生物安全動植物用轉基因微生物的安全性

生物安全

Biosafety

動、植物用轉基因微生物的安全性微生物的特點個體小繁殖快數量大易變異分布廣泛生命力強容易擴散內容提要（1）動、植物用轉基因微生物的發(fā)展概況；（2）動物用轉基因微生物的安全性評價（受體微生物的安全性評價、轉基因操作的安全性評價、動物用轉基因微生物的安全性評價、動物用轉基因微生物產品的安全性評價）；（3）植物用轉基因微生物的安全性評價（受體微生物的安全性評價、轉基因操作的安全性評價、植物用轉基因微生物的安全性評價、植物用轉基因微生物產品的安全性評價）；（4）動、植物用轉基因微生物的安全管理（國外、國內）。動、植物用轉基因微生物的定義動物用轉基因微生物主要包括動物用轉基因活疫苗和動物用轉基因活微生物飼料添加劑；植物用轉基因微生物是指通過重組DNA技術研制的，直接應用于植物上具有殺蟲、防病、固氮、調節(jié)生長等作用的微生物。（一）轉基因微生物概況轉基因動物用微生物的研究與開發(fā)起步于20世紀80年代初口蹄疫病毒是最早研究的對象國際上發(fā)達國家對基因工程疫苗的研究與開發(fā)十分重視已相繼研制成功一些用于動物疫病免疫預防用的基因工程亞單位疫苗、基因工程重組活載體疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗等1.轉基因微生物飼料添加劑酶制劑以基因工程研制能高效表達植酸酶的重組畢氏酵母?？咕臏p少或完全替代抗生素藥物。重組生長激素2.基因工程亞單位疫苗利用體外表達系統(tǒng)（如大腸桿菌，酵母，動物細胞，桿狀病毒-昆蟲細胞等）表達病毒的主要保護性抗原蛋白作為亞單位疫苗不僅具有優(yōu)良的安全性，而且便于規(guī)模化生產利用非疫苗用蛋白作為抗原建立的診斷方法將可以區(qū)分亞單位疫苗免疫的動物和自然感染的動物涉及動物病原大多數禽、豬、牛等動物的病原體免疫原性蛋白（保護性抗原）FMDVVP1、狂犬病病毒的囊膜蛋白G，AIVHA蛋白，偽狂犬病病毒的囊膜糖蛋白gP50，新城疫病毒F和HN蛋白,傳染性法氏囊病毒VP2蛋白，傳染性胃腸炎病毒的纖突蛋白，雞傳染性貧血病病毒的衣殼蛋白（VP1）……….2.基因工程重組活載體疫苗

痘病毒、皰疹病毒、腺病毒或細菌作為載體具有常規(guī)弱毒疫苗的所有優(yōu)點便于構建多價疫苗利用非疫苗用基因或其表達產物可以建立鑒別診斷方法

利用痘病毒作為載體痘苗病毒數十種病原的基因在痘苗病毒中進行了表達，都顯示出不同程度的免疫保護性。比較成功的有表達狂犬病病毒G蛋白的重組痘苗病毒和表達牛瘟病毒F和HA蛋白的重組痘苗病毒疫苗

禽痘病毒（雞痘病毒、金絲雀痘病毒、鴿痘病毒）新城疫病毒F和HN蛋白禽流感病毒的HA和NP蛋白馬立克氏病毒gB糖蛋白禽白血病囊膜蛋白傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白禽網狀內皮增生癥病毒囊膜蛋白火雞出血性腸炎病毒Hexon蛋白利用腺病毒作為載體目前已有許多外源基因被插入腺病毒并得到表達SIV水皰性口炎病毒狂犬病病毒牛副粘病毒3型牛皰疹病毒I型牛冠狀病毒豬傳染性胃腸炎病毒利用皰疹病毒作為載體火雞皰疹病毒、偽狂犬病病毒、牛皰疹病毒I型和雞傳染性喉氣管炎病毒已完成動物試驗并顯示出良好前景的重組皰疹病毒疫苗：口蹄疫病毒VP1基因，豬瘟病毒E2基因，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒GP5基因，豬流感病毒HA基因的重組偽狂犬病毒疫苗表達傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組馬立克氏病毒疫苗表達禽流感病毒HA基因的重組傳染性喉氣管炎病毒疫苗利用細菌作為載體大腸桿菌沙門氏菌李氏桿菌目前國際上基因工程疫苗研究與開發(fā)的熱點之一3.基因缺失疫苗

一類發(fā)展前景很好的基因工程疫苗偽狂犬病基因缺失疫苗(雙基因和三基因缺失疫苗，如TK-/gG-、TK-/gE-、TK-/gC-和TK-/gE-/gI-等，并已商品化生產牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）TK基因缺失疫苗4.DNA疫苗DNA疫苗可誘導機體同時產生體液免疫和細胞免疫已發(fā)現(xiàn)DNA接種對許多病毒、細菌、寄生蟲感染以及腫瘤的預防均有一定的效果其他疫苗可食性疫苗(利用轉基因植物)多表位疫苗T細胞疫苗RNA復制子疫苗基因工程疫苗的產業(yè)化與應用是目前和今后的發(fā)展趨勢

含狂犬病毒gB基因的重組牛痘病毒疫苗，已在北美和歐洲廣泛應用于預防野生動物的狂犬病TK和gE雙基因缺失的偽狂犬病疫苗已在美國和大部分歐盟國家廣泛應用于預防豬偽狂犬病和豬偽狂犬病根除計劃TK和gE雙基因缺失的牛傳染性鼻氣管炎病毒疫苗也在許多國家使用，荷蘭于1998年5月在全國范圍內推廣使用TK和gE雙基因缺失的疫苗以便根除此病表達禽流感病毒HA基因的重組雞痘病毒疫苗和表達新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒疫苗也已獲得美國農業(yè)部注冊，開始產業(yè)化生產2、國內研發(fā)情況我國動物用基因工程疫苗的研究與發(fā)達國家之間沒有實質性差距，而且取得了巨大進展十五期間，國家863計劃在動物用基因工程疫苗與診斷試劑的研究與開發(fā)方面的投入有所加強近幾年，我國動物用基因工程疫苗研究呈現(xiàn)出加速發(fā)展的態(tài)勢，已有多種基因工程疫苗已經問世，并進入安全性評價的不同階段涉及的主要疫病禽流感病毒雞新城疫病毒禽傳染性喉氣管炎病毒雞傳染性法氏囊病病毒雞馬立克氏病病毒豬偽狂犬病病毒豬瘟病毒口蹄疫病毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒豬圓環(huán)病毒2型豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌大腸桿菌豬囊蟲第一個商品化的疫苗——仔豬腹瀉大腸桿菌K88/K99二價基因工程疫苗已通過農業(yè)轉基因生物安全評價，并獲得農業(yè)部新獸藥證書，進入產業(yè)化生產和應用階段的基因工程疫苗

禽流感重組滅活疫苗禽流感重組雞痘病毒活載體疫苗傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒活載體疫苗偽狂犬病基因缺失疫苗“O”型口蹄疫病毒基因工程疫苗

以新城疫病毒為載體的重組禽流感疫苗已通過農業(yè)部農業(yè)轉基因生物安全評價的疫苗豬生長抑素基因工程疫苗馬立克氏病基因工程活載體疫苗豬囊蟲核酸疫苗幼畜腹瀉雙價基因工程苗新城疫重組雞痘病毒基因工程疫苗動物去勢疫苗進入安全性評價不同階段的產品越來越多，數量不斷上升各類動物疫病的基因工程亞單位疫苗以禽痘病毒、偽狂犬病病毒、腺病毒為載體的基因工程重組活載體疫苗細菌的基因缺失疫苗DNA疫苗飼料用轉基因微生物在我國也取得成功轉植酸酶酵母已通過農業(yè)部轉基因生物安全評價，并已產業(yè)化生產和應用近年來以轉基因植物為表達系統(tǒng)的可食性疫苗也已成為我國的研究熱點基因工程疫苗的產業(yè)化和商品化是我國在這一領域的發(fā)展方向如何提高基因工程疫苗免疫效力，達到或超過常規(guī)傳統(tǒng)疫苗的免疫保護效果，以期在我國動物疫病的預防和控制中發(fā)揮作用，也是目前和今后我國科學家所面臨的重要任務3.轉基因微生物農藥殺蟲轉基因微生物轉基因病毒殺蟲劑、轉基因Bt制劑、防病轉基因微生物。轉基因微生物肥料遺傳改良的聯(lián)合固氮菌和根瘤菌。1、安全評價原則、技術指標要求安全評價原則

安全評價內容及其技術指標要求

(1)安全評價原則

1、是以促進基因工程技術發(fā)展和應用，同時保障人類健康和生態(tài)環(huán)境的平衡為基本原則2、采取個案分析，實事求是的原則3、從受體微生物的安全性、基因操作的安全性和轉基因動物用微生物遺傳工程體及其產品的安全性等三個方面內容和對動物、人類與環(huán)境的安全性三個角度進行評價（1）從動物安全的角度，著重評價轉基因動物用微生物遺傳工程體及其產品對靶動物和非靶動物的安全性（2）從人類健康角度，著重評價對人類、畜禽以及形成的食物鏈（食品）的影響（3）從生態(tài)環(huán)境角度，著重評價轉基因動物用微生物遺傳工程體及其產品對自然生態(tài)環(huán)境和畜牧業(yè)生態(tài)環(huán)境的影響4、涉及到危害人類、動物健康和生態(tài)環(huán)境平衡的轉基因微生物遺傳工程體及其產品，應對其安全性進行嚴格評價5、從事轉基因動物用微生物研究的機構或個人應逐級申報。國外公司在我國申請注冊的轉基因動物用微生物遺傳工程體及其產品，應按階段進行安全性評價6、農業(yè)部農業(yè)基因安全審評委員會僅負責對轉基因微生物遺傳工程體及其產品的安全性進行評價，因此通過安全性評價（指獲得生物安全證書）的轉基因微生物遺傳工程體及其產品，需申報獸用新生物制品進行審批，獲得獸用新生物制品證書后方能進行商品化生產和應用（2）安全評價內容及其技術指標要求

安全性評價的總體內容安全性評價的階段及其要求試驗方案

主要動物用轉基因微生物及其產品的安全性評價的相關技術資料

1、安全性評價的總體內容受體微生物的安全性評價與安全等級的確定（1）所用受體微生物(包括細菌、病毒)可接觸到的環(huán)境（2）受體微生物的生物學背景與特性學名和分類地位，分布、繁殖方式在環(huán)境中的定殖、存活和傳播能力與途徑及影響因素致病性和產生毒素及毒性物質的能力，在國內外的應用情況（3）受體微生物對人類、動物和其它微生物的影響和潛在的危險程度，受體微生物受人類和動物其它病原體的侵染情況（4）受體微生物對生態(tài)環(huán)境的影響和潛在的危險程度（5）受體微生物的質粒狀況，發(fā)生遺傳變異的可能性及其潛在危險程度（6）對受體微生物的監(jiān)測方法和監(jiān)控技術受體微生物的安全性等級按《農業(yè)轉基因生物安全評價管理辦法》（第二章）確定基因操作的安全性評價內容與等級確定

（1）目的基因的來源、結構、免疫學與生物學功能和用途

（2）基因操作所用載體的名稱、來源、特性與結構、安全性，載體所帶的抗性標記基因及其特性（3）重組DNA分子的結構、構建方法、復制特性和安全性（4）轉基因方法（5）目的基因在受體微生物及宿主體內的表達及其遺傳穩(wěn)定性基因操作的安全性等級按《農業(yè)轉基因生物安全評價管理辦法》（第二章）確定轉基因動物用微生物遺傳工程體及其產品的安全性評價內容

（1）轉基因動物用微生物遺傳工程體的分子學與生物學特性（2）在自然界的存活能力（3）遺傳物質轉移到其他生物體的能力和可能后果（4）與其它病原微生物重組的能力和可能產生的后果（5）遺傳工程體的應用目的和范圍（6）對遺傳工程體應有適當的監(jiān)測方法和監(jiān)控手段遺傳工程體及其產品對動物的安全性

在靶動物和非靶動物體內的生存前景對靶動物和可能的非靶動物高劑量接種后的影響與傳統(tǒng)的產品相比較，其相對的安全性宿主范圍與載體的漂移度免疫動物與靶動物以及非靶動物接觸時的排毒和傳播能力遺傳工程體回復傳代時的毒力返強能力對妊娠動物的安全性對免疫動物子代的安全性遺傳工程體及其產品對人類的安全性

人類接觸和感染的可能性及其危險性廣泛應用后對人類的潛在危險性遺傳工程體及其產品對生態(tài)環(huán)境的安全性

遺傳工程體在環(huán)境中釋放的范圍影響遺傳工程體在外界環(huán)境中的存活、增殖和傳播的理化因素感染靶動物和非靶動物的可能性或潛在的危險性2、安全性評價的階段及其要求中間試驗環(huán)境釋放生產性試驗安全證書申請（1）中間試驗

項目名稱應包括目的基因名稱、動物用轉基因微生物及產品名稱、試驗所在?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）名稱和試驗階段名稱四個部分，如表達雞新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒基因工程疫苗在江蘇省的中間試驗一份申請書中菌株不超過20個，且是由同一種受體微生物、相同的目的基因、相同的基因操作所獲得的，而且每個轉基因菌株都應有明確的名稱或編號試驗地點不超過3個省（市、區(qū)），每省不超過2個點試驗動物總規(guī)模（上限）大動物（馬、牛）20頭中小動物（豬、羊等）40頭禽類（雞、鴨等）200羽魚2000尾試驗地點應明確試驗所在的省（市、自治區(qū)）、縣（市）、鄉(xiāng)、村試驗年限一般為1~2年申報中間試驗應提供以下相關附件資料目的基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列目的基因與載體構建的圖譜試驗地點的位置圖和試驗隔離圖試驗設計（包括進行安全性評價的主要指標和研究方法等，如轉基因微生物的穩(wěn)定性、競爭性、生存適應能力、外源基因在靶動物體內的表達和消長關系等）（2）環(huán)境釋放

項目名稱應包括目的基因名稱、動物用轉基因微生物及產品名稱、試驗所在?。ㄊ?、自治區(qū)）名稱和試驗階段名稱四個部分，如表達雞新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒基因工程疫苗NF16和YF9在江蘇省的環(huán)境釋放一份申報書中菌株不超過5個，且是由同一種受體微生物、相同的目的基因、相同的基因操作所獲得的，每個菌株都應有明確的名稱或編號，并與中間試驗階段的相對應試驗地點不超過3個?。ㄊ小^(qū)），每省不超過3個點試驗動物總規(guī)模（上限）大動物（馬、牛）100頭中小動物（豬、羊等）500頭禽類（雞、鴨等）5000羽魚10000尾試驗地點應明確試驗所在的?。ㄊ?、自治區(qū)）、縣（市）、鄉(xiāng)、村一次申請環(huán)境釋放的期限一般為1~2年申請環(huán)境釋放應提供以下相關附件資料目的基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列目的基因與載體構建的圖譜中間試驗階段的安全性評價試驗總結報告毒理學試驗報告（如果必要的話）試驗地點的位置圖和試驗隔離圖試驗設計（包括進行安全性評價的主要指標和研究方法等，如轉基因微生物的穩(wěn)定性、競爭性、生存適應能力、外源基因在靶動物體內的表達和消長關系等）（3）生產性試驗項目名稱應包括目的基因名稱、動物用轉基因微生物及產品名稱、試驗所在?。ㄊ?、自治區(qū)）名稱和試驗階段名稱四個部分，如表達雞新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒基因工程疫苗NF16在江蘇省的生產性試驗一份申報書只能申請1種動物用轉基因微生物，且名稱應與前期試驗階段的名稱和編號相對應試驗地點應在批準過環(huán)境釋放的?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）進行，但不能超過2個省（市、區(qū)），每省不超過3個點試驗動物總規(guī)模（上限）大動物（馬、牛）1000頭中小動物（豬、羊等）10000頭（只）禽類（雞、鴨等）20000羽魚100000尾試驗地點應明確試驗所在的?。ㄊ?、自治區(qū)）、縣（市）、鄉(xiāng)、村一次申請生產性試驗的期限一般為1~2年申請生產性試驗應提供以下相關附件資料目的基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列目的基因與載體構建的圖譜環(huán)境釋放階段審批書的復印件中間試驗和環(huán)境釋放安全性評價試驗的總結報告食品安全性檢測報告（如果必要的話）目的基因或動物用轉基因微生物向環(huán)境中的轉移情況報告試驗地點的位置圖和試驗隔離圖試驗設計（包括進行安全性評價的主要指標和研究方法等，如轉基因微生物的穩(wěn)定性、競爭性、生存適應能力、外源基因在靶動物體內的表達和消長關系等）（4）安全證書的申請

安全證書的申請項目應包括目的基因名稱、轉基因微生物名稱，如表達雞新城疫病毒F基因的重且雞痘病毒基因工程疫苗NF16的安全證書一份申報書只能申請1種動物用轉基因微生物，其名稱應當與前期試驗階段的名稱或編號相對應一次申請安全證書的使用期限一般不超過5年申請安全證書應提供以下相關附件資料目的基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列目的基因與載體構建的圖譜目的基因的分子檢測或鑒定技術方案重組DNA分子的結構、構建方法；各試驗階段審批書的復印件各試驗階段安全性評價試驗的總結報告目的基因或轉基因微生物向環(huán)境中轉移情況的報告穩(wěn)定性、生存競爭性、適應能力等的綜合評價報告對非靶生物影響的報告食品安全性檢測報告（如果必要的話）該類動物用轉基因微生物在國內外生產應用的概況其它相關資料3、試驗方案

試驗方案應明確：試驗所在地區(qū)及畜禽場的名稱及其周圍的環(huán)境資料試驗所在區(qū)域的生態(tài)類型與動物種類試驗所在區(qū)域的動物疫病流行情況試驗所在區(qū)域生態(tài)環(huán)境對遺傳工程體存活、繁殖、擴散和傳播的有利或不利因素，特別是環(huán)境中其它生物從遺傳工程體獲得目的基因的可能性有明確的試驗起止時間確定試驗動物、動物數量和試驗區(qū)域大小參加試驗的人員情況相應的隔離和環(huán)境監(jiān)控措施提出用于監(jiān)測試驗區(qū)域和周圍環(huán)境中遺傳工程體的適當的方法和程序，監(jiān)測方法應當敏感性高和特異性強詳細記錄監(jiān)測結果，提出遺傳工程體及其產品的穩(wěn)定的生產工藝，包裝規(guī)格和貯存條件，明確遺傳工程體及其產品的接種劑量和途徑，使用產品總量，剩余產品的處理方法，提出試驗動物的飼養(yǎng)和試驗后的處理方法，應提出試驗所在區(qū)域的消毒措施，提出試驗實施過程中出現(xiàn)意外事故的應急措施，明確試驗結束后的監(jiān)控措施和年限4、主要動物用轉基因微生物及其產品的安全性評價的相關技術資料

基因工程亞單位疫苗和基因工程滅活疫苗重點評價受體微生物、基因操作、重組微生物的安全性，其產品本身的安全性不存在問題利用重組微生物、基因缺失微生物制備的基因工程滅活疫苗應重點評價受體微生物、基因操作和轉基因微生物的安全性，基因重組和基因缺失對受體微生物的致病性及其表型可能造成的影響、轉基因微生物的安全性（亞單位疫苗或滅活疫苗可通過中間試驗后，直接申報安全證書）基因工程重組活載體疫苗應重點評價受體微生物、基因操作和重組微生物及其產品的安全性評價試驗內容：重組微生物的穩(wěn)定性、重組微生物中外源基因的穩(wěn)定性、外源基因在免疫動物體內的表達和消長情況、重組微生物對免疫動物的安全性及對環(huán)境的安全性等（利用已知的載體研制的基因工程重組活載體疫或者可跨越環(huán)境釋放或生產性試驗，而申請安全證書）

基因缺失活疫苗應重點評價祖代微生物、基因操作和缺失微生物及其的安全性安全性評價試驗內容：缺失微生物的穩(wěn)定性、缺失微生物的致病性和對免疫動物的安全性、缺失微生物與野生型微生物重組的可能性、基因缺失微生物排毒和傳播能力及其對環(huán)境的安全性DNA疫苗應評價質粒DNA的安全性重組質粒DNA在免疫動物體內的存留時間與對宿主染色體或基因的影響與宿主染色體整合的潛在可能性DNA疫苗免疫接種時的局部反應性和全身性毒性DNA疫苗潛在的致腫瘤性（三）國內外安全管理情況

國外對涉及基因操作制備的轉基因動物用微生物及其產品（基因工程疫苗）的安全性也十分重視美國和歐洲一些國家雖然沒有設立專門的評價機構和管理機構，但在評價這類產品的安全性方面，增設了與轉基因安全相關的評價內容和規(guī)定，在進行疫苗評審時一同進行審查我國十分重視農業(yè)轉基因生物的安全管理，將轉基因動物用微生物（疫苗等）的安全管理納入國家農業(yè)轉基因生物安全管理范疇，頒布了相關管理法規(guī)和條例，在國家農業(yè)轉基因安全評價委員會設立了動物用轉基因微生物安全評價小組，對轉基因動物用微生物的安全性進行評價，同時與我國農業(yè)部新生物制品的評審相銜接（四）案例分析

以基因工程活載體疫苗——（表達傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組雞痘病毒基因工程疫苗）為例（一）安全性評價及其依據受體微生物的安全性評價基因操作的安全性評價動物用轉基因微生物的安全性評價動物用轉基因微生物產品的安全性評價

參照《農業(yè)轉基因生物安全評價管理辦法》附錄“動物用轉基因微生物安全性評價”,逐條進行評價和表述，并提出安全性評價的依據

關于受體微生物——雞痘病毒雞痘病毒S-FPV-017疫苗株，廣泛應用，有長期應用的安全記錄對人類健康或生態(tài)環(huán)境沒有危害

關于基因操作所涉及的載體、啟動子、目的基因已在國內外實驗室廣泛使用，均具有科學試驗數據和良好的長期安全應用記錄，所構建的轉移載體不帶危險性的標記基因和報告基因，導入受體微生物后，不帶標記基因而僅帶報告基因，使受體微生物獲得了表達雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因抗原的新特性，這種遺傳性狀的改變對人類健康和生態(tài)環(huán)境沒有不利的影響關于重組雞痘病毒S-FPV-017株病毒和重組病毒免疫雞，表現(xiàn)相同的安全性，致病性沒有增加重組雞痘病毒在雞胚連續(xù)傳10代，對雞的毒力及免疫力沒發(fā)生變異（二）各階段的安全性評價內容

申報中間試驗