第四章-蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化課件

第四章酶蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。這是因為工業(yè)生產(chǎn)中每一步的反應(yīng)體系中常常會有酸、堿或有機溶劑存在，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大多數(shù)酶會很快變性失活。提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中一個非常重要的課題。一般來說，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性包括：延長酶的半衰期，提高酶的熱穩(wěn)定性，延長藥用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失等。下面舉一個如何通過蛋白質(zhì)工程來提高重組β-干擾素專一活性和穩(wěn)定性的例子。干擾素是一種抗病毒、抗腫瘤的藥物。將人的干擾素的cDNA在大腸桿菌中進行表達，產(chǎn)生的干擾素的抗病毒活性為106

U/mg，只相當(dāng)于天然產(chǎn)品的十分之一，雖然在大腸桿菌中合成的β-干擾素量很多，但多數(shù)是以無活性的二聚體形式存在。為什么會這樣？如何改變這種狀況？研究發(fā)現(xiàn)，β-干擾素蛋白質(zhì)中有3個半胱氨酸（第17位、31位和141位），推測可能是有一個或幾個半胱氨酸形成了不正確的二硫鍵。研究人員將第17位的半胱氨酸，通過基因定點突變改變成絲氨酸，結(jié)果使大腸桿菌中生產(chǎn)的β-干擾素的抗病性活性提高到108

U/mg，并且比天然β-干擾素的貯存穩(wěn)定性高很多。

提高酶蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

葡萄糖異構(gòu)酶（GI）在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，朱國萍等人在確定第138位甘氨酸(Gly138)為目標(biāo)氨基酸后，用雙引物法對GI基因進行體外定點誘變，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達，結(jié)果突變型GI比野生型的熱半衰期長一倍；最適反應(yīng)溫度提高10～12℃；酶比活相同。據(jù)分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了一個吡咯環(huán)，該側(cè)鏈剛好能夠填充于Gly138附近的空洞，使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更具剛性，從而提高了酶的熱穩(wěn)定性。第一節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分子原因金屬離子、底物、輔因子和其他低相對分子質(zhì)量配體的結(jié)合作用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂的作用鹽橋和氫鍵二硫鍵對氧化修飾敏感的氨基酸含量較低氨基酸殘基的堅實裝配疏水相互作用滲透劑的作用第一次是在1982年被發(fā)現(xiàn)，其主要作用是保護在逆境中的生物。它們能保護人腎臟中的細胞，如分解掉大量含破壞蛋白質(zhì)的化學(xué)尿素；它們能使一種凍結(jié)的北極青蛙在無損傷的情況下解凍；并且它們還能使奇異微小生物"水熊"生活在極度干燥、強烈輻射和絕對零度以上幾度到過熱蒸汽的溫度范圍內(nèi)。

MatthewAuton和D.WayneBolen在文章中描述了熱力學(xué)計算的應(yīng)用，并成功預(yù)測了多種滲透劑在逆境狀態(tài)下保護蛋白質(zhì)的能力。極熱、極冷或細胞周圍化學(xué)環(huán)境的改變均能影響蛋白質(zhì)正常功能的行使，而滲透劑則可以讓蛋白質(zhì)具有正確的結(jié)構(gòu)形式，并正常行使功能。蛋白質(zhì)是折疊的，生物醫(yī)學(xué)研究的主要目的就是了解它們折疊或在不穩(wěn)定時展開的原因。需要研究滲透劑是如何影響不同蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的，以及它們之間的互作情況，這將為研究蛋白質(zhì)折疊過程提供重要的信息。蛋白質(zhì)的折疊與伸展是病變的一個明顯特征，如老年癡呆癥、瘋牛病和囊腫性纖維化。滲透劑在人體多種器官行使功能，尤其是在腎臟和大腦中。沒有滲透劑，腎臟將無法行使功能，大腦組織也不能反應(yīng)。醫(yī)學(xué)研究主要針對它們在腎臟中的作用，而它們也出現(xiàn)在其它很多組織中，該項技術(shù)將有助于醫(yī)學(xué)研究人員研究滲透劑在整個體內(nèi)的作用。第二節(jié)蛋白質(zhì)不可逆失活的原因和機理蛋白水解酶和自溶作用聚合作用極端pH氧化作用表面活性劑和去污劑變性劑重金屬離子和巰基試劑熱機械力冷凍和脫水輻射作用第三節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化固定化酶修飾蛋白質(zhì)工程工程二硫鍵增加蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性酶表面親水化抗氧化失活A(yù)sn脫胺失活酶的失活和再活化第四節(jié)各種酶穩(wěn)定化方法的比較一、酶穩(wěn)定化的標(biāo)準穩(wěn)定性至少增加1-3個數(shù)量級應(yīng)對各種酶失活因素（物理、化學(xué)及生物學(xué)因素）都有保護作用穩(wěn)定化不應(yīng)減少酶活力或改變酶的專一性穩(wěn)定化方法應(yīng)適合各類蛋白質(zhì)穩(wěn)定化方法應(yīng)在體內(nèi)、體外都適用從經(jīng)濟角度看，方法應(yīng)具有放大的潛力評定穩(wěn)定化方法的標(biāo)準穩(wěn)定性至少增加1~3個數(shù)量級應(yīng)對各種酶失活因素都有保護作用穩(wěn)定化不應(yīng)減少酶活力或改變酶的專一性穩(wěn)定化方法應(yīng)適合各類蛋白質(zhì)穩(wěn)定化方法應(yīng)在體內(nèi)、體外都適用從經(jīng)濟角度看，方法應(yīng)具有放大的潛力二、各方法的比較隨機共價修飾法，如將PEG連到酶上，顯然不能令人滿意蛋白質(zhì)工程和選擇抗體保護法更符合這些標(biāo)準，具有普遍性從難易程度和費用看，后者顯然優(yōu)于前者增加酶穩(wěn)定性的新方法、新觀念仍有待開發(fā)，其研究進展必將加