基團、吸電子基團通過p電子體系連接推電子基團、吸電子基團通過p電子體系連接推電子基團、吸電子基團通過π電子體系連接而成能量轉(zhuǎn)移淬滅（輻射能量轉(zhuǎn)移和非輻射能量轉(zhuǎn)移）輻射轉(zhuǎn)移淬滅:熒光分子發(fā)射的熒光被淬滅劑吸收.取決于光譜重疊的程度.共振能量轉(zhuǎn)移（FRET):只要供體分子的基態(tài)和第一激發(fā)態(tài)兩者的振動能級差相當(dāng)于受體分子的基態(tài)和第一激發(fā)態(tài)能級間的能量差,在此情況下,可發(fā)生供體到受體的非輻射能量轉(zhuǎn)移.是通過耦極-耦極的偶合作用產(chǎn)生的，是長距離的能量轉(zhuǎn)移。苯丙氨酸（282nm)酪氨酸（303nm）色氨酸（348nm)一.主要組成及部件的功能熒光分光光度計工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計有何異同點？光路，樣品池第四節(jié)熒光分析法和應(yīng)用特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角二、熒光分析與應(yīng)用１．特點：（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；為什么？（在黑背景下）檢測下限：0.1～0.1g/cm-3

（2）選擇性強既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少缺點：應(yīng)用范圍小。（物質(zhì)種類，環(huán)境）２．熒光定量的依據(jù)和方法(1)定量依據(jù)熒光強度If正比于吸收的光強度Ia和熒光量子效率：

If=Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc

)

If=I０(1-10-lc

)=I０(1-e-2.3lc

)

濃度很低時，將括號項近似處理后：

If=2.3I０

lc（２）定量的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法３.熒光免疫分析法（Fluorescenceimmunoassay,FIA)（１）熒光免疫分析：以熒光標(biāo)記物標(biāo)記抗體（或抗原），利用被檢物質(zhì)在反應(yīng)體系中特異結(jié)合位點熒光的強弱，利用不同的分析儀（熒光顯微鏡，流式細胞儀等）進行定性、定量分析的方法（２）熒光標(biāo)記物熒光素，羅丹明類，香豆素類熒光染料，具有天然熒光的蛋白質(zhì)激發(fā):490~495nm;發(fā)射:520~530nmFITC

熒光素吸收:570nm;發(fā)射595~600nmTRITC羅丹明FIA的分析模式（1）競爭型（以標(biāo)記抗原的競爭型為例)：未標(biāo)記的抗原與標(biāo)記的抗原競爭結(jié)合有限的抗體(Ab)而實現(xiàn)的免疫分析。Ab和Ag-L的濃度固定，Ag+Ag-L+Ab→(Ag:Ab)+(Ag-L:Ab)反應(yīng)后，游離的Ag-L量增加，可以定量測出樣品中待測抗原的含量。（2）夾心型:在免疫載體上固定過量的Ab，然后加入一定量的Ag,免疫反應(yīng)后，加入過量的標(biāo)記抗體，來形成“三明治”式的免疫復(fù)合物。樣品中的抗原越多，結(jié)合的標(biāo)記抗體也越多，熒光強度就大。

Ab+Ag→Ab:Ag→→Ab:Ag:Ab-L+Ab-L４．熒光酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)熒光酶聯(lián)免疫分析：是基于酶標(biāo)免疫試劑與熒光底物相結(jié)合的一種分析方法．原理：抗體或抗原用酶標(biāo)記，然后標(biāo)記了酶的抗體或抗原與適當(dāng)?shù)拿傅孜锇l(fā)生作用，產(chǎn)生有熒光的產(chǎn)物．必要的試劑：固相的抗原或抗體；酶標(biāo)記的抗原或抗體；酶反應(yīng)的底物。辣根過氧化物酶（HRPhorseradishperoxidase)……….

Elisa的基本類型ApplicationsofFluorochromesinBiologyandMedicalDiagnosisLablescovalentlylinktobiomolecules(標(biāo)記)e.g.toanantibody,DNA,···Stainsdirectlydyecellcomponents(染色)e.g.bindstoDNA,RNA,···Sensorsimageionsormoleculesinvivo(成像)e.g.H+,metalions,anions,NO,···GeneexpressionEnzymeregulationNeurotransmissionEffectsinthebrain(upto0.3mM)Causecelldeath？CellsignalmessengermuchlikeCa2+?Choi

etal.Science1996,272,1013PETChemosensorsforZn2+Steric-effectsdecidetheselectivityH+MorestressLessstressX.Peng,etal,

Org.Biomol.Chem.2005,3,1387-1392ProblemswithQuantitativeSingleWavelengthFluorescenceImagingProblemsinReliabilityUnevenloadingofdyeinthecell.InstrumentationnoiseSamplegeometry(thickness)Solution:ratioimagingofthedyeRatiometricFluorescentZincSensorPengetal.SensorsandAcutators,2009RatioofFluorescence:independentofdyeconcentrationCd2+:

ToxicityandaccumulationToxicity:TherehavebeenmanyreportsonthetoxicityofCd2+toprocreation,bones,kidneys,nervesystem,andtissues.Accumulation:Sincecadmiumcanbeaccumulatedinorganisms,thereisagreatneedformethodsofdetectingandmonitoringcadmiumlevelsinlivingcellsortissuesamples.DifficulttoDiscriminatefromZn2+Cd2+andZn2+havesimilarchemicalandphysicalproperties.Zn2+

chemosensoralwaysrespondtoCd2+λem(LE)λem(ICT)SelectivityBcd1baRatio:4.00

Ratiofluorescence(F597/F697)imagesofCd2+inDCcells.(LeicaTCS-SP2ConfocalFluorescenceMicroscope,20×objectivelens).Xiaojun

Pengetal.J.Am.Chem.Soc.2007,129(6),1500Ratio:EL/ICTImagingCd2+inLivingCellsThefirstfluorescenceCd2+imageinlivingcellsSimilarStructuresandDifferentcrucialRolesCysdeficiency:slowgrowthinchildren,hairdepigmentation,,lossofmuscleandfat,skinlesions,weakness,…Hcyatelevatedlevelsinplasma:ariskfactorforAlzheimer’sandcardiovasculardiseases(心血管病)

Cys:240-280μMinplasmaHcy:12-18μMANewProbeandProposedMechanismXiaojun

Pengetal.

ChemComm.2009SelectivityandBio-imagingXiaojun

Pengetal.

ChemComm.

Fluorescentchemodosimeter:effectivelydiscriminateCysfromHcy分子信標(biāo)

（MolecularBeacon)是基于核酸堿基配對原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理設(shè)計的一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸探針.它將核酸的序列結(jié)構(gòu)信息轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庑盘?，選擇性，靈敏度高.可以提供實時信息。應(yīng)用于實時PCR,核酸序列分析，活細胞中ｍＲＮＡ的檢測、蛋白與核酸的相互作用等等。分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)（1）環(huán)狀區(qū)（長度15～30個堿基的序列，可以與靶序列特異性結(jié)合）（2）信標(biāo)莖桿區(qū)（長度為5～8個堿基的互補序列，使得形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與靶序列無關(guān)）（3）熒光基團和猝滅基團（通過共價鍵連接在莖桿區(qū)的末端，熒光基團聯(lián)接在信標(biāo)分子的5’-端，猝滅基團聯(lián)接在3’-端）環(huán)狀區(qū)莖桿區(qū)猝滅基團熒光基團首例分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)示意圖分子信標(biāo)作用原理無靶標(biāo)存在下，莖環(huán)結(jié)構(gòu)使得熒光基團和猝滅基團相互靠近，發(fā)生熒光共振能量（FRET）轉(zhuǎn)移，熒光猝滅，熒光背景極低。加入靶序列后，分子信標(biāo)與完全互補靶序列形成剛性并且更加穩(wěn)定的雙鏈雜交體，使得熒光基團和猝滅基團距離增大，阻止了FRET的發(fā)生，熒光恢復(fù)。波長轉(zhuǎn)移分子信標(biāo)優(yōu)點：如果對不同分子信標(biāo)探針修飾以具有不同特征發(fā)射波長的熒光發(fā)射基團,就可在同一激發(fā)光下,通過檢測這些特征波長的熒光強度,實現(xiàn)在同一體系中的多基因分析?；铙w內(nèi)核酸的動態(tài)檢測Perlette

利用微注射法在袋鼠腎細胞質(zhì)中引入分子信標(biāo),對單個活細胞中的RNA進行了檢測,并利用ICCD成像系統(tǒng)得到了一系列反應(yīng)分子信標(biāo)與RNA結(jié)合的熒光圖像。結(jié)果表明,利用分子信標(biāo)可以有效地實時檢測活細胞中的RNA及研究RNA/DNA的雜交過程。蛋白結(jié)構(gòu)變化及與其他分子的相互作用蛋白質(zhì)的組成部分中，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸能產(chǎn)生熒光，它們都含有苯環(huán)，但在蛋白質(zhì)中存在色氨酸時，酪氨酸的熒光不明顯。第五節(jié)熒光在實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用PCR技術(shù)原理(polymerasechainreaction)

一種可在體外將DNA靶序列的拷貝數(shù)擴增至106以上的技術(shù)。其基本過程為

DNA雙鏈的變性

引物與模板DNA的退火

DNA聚合酶指導(dǎo)下的鏈延伸

實時熒光定量PCR技術(shù)概念：實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法

熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。實時熒光定量PCR與普通PCR比較擴增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強度：每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集熒光基團熒光檢測元件熒光信號閾值（threshold）：

前3~15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，低于儀器的測定限之下，手動設(shè)置。

熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號均值標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍（根據(jù)基線的變化）真正的信號:熒光信號超過域值Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t)value實時熒光定量PCR－－定量原理理想的PCR反應(yīng)：

X=X０*2n非理想的PCR反應(yīng)：

X=X０

(1+E)nn：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

E：擴增效率在擴增產(chǎn)物達到閾值線時:

XCt=X0

(1+E)Ct=M(1)

XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:logM=logX0(1+E)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+E)*Ct+logM(3)Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量標(biāo)準(zhǔn)曲線

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量二、熒光定量PCR標(biāo)記（檢測）方法內(nèi)摻式染料（雙鏈DNA交聯(lián)染料）

SYBRGreen

IorII序列特異性探針

Taqman

MolecularBeacons

5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGSYBR-GreenI

（非特異結(jié)合雙鏈DNA小溝熒光染料EmissionSYBR-GreenI

SGSGSGSGSG5’3’5’3’ExcitationEmission溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度SYBRGreenI熔解曲線分析將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確Taqman

探針Hollandandhiscolleagues:Taqman探針3′端Q熒光分子能夠吸收5′端R熒光分子發(fā)出的熒光,因此,正常情況下該探針檢測不到5′端熒光分子發(fā)出的熒光,只能檢測到3′端熒光分子的熒光信號,但當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物(模板)時,探針與模板退火,即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物,從而激活Taq

酶的5′外切酶活性,將探針5′端連接的R熒光分子從探針上切割下來,破壞了兩個熒光分子間的FRET,從而發(fā)出熒光,切割的R熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量用TaqMan探針進行基因型分析FAM:6-羧酸熒光素，TET:四氯-6-羧酸熒光素，HEX:六氯-6-羧酸熒光素，常用淬滅劑：TAMRA:6-羧酸-四甲基羅丹明。實時熒光定量的應(yīng)用醫(yī)療方面的應(yīng)用：研究方面的應(yīng)用１新藥研究開發(fā)超早期感染用藥物及療法的研究和開發(fā)藥物療效研究新的臨床診斷和檢測方法的開發(fā)人類基因型與藥物療效間的關(guān)系研究方面的應(yīng)用２研究方面的應(yīng)用３熒光練習(xí)題(一)判斷題1.第一激發(fā)單重態(tài)與三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同,激發(fā)三重態(tài)具有較高的能級.()2.振動弛豫是指在同一電子能級中,電子由高振動能級轉(zhuǎn)移到低振動能級,而將多余的能量以熱的形式發(fā)出.（）３．內(nèi)轉(zhuǎn)換是相同多重態(tài)電子能級中，等能級間的無輻射能級交換（）４．在內(nèi)轉(zhuǎn)換中，電子的自旋狀態(tài)會發(fā)生改變．（）５．系間跨越改變了電子的自旋狀態(tài)，屬于禁阻躍遷．（）６．熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長有關(guān)，選擇不同波長的光輻射激發(fā)，會