單克隆抗體制備技術(shù)課件

第四節(jié)單克隆抗體

第四節(jié)單克隆抗體

1

理化性狀高度均一、生物活性單一、只與一種抗原表位發(fā)生發(fā)應(yīng)、具有高度的特異性一、單克隆抗體的概念及特點(diǎn)概念：特點(diǎn)：

指由B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的,只識(shí)別抗原分子上一種抗原決定簇的抗體分子理化性狀高度均一、生物活性單一、只與一種抗原2由一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞分裂增殖，形成的單克隆所產(chǎn)生的抗體。二、雜交瘤技術(shù)的原理及流程克?。河梢粋€(gè)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性分裂增殖，形成的均一細(xì)胞集團(tuán)。單克隆抗體：由一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞分裂增殖，形成的單克隆所產(chǎn)生的抗體。3

B細(xì)胞雜交瘤1.雜交瘤技術(shù)的原理：致敏B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞B細(xì)胞雜交瘤分泌抗體能力無(wú)限繁殖能力融合B細(xì)胞雜交瘤1.雜交瘤技術(shù)的原理：致敏B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞4

是B細(xì)胞系惡性腫瘤，具有在體外長(zhǎng)期增殖的特性。

免疫脾細(xì)胞是經(jīng)過(guò)抗原誘導(dǎo)活化的脾細(xì)胞，主要是B淋巴細(xì)胞，它具有分泌抗體的能力。骨髓瘤細(xì)胞是B細(xì)胞系惡性腫瘤，具有在體外長(zhǎng)期增殖的特性。免疫5與B細(xì)胞融合后形成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，能無(wú)限增殖傳代和分泌特異性抗體缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)換酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的條件該具備骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)與B細(xì)胞有較高的融合率本身不合成Ig與B細(xì)胞融合后形成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，能無(wú)限增殖傳代和分泌特異62.細(xì)胞融合的方法融合劑融合法

聚乙二醇（PEG）（最常用）仙臺(tái)病毒溶血卵磷脂2.細(xì)胞融合的方法融合劑融合法聚乙二醇仙臺(tái)病毒溶血卵磷73.選擇性培養(yǎng)基的作用原理①HAT培養(yǎng)基是一種篩選B細(xì)胞雜交瘤的選擇性培養(yǎng)基，含有：次黃嘌呤（H）氨基蝶呤（A）胸腺嘧啶（T）3.選擇性培養(yǎng)基的作用原理①HAT培養(yǎng)基是一種篩選B細(xì)胞8輔助途徑

主要途徑HGPRTTK次黃嘌呤+胸腺嘧啶DNA

②細(xì)胞DNA生物合成途徑氨基酸

核苷酸

DNA葉酸輔助途徑主要途徑HGPRTTK次黃嘌呤+胸腺嘧啶DNA②9TK缺陷細(xì)胞+-HGPRT缺陷細(xì)胞+-雜交瘤細(xì)胞++

細(xì)胞類型正常培養(yǎng)基HAT培養(yǎng)基

③HAT培養(yǎng)基作用原理TK缺陷細(xì)胞+10HAT培養(yǎng)基中的氨基蝶呤為葉酸拮抗劑，故所有細(xì)胞的DNA合成主要途徑被阻斷，只能由輔助途徑合成DNA。

未融合的瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT和TK，不能合成DNA，即不能生存而死亡。HAT培養(yǎng)基中的氨基蝶呤為葉酸拮抗劑，故所有細(xì)胞的DNA11只有融合的雜交瘤細(xì)胞從B細(xì)胞中獲得了HGPRT和TK，又能在體外培養(yǎng)繁殖，因而存活。未融合的B細(xì)胞不能在體外長(zhǎng)期生存而自然死亡只有融合的雜交瘤細(xì)胞從B細(xì)胞中獲得了HGPRT和TK，又能在124.制備單克隆抗體的技術(shù)流程（一）雜交瘤技術(shù)流程4.制備單克隆抗體的技術(shù)流程（一）雜交瘤技術(shù)流程13融合前應(yīng)經(jīng)過(guò)含有特殊成分的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)HGPRT或TK的活性。（二）技術(shù)要點(diǎn)

①制備免疫脾細(xì)胞同一般血清的制備采用脾內(nèi)直接免疫

③細(xì)胞融合條件

②篩選骨髓瘤細(xì)胞

④選擇陽(yáng)性克隆無(wú)菌、溫度、瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例、50%PEG

融合前應(yīng)經(jīng)過(guò)含有特殊成分的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)H14根據(jù)抗原的性質(zhì)及所需單克隆抗體的功能，常用方法有RIA、ELISA、免疫熒光等，鑒定抗體的特異性、親和力、純度等。根據(jù)抗原的性質(zhì)及所需單克隆抗體的功能，15

克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體。要盡早進(jìn)行、反復(fù)篩選。因初期雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆可獲得穩(wěn)定的雜交瘤。常用有限稀釋法，按每孔一個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中。⑤克隆化克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體。要盡早進(jìn)行、16⑥單克隆抗體的制備大量生產(chǎn)分體內(nèi)和體外兩種方法，目前以體內(nèi)法為主。先給小鼠腹腔注射降植烷，造成無(wú)菌性腹膜炎，7天后將雜交瘤注入小鼠腹腔，10—14天后從小鼠腹腔獲得高濃度的單克隆抗體。⑥單克隆抗體大量生產(chǎn)分體內(nèi)和體外兩種方法，目前以體內(nèi)法為主。17單克隆抗體制備技術(shù)課件18接種小鼠腹腔收集腹水接種于微孔營(yíng)養(yǎng)板，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)免疫小鼠（融合前3—4周）骨髓瘤細(xì)胞強(qiáng)化免疫（融合前3—4天）融合前2—4周復(fù)蘇培養(yǎng)取脾制成細(xì)胞懸液(融合當(dāng)天）

收集對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞融合（PEG）陽(yáng)性孔再次克隆化克隆擴(kuò)大培養(yǎng)收集上清收獲抗體雜交瘤細(xì)胞凍存于液氮檢測(cè)抗體接種小鼠腹腔收集腹水接種于微孔營(yíng)養(yǎng)板，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)免19三、單克隆抗體的應(yīng)用可大量生產(chǎn)且穩(wěn)定性好特異性強(qiáng)純度高效價(jià)高無(wú)血清交叉反應(yīng)1.McAb的優(yōu)點(diǎn)：三、單克隆抗體的應(yīng)用可大量生產(chǎn)且穩(wěn)定性好特異性強(qiáng)純度高效價(jià)高202.McAb的應(yīng)用（5）細(xì)胞因子測(cè)定

放射免疫酶免疫熒光免疫免疫組化試劑盒（1）病原微生物抗原、抗體的檢測(cè)（2）腫瘤抗原的檢測(cè)（3）免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)（4）激素測(cè)定醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷試劑2.McAb的應(yīng)用（5）細(xì)胞因子測(cè)定放射免疫酶21（2）放射免疫顯像：將放射性標(biāo)記物與McAb連接，注入患者體內(nèi)可進(jìn)行放射免疫顯像，以診斷早期腫瘤的小轉(zhuǎn)移灶，或用于術(shù)前定位及術(shù)后追蹤觀察。（1）導(dǎo)向治療作用：用McAb或連接藥物、毒素的McAb治療腫瘤，稱“免疫導(dǎo)彈”。目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已獲滿意效果。蛋白質(zhì)的提純McAb作為配體，用于分離純化相應(yīng)抗原腫瘤導(dǎo)向治療和射免顯像技術(shù)（2）放射免疫顯像：將放射性標(biāo)記物與McAb連接，注入患者22第五節(jié)

基因工程抗體技術(shù)

基因工程抗體又稱重組抗體，是指應(yīng)用NDA重組及蛋白工程技術(shù)對(duì)編碼抗體的基因按不同的需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體。

第五節(jié)

基因工程抗體技術(shù)

23目前臨床上使用的單克隆抗體和多克隆抗體均為動(dòng)物源性抗體，具有免疫原性，在反復(fù)使用時(shí)常會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答而產(chǎn)生抗抗體，這大大限制了異源性抗體在人體內(nèi)的應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸可根據(jù)需要制備各種特異性的抗體，通過(guò)降低抗體的免疫原性，獲得更佳的生物學(xué)活性。

目前臨床上使用的單克隆抗體和多克隆抗體均為動(dòng)物源性抗24目前基因工程抗體技術(shù)主要包括兩部分內(nèi)容：一是應(yīng)用DNA重組和蛋白工程技術(shù)對(duì)已有的單抗進(jìn)行改造，包括人源化抗體、小分子抗體、雙價(jià)特異性抗體和抗體融合蛋白等的制備；二是用抗體庫(kù)技術(shù)篩選、克隆新的單抗。

目前基因工程抗體技術(shù)主要包括兩部分內(nèi)容：25一、人源化抗體（一）嵌合抗體嵌合抗體（chimericantibody）又稱人-鼠嵌合抗體，是從雜交瘤細(xì)胞中分離出鼠源單抗功能性V區(qū)基因，經(jīng)基因重組與人抗體C區(qū)基因連接成嵌合基因后，插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，再共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體分子。嵌合抗體保留了單抗對(duì)抗原的特異親和性，又含有人抗體C區(qū)的成分及其功能。

一、人源化抗體261．抗體V區(qū)基因的克隆

準(zhǔn)確獲得抗體可變區(qū)基因是制備嵌合抗體的關(guān)鍵所在。鼠源單抗VL和VH基因可通過(guò)以下兩種方法獲得：①用適當(dāng)?shù)奶结槒钠潆s交瘤細(xì)胞系的基因組文庫(kù)中篩選出V區(qū)基因；②用PCR方法從該細(xì)胞的RNA或mRNA中擴(kuò)增所需的V區(qū)基因。

1．抗體V區(qū)基因的克隆準(zhǔn)確獲得抗體可變區(qū)基因是制備嵌合272．抗體C區(qū)的選擇

抗體恒定區(qū)基因的序列相對(duì)恒定，比較容易得到，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。如選擇人IgG1或IgG3的恒定區(qū)可使嵌合抗體保留其介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC）和增強(qiáng)激活補(bǔ)體的能力,如果抗體只是用于激活和阻斷受體時(shí)，可選擇人IgG2或IgG4恒定區(qū)。

2．抗體C區(qū)的選擇283．表達(dá)載體的構(gòu)建

為了產(chǎn)生具有功能活性的人-鼠嵌合抗體，需要將編碼V區(qū)和C區(qū)的基因插入表達(dá)載體。

構(gòu)建表達(dá)載體的方法主要有二種：①分別構(gòu)建表達(dá)VL和VH基因的載體，用兩個(gè)載體分別帶上不同的標(biāo)記基因，通過(guò)二次轉(zhuǎn)染（將載體DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)染）選擇獲得嵌合抗體基因的細(xì)胞；②將VL和VH基因構(gòu)建于同一載體中，這樣雖然增加了重組體構(gòu)建的難度，但可提高轉(zhuǎn)染的成功率，同時(shí)增加表達(dá)量。

3．表達(dá)載體的構(gòu)建為了產(chǎn)生具有功能活性的人-鼠嵌合抗體294．表達(dá)

嵌合抗體的重組基因一般利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞等進(jìn)行表達(dá)。因?yàn)榭贵w分子需要經(jīng)過(guò)正確的裝配和加工等過(guò)程才能維持其生物學(xué)功能，而原核細(xì)胞等往往不能表達(dá)完整的抗體，只有哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠表達(dá)具有良好功能的抗體。

4．表達(dá)嵌合抗體的重組基因一般利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞等進(jìn)行表達(dá)30（二）改形抗體改形抗體（reshapedantibody，RAb）是應(yīng)用基因工程技術(shù)在嵌合抗體基礎(chǔ)上用人抗體可變區(qū)的骨架區(qū)序列取代鼠源單抗CDR以外的骨架區(qū)序列，重新構(gòu)成既有鼠源單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體，該抗體對(duì)人體幾乎無(wú)免疫原性。

（二）改形抗體31二、小分子抗體小分子抗體指分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段。它的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為：①免疫原性低且分子量小，易于穿透血管或組織到靶細(xì)胞部位，可用于免疫治療；②可在大腸桿菌等原核細(xì)胞中表達(dá)，降低生產(chǎn)成本；③不含F(xiàn)C段，不會(huì)與帶有FC段受體的細(xì)胞結(jié)合，副作用??；④半衰期短，有利于中和并及時(shí)清除毒素。二、小分子抗體小分子抗體指分子量較小但具有抗原結(jié)合32（一）FabFab段由一條完整的L鏈以及H鏈的V區(qū)和CH1區(qū)組成，具有與完整抗體相同的抗原結(jié)合特性，但只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。

小分子抗體包括：抗原結(jié)合片段（Fab）、

可變區(qū)片段（Fv）

單鏈抗體

（singlechainFv，ScFv）等。

（一）Fab小分子抗體包括：抗原結(jié)合片段（Fab）、

33（二）Fv和ScFvFv和ScFv是用基因工程技術(shù)構(gòu)建的抗體片段。

Fv是抗體分子中保留抗原結(jié)合部位的最小功能性片段，若將抗體VL和VH通過(guò)連接肽連接為單一的肽鏈則稱為單鏈抗體（ScFv）。其特點(diǎn)為：分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性低、能較好的保持親和性并易于進(jìn)行遺傳改造。

（二）Fv和ScFv34（三）

單域抗體又稱VH結(jié)構(gòu)域片段，由單個(gè)抗體VH功能區(qū)構(gòu)成。一般是將抗體VH功能區(qū)基因通過(guò)基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)所得到的抗體片段。它與相應(yīng)抗原結(jié)合的親密程度與完整抗體的作用相似，但單域抗體的親和力比完整抗體下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

（三）

單域抗體35三、雙特異性抗體雙特異性抗體（bispecificantibody，BsAb）又稱雙功能抗體。它不同于天然抗體，其兩個(gè)抗原結(jié)合部位具有不同的特異性，可以同時(shí)與兩種不同特異性的抗原發(fā)生結(jié)合。BsAb可通過(guò)化學(xué)交聯(lián)法或?qū)煞N雜交瘤細(xì)胞融合而制備，也可采用基因工程技術(shù)制備。

三、雙特異性抗體36（一）化學(xué)交聯(lián)BsAb分別分離純化兩種不同抗原的單抗，先使Ig解離后，獲得單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體或其片段交聯(lián)起來(lái)。具體制備方法因?qū)嶒?yàn)室而異。此法易致抗體失活，其產(chǎn)物亦難以保證均質(zhì)性。

（一）化學(xué)交聯(lián)BsAb37（二）細(xì)胞工程BsAb是將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合產(chǎn)生二次雜交瘤。但后者所分泌的并非均一產(chǎn)物，兩套重鏈、輕鏈之間隨機(jī)重新組合的形式可多達(dá)10種?？赡軆H分泌兩種親本單抗，而無(wú)BsAb形成，也可能既分泌親本單抗又可分泌BsAb。BsAb在所有Ig形式中所占比例可為10%～50%不等。

（二）細(xì)胞工程BsAb38（三）基因工程BsAb一般采用抗體分子片段，如ScFv或Fab等，經(jīng)基因操作修飾后，或在體外組裝成為BsAb，或直接導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)為分泌型的BsAb。

（三）基因工程BsAb39四、抗體融合蛋白

抗體融合蛋白是指將抗體分子片段與其他蛋白融合所得到的產(chǎn)物。這種抗體融合蛋白具有多種生物學(xué)功能。例如將抗體Fab段或Fv與其他生物活性蛋白融合，就可將特定的生物學(xué)效應(yīng)導(dǎo)向靶部位；將ScFv與某些細(xì)胞膜蛋白融合，則可形成嵌合受體，賦予特定細(xì)胞以結(jié)合抗原的能力；若將非抗體蛋白與抗體分子的Fc段融合，可改善其藥代動(dòng)力學(xué)特性，并可使某些生物學(xué)活性與抗體的生物學(xué)功能相聯(lián)。

四、抗體融合蛋白

抗體融合蛋白是指將抗體分子片段與其他40五、抗體庫(kù)技術(shù)抗體庫(kù)技術(shù)是指用細(xì)菌克隆代替B細(xì)胞克隆來(lái)表達(dá)抗體譜。抗體庫(kù)技術(shù)的主要特點(diǎn)為：①方法簡(jiǎn)單快速，與單抗制備相比，既省去細(xì)胞融合之繁瑣，又避免動(dòng)物免疫之局限；②選擇范圍廣泛，抗體基因庫(kù)的抗原特異性可高達(dá)108～1010；③可模擬體內(nèi)免疫系統(tǒng)親和力成熟過(guò)程制備高親和力抗體；④無(wú)需人體免疫接種過(guò)程即可獲得特異性人抗體；⑤大規(guī)模生產(chǎn)方便。

五、抗體庫(kù)技術(shù)41抗體庫(kù)技術(shù)的主要步驟如下：①?gòu)慕?jīng)免疫或未經(jīng)免疫的B細(xì)胞中克隆全套抗體的VL和VH基因；②用PCR方法擴(kuò)增各種抗體輕鏈和重鏈基因片段后，將其隨機(jī)克隆入相應(yīng)的載體形成組合文庫(kù)；③轉(zhuǎn)化細(xì)菌，再?gòu)谋磉_(dá)產(chǎn)物中通過(guò)與抗原特異性結(jié)合的方式篩選出所需抗體并大量生產(chǎn)。

抗體庫(kù)技術(shù)的主要步驟如下：42思考題1.名詞解釋:McAb，克隆2.簡(jiǎn)述雜交瘤技術(shù)的原理及流程3.簡(jiǎn)述HAT培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分及其作用原理思考題1.名詞解釋:McAb，克隆43第四節(jié)單克隆抗體

第四節(jié)單克隆抗體

44

理化性狀高度均一、生物活性單一、只與一種抗原表位發(fā)生發(fā)應(yīng)、具有高度的特異性一、單克隆抗體的概念及特點(diǎn)概念：特點(diǎn)：

指由B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的,只識(shí)別抗原分子上一種抗原決定簇的抗體分子理化性狀高度均一、生物活性單一、只與一種抗原45由一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞分裂增殖，形成的單克隆所產(chǎn)生的抗體。二、雜交瘤技術(shù)的原理及流程克?。河梢粋€(gè)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性分裂增殖，形成的均一細(xì)胞集團(tuán)。單克隆抗體：由一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞分裂增殖，形成的單克隆所產(chǎn)生的抗體。46

B細(xì)胞雜交瘤1.雜交瘤技術(shù)的原理：致敏B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞B細(xì)胞雜交瘤分泌抗體能力無(wú)限繁殖能力融合B細(xì)胞雜交瘤1.雜交瘤技術(shù)的原理：致敏B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞47

是B細(xì)胞系惡性腫瘤，具有在體外長(zhǎng)期增殖的特性。

免疫脾細(xì)胞是經(jīng)過(guò)抗原誘導(dǎo)活化的脾細(xì)胞，主要是B淋巴細(xì)胞，它具有分泌抗體的能力。骨髓瘤細(xì)胞是B細(xì)胞系惡性腫瘤，具有在體外長(zhǎng)期增殖的特性。免疫48與B細(xì)胞融合后形成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，能無(wú)限增殖傳代和分泌特異性抗體缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)換酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的條件該具備骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)與B細(xì)胞有較高的融合率本身不合成Ig與B細(xì)胞融合后形成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，能無(wú)限增殖傳代和分泌特異492.細(xì)胞融合的方法融合劑融合法

聚乙二醇（PEG）（最常用）仙臺(tái)病毒溶血卵磷脂2.細(xì)胞融合的方法融合劑融合法聚乙二醇仙臺(tái)病毒溶血卵磷503.選擇性培養(yǎng)基的作用原理①HAT培養(yǎng)基是一種篩選B細(xì)胞雜交瘤的選擇性培養(yǎng)基，含有：次黃嘌呤（H）氨基蝶呤（A）胸腺嘧啶（T）3.選擇性培養(yǎng)基的作用原理①HAT培養(yǎng)基是一種篩選B細(xì)胞51輔助途徑

主要途徑HGPRTTK次黃嘌呤+胸腺嘧啶DNA

②細(xì)胞DNA生物合成途徑氨基酸

核苷酸

DNA葉酸輔助途徑主要途徑HGPRTTK次黃嘌呤+胸腺嘧啶DNA②52TK缺陷細(xì)胞+-HGPRT缺陷細(xì)胞+-雜交瘤細(xì)胞++

細(xì)胞類型正常培養(yǎng)基HAT培養(yǎng)基

③HAT培養(yǎng)基作用原理TK缺陷細(xì)胞+53HAT培養(yǎng)基中的氨基蝶呤為葉酸拮抗劑，故所有細(xì)胞的DNA合成主要途徑被阻斷，只能由輔助途徑合成DNA。

未融合的瘤細(xì)胞因缺乏HGPRT和TK，不能合成DNA，即不能生存而死亡。HAT培養(yǎng)基中的氨基蝶呤為葉酸拮抗劑，故所有細(xì)胞的DNA54只有融合的雜交瘤細(xì)胞從B細(xì)胞中獲得了HGPRT和TK，又能在體外培養(yǎng)繁殖，因而存活。未融合的B細(xì)胞不能在體外長(zhǎng)期生存而自然死亡只有融合的雜交瘤細(xì)胞從B細(xì)胞中獲得了HGPRT和TK，又能在554.制備單克隆抗體的技術(shù)流程（一）雜交瘤技術(shù)流程4.制備單克隆抗體的技術(shù)流程（一）雜交瘤技術(shù)流程56融合前應(yīng)經(jīng)過(guò)含有特殊成分的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)HGPRT或TK的活性。（二）技術(shù)要點(diǎn)

①制備免疫脾細(xì)胞同一般血清的制備采用脾內(nèi)直接免疫

③細(xì)胞融合條件

②篩選骨髓瘤細(xì)胞

④選擇陽(yáng)性克隆無(wú)菌、溫度、瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例、50%PEG

融合前應(yīng)經(jīng)過(guò)含有特殊成分的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù)H57根據(jù)抗原的性質(zhì)及所需單克隆抗體的功能，常用方法有RIA、ELISA、免疫熒光等，鑒定抗體的特異性、親和力、純度等。根據(jù)抗原的性質(zhì)及所需單克隆抗體的功能，58

克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體。要盡早進(jìn)行、反復(fù)篩選。因初期雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆可獲得穩(wěn)定的雜交瘤。常用有限稀釋法，按每孔一個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中。⑤克隆化克隆化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體。要盡早進(jìn)行、59⑥單克隆抗體的制備大量生產(chǎn)分體內(nèi)和體外兩種方法，目前以體內(nèi)法為主。先給小鼠腹腔注射降植烷，造成無(wú)菌性腹膜炎，7天后將雜交瘤注入小鼠腹腔，10—14天后從小鼠腹腔獲得高濃度的單克隆抗體。⑥單克隆抗體大量生產(chǎn)分體內(nèi)和體外兩種方法，目前以體內(nèi)法為主。60單克隆抗體制備技術(shù)課件61接種小鼠腹腔收集腹水接種于微孔營(yíng)養(yǎng)板，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)免疫小鼠（融合前3—4周）骨髓瘤細(xì)胞強(qiáng)化免疫（融合前3—4天）融合前2—4周復(fù)蘇培養(yǎng)取脾制成細(xì)胞懸液(融合當(dāng)天）

收集對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞融合（PEG）陽(yáng)性孔再次克隆化克隆擴(kuò)大培養(yǎng)收集上清收獲抗體雜交瘤細(xì)胞凍存于液氮檢測(cè)抗體接種小鼠腹腔收集腹水接種于微孔營(yíng)養(yǎng)板，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)免62三、單克隆抗體的應(yīng)用可大量生產(chǎn)且穩(wěn)定性好特異性強(qiáng)純度高效價(jià)高無(wú)血清交叉反應(yīng)1.McAb的優(yōu)點(diǎn)：三、單克隆抗體的應(yīng)用可大量生產(chǎn)且穩(wěn)定性好特異性強(qiáng)純度高效價(jià)高632.McAb的應(yīng)用（5）細(xì)胞因子測(cè)定

放射免疫酶免疫熒光免疫免疫組化試劑盒（1）病原微生物抗原、抗體的檢測(cè)（2）腫瘤抗原的檢測(cè)（3）免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)（4）激素測(cè)定醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷試劑2.McAb的應(yīng)用（5）細(xì)胞因子測(cè)定放射免疫酶64（2）放射免疫顯像：將放射性標(biāo)記物與McAb連接，注入患者體內(nèi)可進(jìn)行放射免疫顯像，以診斷早期腫瘤的小轉(zhuǎn)移灶，或用于術(shù)前定位及術(shù)后追蹤觀察。（1）導(dǎo)向治療作用：用McAb或連接藥物、毒素的McAb治療腫瘤，稱“免疫導(dǎo)彈”。目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已獲滿意效果。蛋白質(zhì)的提純McAb作為配體，用于分離純化相應(yīng)抗原腫瘤導(dǎo)向治療和射免顯像技術(shù)（2）放射免疫顯像：將放射性標(biāo)記物與McAb連接，注入患者65第五節(jié)

基因工程抗體技術(shù)

基因工程抗體又稱重組抗體，是指應(yīng)用NDA重組及蛋白工程技術(shù)對(duì)編碼抗體的基因按不同的需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體。

第五節(jié)

基因工程抗體技術(shù)

66目前臨床上使用的單克隆抗體和多克隆抗體均為動(dòng)物源性抗體，具有免疫原性，在反復(fù)使用時(shí)常會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答而產(chǎn)生抗抗體，這大大限制了異源性抗體在人體內(nèi)的應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸可根據(jù)需要制備各種特異性的抗體，通過(guò)降低抗體的免疫原性，獲得更佳的生物學(xué)活性。

目前臨床上使用的單克隆抗體和多克隆抗體均為動(dòng)物源性抗67目前基因工程抗體技術(shù)主要包括兩部分內(nèi)容：一是應(yīng)用DNA重組和蛋白工程技術(shù)對(duì)已有的單抗進(jìn)行改造，包括人源化抗體、小分子抗體、雙價(jià)特異性抗體和抗體融合蛋白等的制備；二是用抗體庫(kù)技術(shù)篩選、克隆新的單抗。

目前基因工程抗體技術(shù)主要包括兩部分內(nèi)容：68一、人源化抗體（一）嵌合抗體嵌合抗體（chimericantibody）又稱人-鼠嵌合抗體，是從雜交瘤細(xì)胞中分離出鼠源單抗功能性V區(qū)基因，經(jīng)基因重組與人抗體C區(qū)基因連接成嵌合基因后，插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，再共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體分子。嵌合抗體保留了單抗對(duì)抗原的特異親和性，又含有人抗體C區(qū)的成分及其功能。

一、人源化抗體691．抗體V區(qū)基因的克隆

準(zhǔn)確獲得抗體可變區(qū)基因是制備嵌合抗體的關(guān)鍵所在。鼠源單抗VL和VH基因可通過(guò)以下兩種方法獲得：①用適當(dāng)?shù)奶结槒钠潆s交瘤細(xì)胞系的基因組文庫(kù)中篩選出V區(qū)基因；②用PCR方法從該細(xì)胞的RNA或mRNA中擴(kuò)增所需的V區(qū)基因。

1．抗體V區(qū)基因的克隆準(zhǔn)確獲得抗體可變區(qū)基因是制備嵌合702．抗體C區(qū)的選擇

抗體恒定區(qū)基因的序列相對(duì)恒定，比較容易得到，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。如選擇人IgG1或IgG3的恒定區(qū)可使嵌合抗體保留其介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC）和增強(qiáng)激活補(bǔ)體的能力,如果抗體只是用于激活和阻斷受體時(shí)，可選擇人IgG2或IgG4恒定區(qū)。

2．抗體C區(qū)的選擇713．表達(dá)載體的構(gòu)建

為了產(chǎn)生具有功能活性的人-鼠嵌合抗體，需要將編碼V區(qū)和C區(qū)的基因插入表達(dá)載體。

構(gòu)建表達(dá)載體的方法主要有二種：①分別構(gòu)建表達(dá)VL和VH基因的載體，用兩個(gè)載體分別帶上不同的標(biāo)記基因，通過(guò)二次轉(zhuǎn)染（將載體DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)染）選擇獲得嵌合抗體基因的細(xì)胞；②將VL和VH基因構(gòu)建于同一載體中，這樣雖然增加了重組體構(gòu)建的難度，但可提高轉(zhuǎn)染的成功率，同時(shí)增加表達(dá)量。

3．表達(dá)載體的構(gòu)建為了產(chǎn)生具有功能活性的人-鼠嵌合抗體724．表達(dá)

嵌合抗體的重組基因一般利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞等進(jìn)行表達(dá)。因?yàn)榭贵w分子需要經(jīng)過(guò)正確的裝配和加工等過(guò)程才能維持其生物學(xué)功能，而原核細(xì)胞等往往不能表達(dá)完整的抗體，只有哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠表達(dá)具有良好功能的抗體。

4．表達(dá)嵌合抗體的重組基因一般利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞等進(jìn)行表達(dá)73（二）改形抗體改形抗體（reshapedantibody，RAb）是應(yīng)用基因工程技術(shù)在嵌合抗體基礎(chǔ)上用人抗體可變區(qū)的骨架區(qū)序列取代鼠源單抗CDR以外的骨架區(qū)序列，重新構(gòu)成既有鼠源單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體，該抗體對(duì)人體幾乎無(wú)免疫原性。

（二）改形抗體74二、小分子抗體小分子抗體指分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段。它的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為：①免疫原性低且分子量小，易于穿透血管或組織到靶細(xì)胞部位，可用于免疫治療；②可在大腸桿菌等原核細(xì)胞中表達(dá)，降低生產(chǎn)成本；③不含F(xiàn)C段，不會(huì)與帶有FC段受體的細(xì)胞結(jié)合，副作用??；④半衰期短，有利于中和并及時(shí)清除毒素。二、小分子抗體小分子抗體指分子量較小但具有抗原結(jié)合75（一）FabFab段由一條完整的L鏈以及H鏈的V區(qū)和CH1區(qū)組成，具有與完整抗體相同的抗原結(jié)合特性，但只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。

小分子抗體包括：抗原結(jié)合片段（Fab）、

可變區(qū)片段（Fv）

單鏈抗體

（singlechainFv，ScFv）等。

（一）Fab小分子抗體包括：抗原結(jié)合片段（Fab）、

76（二）Fv和ScFvFv和ScFv是用基因工程技術(shù)構(gòu)建的抗體片段。

Fv是抗體分子中保留抗原結(jié)合部位的最小功能性片段，若將抗體VL和VH通過(guò)連接肽連接為單一的肽鏈則稱為單鏈抗體（ScFv）。其特點(diǎn)為：分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性低、能較好的保持親和性并易于進(jìn)行遺傳改造。

（二）Fv和ScFv77（三）

單域抗體又稱VH結(jié)構(gòu)域片段，由單個(gè)抗體VH功能區(qū)構(gòu)成。一般是將抗體VH功能區(qū)基因通過(guò)基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)所得到的抗體片段。它與相應(yīng)抗原結(jié)合的親密程度與完整抗體的作用相似，但單域抗體的親和力比完整抗體下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

（三）

單域抗體78三、雙特異性抗體雙特異性抗體（