唾液中提取RNA的操作規(guī)程

唾液中提取RNA的操作規(guī)程唾液中提取RNA的操作規(guī)程唾液中提取RNA的操作規(guī)程xxx公司唾液中提取RNA的操作規(guī)程文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度唾液中提取RNA的操作規(guī)程——Omega試劑盒法1目的規(guī)范從唾液中提取RNA的方法和過(guò)程。2范圍適用于人唾液的RNA提取。3實(shí)驗(yàn)儀器高速冷凍離心機(jī)：Neofuge13R，Neoguge15RExtrageneminicentrifuge；干式恒溫器：K30，杭州奧盛；旋渦混合儀：XW-80A，QILINBEIER。超微量核酸分析儀：Nano2004實(shí)驗(yàn)試劑、耗材DEPCWater(DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過(guò)并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各種反應(yīng)體系如反轉(zhuǎn)錄、siRNA的退火等，以及其它各種要求無(wú)RNase、DNase和proteinase的反應(yīng)體系)RNA-freeWater氯仿無(wú)水乙醇，70%乙醇（用DEPC處理水配制）；Omega的血液RNA小量提取試劑盒；4.4.1用滅菌水稀釋10xBufferERL到1xBufferERL4.4.2RNAWashBufferⅡ在使用前，按瓶子標(biāo)簽所示用無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋。5實(shí)驗(yàn)流程口腔脫落細(xì)胞的收集5.1.1取干凈的口腔拭子在口腔壁上來(lái)回篩拭20-30次左右，然后小心地將拭子頭掰斷，并放入有保存液的的無(wú)酶離心管中。5.1.2將離心管放到掌式漩渦機(jī)中充分震蕩1min。12000rpm室溫離心1min。5.1.4去上清，加500ul的DEPCWater進(jìn)行洗滌，混勻，12000rpm室溫離心1min。5.1.5重復(fù)步驟，最后用200ul的DEPCWater對(duì)沉淀進(jìn)行懸浮。消化裂解細(xì)胞5.2.1加入1mlRNA-SolvReagent,2ulRNA酶抑制劑,充分混合均勻，室溫靜置10min。5.2.2加入250ul的氯仿，（每1mlRNA-SolvReagent加250ul氯仿），劇烈震蕩15s，冰浴10min。4℃，12000×g收集和純化RNA5.3.1吸取不超過(guò)上清80%的上清液至新的無(wú)酶離心管中（注意槍頭不要碰到離心管壁或沉淀），并加入等體積的70%的乙醇至管中，混合均勻，靜置2min。5.3.2吸取800ul液體至離心柱中,靜置2min。室溫，10000rpm離心1min。5.3.3掉棄廢液，吸取剩下的液體至離心柱中，靜置2min。室溫，10000rpm離心1min。5.3.4吸取300ulRWCWashBuffer至離心柱中進(jìn)行洗脫，室溫，12000rpm離心1min。5.3.5掉棄廢液，吸取300ulRWCWashBuffer5.3.6把離心柱放到干凈的收集管中，吸取300ulRNAWashBufferⅡ5.3.7掉棄廢液，吸取300ulRNAWashBufferⅡ5.3.8掉棄廢液，把離心柱重新裝回收集管中，室溫，12000rpm離心5.3.9把離心柱轉(zhuǎn)移到干凈的無(wú)酶的離心管中，打開(kāi)蓋子，室溫靜置2min洗脫收集RNA5.4.1加入15~30ul已56℃預(yù)熱的RNA-freeWater至柱子的膜中央，室溫靜置3~5min。12000rpm離心1min。5.4.2再進(jìn)行一次掛柱，然后掉棄離心