生物化學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)展-血管新生平衡調(diào)控

血管新生的平衡調(diào)控：87332128gaogq

問題的提出和思考☆機(jī)體在什么情況下需要長出新的血管？☆機(jī)體哪些部位沒有血管，為什么？☆腫瘤生長的必要條件是什么？☆腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件是什么？☆腫瘤治療有哪些基本策略？☆的主要 原因是什么？第一節(jié)血管新生和血管增生性疾病一、血管新生的概念：☆

從已存在的毛細(xì)血

上大量生成新生血管的過程☆可來源于局部內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞/內(nèi)皮祖細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞☆血管新生的過程：多步驟復(fù)雜的過程，包括選擇性降解血管基膜和周圍的細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、最后形成毛細(xì)血管芽。和促☆

在

和外周循環(huán)閉塞情況下具有恢復(fù)進(jìn)傷口愈合的積極作用☆腫瘤等血管增生性疾病的主要病理特征之一和其他血☆以血管增生為靶點(diǎn)正成為治療管增生性疾病的研究熱點(diǎn)腫瘤血管增生與腫瘤生長☆實(shí)體性腫瘤的生長依賴于血管增生☆新生血管長入前呈線性增長（血管前期或浸潤前期）☆新生血管長入腫瘤即呈指數(shù)生長（腫瘤血管期）☆新生血管長入不僅提供腫瘤生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣以及帶走代謝廢物，還為腫瘤細(xì)胞提供生長因子如FGF-1和FGF-2等☆機(jī)械性阻斷或應(yīng)用血管增生抑制劑 腫瘤的顯著抑制甚至完全

腫瘤的生長血管增生與腫瘤轉(zhuǎn)移☆血管生成不僅是腫瘤生長所必需，而且還是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移所需要☆新生毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞能膠原酶和組織纖溶酶原激活物，促進(jìn)基質(zhì)降解，便于腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血管和向鄰近基質(zhì)擴(kuò)散☆血管前期，循環(huán)中極少有腫瘤細(xì)胞，但在腫瘤血管化后，腫瘤細(xì)胞才持續(xù)出現(xiàn)在循環(huán)中史超過十新生血管性眼病☆

眼表新生血管

變?nèi)?000萬，中國100萬☆

性視網(wǎng)膜病變有

患者近兩千萬人，年者約50%并發(fā)視網(wǎng)膜病☆新生血管性眼病是西方國家致盲的首位因素第二節(jié)血管增生的分子機(jī)制一、新生血管形成的平衡失調(diào)假說☆性視網(wǎng)膜病變一、新生血管形成的平衡失調(diào)假說※根據(jù)這一理論，抑制新生血管的策略有：

拮抗血管生成刺激因子

應(yīng)用血管生成抑制因子以糾正病理性平衡失調(diào)※拮抗血管生成刺激因子拮抗血管增生刺激因子主要圍繞對VEGF的阻斷

中和VEGF的單克隆抗體已進(jìn)入臨床使用☆Bevacizumab

（商品名:Avastin）☆Genentech公司開發(fā)的人源VEGF單克隆抗體☆FDA

批準(zhǔn)上市☆用于一線治療晚期結(jié)直腸癌☆是世界上首個(gè)批準(zhǔn)上市的VEGF抑制劑獒合VEGF受體2的單克隆抗體進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)VEGF抗體、VEGF受體的螯合蛋白及反義寡核苷酸顯著抑制視網(wǎng)膜和虹膜血管增生拮抗血管增生刺激因子主要圍繞對VEGF的阻斷可溶性VEGF-R

?酪氨酸激酶抑制劑（RTKs）☆廣譜的抗腫瘤效果☆SU5416

，VEGFR-2（KDR/Flk-1）的RTKs☆對VEGFR-2、FGFR-1和PDGFR-β均有抑制作用☆SU5416顯示了廣泛的抗腫瘤活性，但毒副作用嚴(yán)重存在問題：只阻斷VEGF的作用僅能部分抑制腫瘤和血管增生性眼病的血管新生；阻斷VEGF的正常生理作用；肺栓塞、心肌梗死和腦血管意外等嚴(yán)重毒副反應(yīng)※應(yīng)用血管生成抑制因子目前國外有300多種抑制血管增生的藥物處于臨床試驗(yàn)的不同階段，這類藥物大致可以分為5大類：抑制基底膜降解的藥物；直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞的藥物；抑制血管生長因子活化的藥物；抑制內(nèi)皮細(xì)胞整合素/生存信號的藥物；其他機(jī)理不明但有抗血管增生作用的藥物※作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)源性抑制因子是研發(fā)焦點(diǎn)：作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，副作用小，不易產(chǎn)生抗藥性僅作用于增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制新生血管，對已有正常血管無影響研究最早的兩個(gè)內(nèi)源性血管增生抑制因子：☆A(yù)ngiostatin、Endostatin的發(fā)現(xiàn)☆抑制腫瘤生長☆1999年批準(zhǔn)治療實(shí)體瘤I期臨床試驗(yàn)（EntraMed

公司）☆2002年終止James

Watson

：人類將在兩年內(nèi)治愈血管增生抑制因子的發(fā)現(xiàn)（angiostatin

&endostatin)angiostatin—

Lewis

lungcarcinoma（小鼠Lewis

肺癌）endostatin—hemangioendothelioma(小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤)機(jī)體可以產(chǎn)生內(nèi)源性抑制因子——endostatin,

angiostatin,

K5,

PEDF…內(nèi)源性抑制因子的地位和作用機(jī)制尚不明確Judah

Folkman.

Nature

review,6:273-286,

2007.基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用nch

to

Bedside)※Endostatin作用受到質(zhì)疑：

兩個(gè)獨(dú)立的課題組將Endostatin

導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，在體內(nèi)得到了高表達(dá)，但高表達(dá)的Endostatin既未能阻斷血管增生也未能抑制腫瘤生長

在 已進(jìn)行的不到200例

中至今無一例治愈或效果顯著的報(bào)告，臨床試驗(yàn)結(jié)果不理想FDA取消了擴(kuò)大Endostatin臨床試驗(yàn)例數(shù)的計(jì)劃2002年3月Science

評論“setbacks

for

endostatin”，認(rèn)為Endostatin的作用仍具有不確定性，尚需

的研究來明確Endostatin自身及其作用機(jī)制2006年sFDA批準(zhǔn)恩度（Eｎｄｏｓｔａｒ）上市※現(xiàn)有內(nèi)源性抑制因子存在問題：

分子量大，性質(zhì)不穩(wěn)定；原核表達(dá)體系多為無活性、不溶性蛋白沉淀治療較直接應(yīng)用活性多肽的途徑效果差分子機(jī)制不明確：結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系尚需深入研究；特異性受體尚未分離出來；胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不清臨床應(yīng)用抗血管治療的耐藥性靶向性較差、血管擬態(tài)、腫瘤微環(huán)境的改變、多種刺激因子等抗血管治療的副作用阻斷VEGF的正常生理作用；肺栓塞、心肌梗死和腦血管意外等嚴(yán)重毒副反應(yīng)血管抑制因子臨床療效不明顯臨床應(yīng)用的新問題和對策（

Bedside

to

Bench)的新問題：二、血管新生刺激因子☆血管新生刺激因子包括表皮生長因子（EGF），堿性成纖維生長因子（bFGF），轉(zhuǎn)化生長因子（TGF），血小板源生長因子（PDGF），胰島素樣生長因子（IGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等☆

VEGF作為最強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性刺激因子，在多種血管增生性眼病中起 作用☆以VEGF作為刺激因子的代表，介紹其在血管生成中的作用和分子機(jī)制1.

VEGF結(jié)構(gòu)特征，長度為☆VEGF在

上定位于6p，為單一14kb，含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子☆VEGF通過兩對鏈間二硫鍵形成反平行同型二聚體☆轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA可剪接成5種異構(gòu)體，分別為VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206☆異構(gòu)體之間功能上的差異表現(xiàn)為它們與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中肝素結(jié)合活性不同☆VEGF165具有肝素結(jié)合活性，約50%以可溶性形式分泌至細(xì)胞外，其余的部分和細(xì)胞膜或基底膜上含有肝素或硫酸乙酰肝素的蛋白多糖緊密結(jié)合☆VEGF165這種可溶與不溶的形式符合機(jī)體對血管形式應(yīng)答調(diào)節(jié)機(jī)制，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，即以較大限度的可溶性形式存在；一旦血管形成應(yīng)答過度，又以不溶形式結(jié)合到基膜上，減少其危害；☆VEGF165體內(nèi)表達(dá)豐度最高，也是體外研究中主要的生物學(xué)活性形式蛋白，不與肝素結(jié)合，易☆VEGF121為可溶性擴(kuò)散☆VEGF189和VEGF206活性相同，與肝素結(jié)合活性很高，幾乎完全與細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，在細(xì)胞外液

中測不到溶解游離形式☆雖然5種異構(gòu)體均能誘導(dǎo)體內(nèi)的血管生成，但不同情況下每種異構(gòu)體發(fā)揮不同的優(yōu)勢，何種類型的細(xì)胞產(chǎn)生何種VEGF異構(gòu)體尚待研究2.VEGF受體結(jié)構(gòu)特征☆VEGF受體主要有兩種：VEGF受體1（fms-liketyrosine

kinase,

Flt-1）和VEGF受體2（fetalliver

kinase

1/kinase

insert

-containing

receptor，F(xiàn)lk-1/KDR）☆表達(dá)基本局限于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，都為穿膜蛋白，含有7個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白樣功能區(qū)，一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶功能區(qū)☆VEGF與其受體結(jié)合，通過VEGFRs二聚化，受體酪氨酸激酶激活，促使底物磷酸化而產(chǎn)生化學(xué)趨化性、促進(jìn)細(xì)胞有絲、肌動(dòng)蛋白重組、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、提高血管通透性、改變細(xì)胞外基質(zhì)的作用☆VEGF與受體的結(jié)合力與受體是否是聚合形式密切相關(guān)，聚合是強(qiáng)大親和力產(chǎn)生的重要因素☆KDR是VEGF發(fā)揮主要功能的受體。VEGF與其受體結(jié)合的能力依賴于細(xì)胞表面肝素或肝素樣分子的存在☆KDR在與VEGF的親和力、結(jié)合VEGF后所引起的受體磷酸化作用、結(jié)合后所引起的細(xì)胞反應(yīng)、與肝素的結(jié)合力等許多方面作用都強(qiáng)于F1t-13.低氧對VEGF表達(dá)的影響及低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）的調(diào)控作用☆低氧主要通過活化VEGFmRNA穩(wěn)定性，上調(diào)VEGF的轉(zhuǎn)錄和增加VEGF表達(dá)從而促進(jìn)血管新生☆低氧或缺血條件下，HIF-1能增加一些

如紅細(xì)胞生成素(EPO)和VEGF 的轉(zhuǎn)錄，增加氧輸送能力；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和糖酵解酶 的轉(zhuǎn)錄；胰島素生長因子

的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞的生存☆HIF-1是由α和β亞單位組成的異源二聚體，其中

HIF-1α是專一調(diào)節(jié)O2的HIF-1亞單位，決定了HIF-1的活性調(diào)控VEGF表達(dá)的信號通路4.VEGF在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路5.VEGF及其受體在血管新生中的作用和機(jī)制☆通過增強(qiáng)血管的滲透性,引起血漿蛋白(主要是纖維蛋白原)的外滲,為腫瘤細(xì)胞的生長和新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供了最佳的基質(zhì)☆與受體結(jié)合,發(fā)揮其特異性的內(nèi)皮細(xì)胞原的活性，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖☆VEGF提高血漿活化因子和尿激酶類纖維蛋白原活化因子表達(dá)，促進(jìn)蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶和組織因子的活化，具有促進(jìn)血管構(gòu)建作用,誘導(dǎo)血管形成☆腫瘤細(xì)胞 的VEGF以旁 的形式作用于血管內(nèi)皮上的特異受體,誘導(dǎo)血管新生促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移☆VEGF可能通過自促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自身的生長：某些腫瘤細(xì)胞自身確有一定量的VEGF表達(dá)；在Kaposi肉瘤細(xì)胞中檢測到高水平的flt-1和KDR；抑制VEGF的表達(dá)能顯著抑制瘤細(xì)胞的生長三、血管新生抑制因子內(nèi)源性血管生成抑制因子：☆

蛋白質(zhì) 中的一些成員絲氨酸蛋白酶抑制劑 （serine

proteinaseinhibitor，serpin

super

family）中的PEDF，KBP，antithrombin，maspin等。重點(diǎn)介紹PEDF☆蛋白質(zhì)大分子前體的水解產(chǎn)物

angiostatin，K5，endostatin，tumstatin等重點(diǎn)介紹K5PEDF（pigment

epithelium-derived

factor）☆

由Tombran-Tink從 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出來，視網(wǎng)膜基質(zhì)中以較高濃度存在17p13,但不具備抗蛋☆分子量

50KD，

位于☆屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑白酶活性☆神經(jīng)親和保護(hù)作用；抑制血管增生；代謝調(diào)節(jié)……1.PEDF的抑制血管增生活性☆Dawson于1999年首次發(fā)現(xiàn)PEDF具有很強(qiáng)的抑制血管增生的作用,是維持角膜，玻璃體等眼內(nèi)組織無血管形成的主要原因☆是血管生成最有效的天然抑制劑，比血管抑素、內(nèi)皮抑素活性更高☆Gao等在視網(wǎng)膜新生血管大鼠模型中檢測到視網(wǎng)膜組織VEGF的含量較正常對照組升高5倍，PEDF的

含量下降了2倍，顯示出在視網(wǎng)膜病理新生血管形成中，血管抑制劑與血管刺激劑之間的平衡被打破2.PEDF抗血管增生機(jī)制☆PEDF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡☆體外實(shí)驗(yàn),人血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中凋亡陽性細(xì)胞數(shù)隨PEDF劑量的增加而增加☆體內(nèi)實(shí)驗(yàn),PEDF處理的高氧動(dòng)物的視網(wǎng)膜凋亡內(nèi)皮細(xì)胞與未處理相比高8倍，對已存在的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞無反應(yīng)，說明PEDF僅對活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞起作用☆PEDF與膠原蛋白－?和肝素有高度親和性，提示PEDF可能作用于細(xì)胞粘附分子，即靶向細(xì)胞外基質(zhì)來調(diào)節(jié)其抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的活性☆與其他血管因子的相互作用：PEDF下調(diào)VEGF表達(dá)；K5上調(diào)PEDF、下調(diào)VEGF表達(dá)☆機(jī)制尚有許多疑問：是否存在PEDF特異性受體；PEDF抑制內(nèi)皮細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等3.PEDF與腫瘤的關(guān)系☆PEDF抗腫瘤活性：誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化；抑制血管生成；促進(jìn)Schwann

細(xì)胞及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生

的PEDF，可能是神經(jīng)母細(xì)胞瘤自然好轉(zhuǎn)的緣故☆

癌組織中PEDF含量顯著下降或缺如☆在黑色素瘤細(xì)胞系中首次檢測到PEDF

的缺失17p13.1,腫瘤可能是抑癌☆PEDF

均位于發(fā)生與該區(qū)域關(guān)系密切,提示PEDF或是腫瘤相關(guān)4.PEDF治療血管增生性眼病☆

lmach等腹腔內(nèi)注射重組PEDF顯著抑制了早產(chǎn)

性視網(wǎng)膜?。≧OP）小鼠模型的視網(wǎng)膜血管增生☆Mori等在三種不同的眼血管增生模型中眼內(nèi)輸送

AdPEDF取得顯著療效：激光誘導(dǎo)的色素膜損傷所致脈絡(luò)膜新生血管(CNV)鼠模型；rhodopsin/VEGF轉(zhuǎn)鼠；ROP小鼠模型☆A(yù)dPEDF眼內(nèi)輸送不僅抑制視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管形成，還可逆轉(zhuǎn)已形成的新生血管☆FDA批準(zhǔn)PEDF

治療進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)（2003年）K5（plasminogen

kringle

5）1.K5結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：☆人纖溶酶原是分子量為92

kD的糖蛋白，由5個(gè)通過二硫鍵連接的聯(lián)環(huán)結(jié)構(gòu)域（kringle）構(gòu)成，每個(gè)聯(lián)環(huán)結(jié)構(gòu)域由80個(gè)氨基酸組成，含3個(gè)二硫鍵，形成雙環(huán)狀構(gòu)象☆纖溶酶原水解片段K1、K2、K3、K5、K1-3、K1-4、K2-3等均能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生，K4不具有抗增殖活性，卻有明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用☆K1-4即血管抑制素，angiostatin☆K5是抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移最有效的纖溶酶原片斷☆K5是血纖溶酶原中與血管抑素相連的聯(lián)環(huán)結(jié)構(gòu)域，由80個(gè)氨基酸殘基組成，包含3個(gè)二硫鍵，分子量為16kD☆在結(jié)構(gòu)上與其它4個(gè)聯(lián)環(huán)區(qū)相似，具有較高的同源性，其中與K1同源性最高，為57.5％。K5與K1結(jié)構(gòu)上的相似性可能與它們都有較強(qiáng)的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性相關(guān)☆完整的kringle結(jié)構(gòu)是保證血管抑素抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖所必需☆kringle結(jié)構(gòu)對K5活性的影響則有不同的看法2.K5作用的分子機(jī)制☆kringle5抗血管增生的研究是建立在血管抑素基礎(chǔ)之上，二者可能有相似的抗血管增生的分子機(jī)制☆K5能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使細(xì)胞周期停滯，并能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡☆K5選擇性抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移是其抗血管增生的重要環(huán)節(jié)☆K5能通過抑制HIF-1和p42/p44MAPK的活性下調(diào)內(nèi)源性血管刺激因子VEGF的表達(dá)☆提高內(nèi)源性血管增生抑制因子PEDF的表達(dá)，有利于已打破的血管增生平衡恢復(fù)正常，K5對正負(fù)血管因子的調(diào)節(jié)是其抗血管增生的主要機(jī)制☆內(nèi)皮細(xì)胞上是否存在K5的特異性受體目前看法不一：有研究表明在培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞上沒有檢測到K5特異性受體，同時(shí)K5也不能

與VEGF受體的相互作用；最近有 認(rèn)為人內(nèi)皮細(xì)胞上電壓依賴性陰

離子通道VDAC和HSP

成員GRP78是K5結(jié)合的受體☆K5和血管抑素抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖機(jī)制可能通過細(xì)胞外基質(zhì)中某些多糖分子如整合素來發(fā)揮作用，因?yàn)檎纤厥蔷S持MAPK活性所必需的☆K5抑制炎癥細(xì)胞 細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、腫瘤壞死因子及白細(xì)胞介素-2等☆K5降低血管通透性研究工作介紹

建立了人和牛原代培養(yǎng)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和外膜細(xì)胞（pericytes）的培養(yǎng)方法。HRCECPericyte. J

Biol

Chem,

277(11),

9492-9497,

2002.

首次建立了固定氧濃度誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管增生模型，該模型可用于所有以血管增生為治療靶點(diǎn)的藥物活性的篩選并進(jìn)行定性定量分析。NormalRetinopathy. FEBS

Lett,

489,270-276,2001.NormalRetinopathyGao

et

al.FEBSLett,489,270-276,2001.. FEBS

Lett,

489,270-276,2001.. FEBS

Lett,

489,270-276,2001.

首次發(fā)現(xiàn)大鼠對氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管增生存在種系（strain）差異并闡明了這種差異形成的分子機(jī)制。P12P14P18SDBN. Diabetes,51(4),

1218-1225,2002.600400200080010001200VEGF/PEDF

Ratio(%

of

Control)P12P14Postnatal

DaysP16BN

ratsSD

rats. Diabetes,51(4),

1218-1225,2002.Strain

Difference

in

VEGF:PEDF

Ratio

證明K5在體外實(shí)驗(yàn)中具有特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用并能在視網(wǎng)膜血管增生大鼠模型中預(yù)防和阻斷新生血管的形成0204080160806040200100NormoxiaHypoxiaK5(nM)Viable

Cells

(x10,000)Zhang

et

al.

Diabetologia,

44,757-765,

2001.K5

on

HRCEC120PBS

InjectionK5

InjectionGaoet

al.

J

Biol

Chem,

277(11),9492-9497,

2002.

發(fā)現(xiàn)K5具有上調(diào)PEDF并同時(shí)下調(diào)VEGF的作用，糾正了病理性低氧狀態(tài)下內(nèi)源性血管增生抑制因子和刺激因子之間的平衡失調(diào)。同時(shí)明確了K5下調(diào)

VEGF的信號傳導(dǎo)通路通過抑制MAPkinase的活性和HIF－1α的核轉(zhuǎn)位-actinVEGFN

H

40

80

160

320

640300250200150100500VEGF

(%

of

Control)K5

on

VEGF

and

PEDF

Expression

under

HypoxiaH

+

K5

(nM)N

H

40

80

160H+

K5

(nM)6005004003002001000PEDF-actinN

H

40

80

160K5

(nM)N

H

40

80

160

320

640K5

(nM)PEDF

(%

of

Control)28204933kDaN

N+K5H

H+K5-actinVEGF6050403020100N+K5H+K5VEGF

(%

of

Control)78464933kDaN

N+K5H

H+K5PEDF-actin350300250200150100500PEDF

(%

of

Control)N+K5H+K5K5

Regulates

VEGF

and

PEDF

in

the

Retina2.37kb4.418s

RNA140120100806040200VEGF

mRNA(

%

of

Control)kb2.371.3518s

RNA200180160140120100806040200PEDF

mRNA(%

of

Control)PEDFVEGFNormalP<0.01P<0.05PBS K5

PBS

K5RetinopathyNormal

RetinopathyPBS K5

PBS

K5Gaoet

al.

J

Biol

Chem,

277(11),

9492-9497,

2002.Regulation

of

VEGF

and

PEDF

mRNA

Levels

by

K5Normal

Retinopathy Normal

RetinopathyA

positive

feedback

loop

of“VDAC1-AKT-GSK3β-VDAC1”Gu

etal.

Apoptosis,

2012; Li

et

al.

J

Biol

Chem,

2014.※

K5突變體具有更強(qiáng)的抑制視網(wǎng)膜和腫瘤血管新生的作用Structure

of

K5

andits

mutantsK5K5

mut

1K5

mut

2M12

3M12

33

M1

2208001440066200430003100097400M:

protein

marker；1:

the

purified binant

proteins；2:

samples

after

IPTG

induction；3:

samples

before

IPTG

induction.SDS-PAGEysis

of

threebinant

proteinsK5K5

mut1K5

mut2M123144002080097400662004300031000M:

protein

marker；1:purified binant

proteins

of

K5；2:

purifiedbinant

proteins

of

K5

mut1；3:

purified binant

proteins

of

K5

mut2.SDS-PAGE

and

western-blotysisSDS-PAGEysisWestern-blotysisMALDI-TOF

mass

spectraK5K5

mut1K5

mut2Cells

were

treated

with

the binant

K5

and

K5

mut1

at

concentrations

asindicated

for

72

h.

The

viable

cells

were fied

using

the

MTT

assay

(n

=5,*P<0.05,

**P<0.01

vs

control).*********

**Inhibition

of

endothelial

cell

proliferationAnti-migratory

effect

ofK5 and

mut1

on

HRCEC

cells110100908070605040302010controlK5K5

mut1control

K5

K5

mut1Cell

migration

was

examined

in

a

modified

Boyden

Chamber

assay

with

1280

nmol/LK5

or

K5

mut1

treatment.

(

n

=

3.

*

P

<

0.05

vs

control.

as

a

percentage

ofinhibition)Cell

number(%

of

control)**A:

left

retina

from

OIR

ratafter

PBS

injection

as

the

control

ofthe

K5

-treatedgroup.

B:

right

retina

from

OIR

rat

after

the

K5

injection.

C:

leftretina

from

OIR

rat

after

PBS

injection

as

the

controlofthe

K5

mutant-treated

group.

D:

right

retina

from

normal

rat

after

K5-mutant

injection.Inhibition

of

ischemia-induced

retinalneovascularizationABCDPBSK5(100μg)K5mut1(100μg)K5mut2(100μg)60402000viablecells(%

oABCDThe

production

and

anti-angiogenic

activity

assay

of

K5mut3binant

protein.Circular

Dichroism

Spectra

of

K5

and

its

mutants.Li

C,

et

al.

Cornea,

2012.Li

C,

et

al.

Cornea,

2012.以血管生成為靶點(diǎn)治療肝癌的新型工程候選藥物（科技部新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)：候選藥物研究，150萬元，

：2009ZX09103-642）：以血管生成為靶點(diǎn)治療肝癌的新型工程候選藥物臨床前研究（科技部新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)滾動(dòng)項(xiàng)目，450萬元，

2013ZX09102-053）

發(fā)現(xiàn)一種新的血管增生抑制因子-Kallikrein-binding

protein（KBP）

KBP抑制視網(wǎng)膜血管增生、降低血管通透性

KBP抑制胃癌、肝癌生長轉(zhuǎn)移的作用

機(jī)制：KBP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF；抑制VEGF與受體結(jié)合Gao

etal.

Diabetologia,

46,

689-698,

2003Gao

etal.

Diabetologia,

46,

689-698,

2003Gao

etal.

Diabetologia,

46,

689-698,

2003KBP

inhibits

growth

of

transplanted

human

gastric

carcinomaC.

A age

of

61.4%

suppression

of

primary

tumor

growthD.

Tumor

growth

curvesKBP

inhibits

growth

and

metastasis

of

orthotopic

humangastric

carcinomaB.

A age

of

52.3%suppression

of

primary

tumorgrowth

after

6

weeks

treatmentC.

Representative

macroscopicaland

microscopical

pictures

formetastases

of

liver

(1

and

4),

lymphnode

(2

and

5)

and

perito

(3and

6).KBP

reduces

angiogenesis

of

heterotopic

and

orthotopic

gastric

tumor

tissuesKBP

inhibits

tumor

growth

in

grafted

hepatocarcinomamice(A)

Tumor

tissues

treated

with

PBS

(Up)

and

KBP

(Bottom)

at

day

15

fromthe