章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交演示文稿

章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交演示文稿第一頁，共五十一頁。（優(yōu)選）第九章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交第二頁，共五十一頁。二、原生質(zhì)體的分離1.材料的選取

根、莖、葉、花、果實(shí)、種子及愈傷組織和懸浮細(xì)胞等都可作為分離原生質(zhì)體的材料。但要獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體，應(yīng)選用生長旺盛、生命力強(qiáng)的組織。材料的生理狀態(tài)是原生質(zhì)體質(zhì)量的決定因素之一，實(shí)踐證明水肥條件、生長季節(jié)、植物年齡、光照等都顯著影響原生質(zhì)體的獲得和活力。用懸浮細(xì)胞為材料時(shí)應(yīng)每隔3-5天繼代一次，使細(xì)胞處于旺盛生長狀態(tài)。一般在繼代后的第三天分離原生質(zhì)體。用葉片作材料時(shí)，一般選用剛展開的幼嫩葉片。此外植物生長的濕度、溫度等條件對原生質(zhì)體的分離效果也的明顯的影響。如生長在相對濕度為70%，溫度為26度的蕓苔葉片只能得到少量不能持續(xù)分裂的原生質(zhì)體，而在相對濕度為40-45%，溫度為19-21度條件下生長的葉片可得到理想的原生質(zhì)體。第三頁，共五十一頁。

植物細(xì)胞壁是由纖維素（25%~50%）、半纖維素（50%左右）、果膠質(zhì)（5%）組成。因此常用三種相應(yīng)的酶來降解細(xì)胞壁。一般認(rèn)為纖維素酶和果膠酶是必需的，有些材料要加半纖維素酶。商品酶制劑常含有雜質(zhì)，對原生質(zhì)體有不良影響，有時(shí)要純化。常用的方法是將酶液在4oC下過Bio-GelP6或SephadexG-25。2、酶的種類第四頁，共五十一頁。常用的商品酶制劑：纖維素酶類（主要來源于綠色木霉）

纖維素酶EA-867（中國）(Tricodermaviride)CellulaseOnzukaR-10（Japan）CellulaseOnzukaRS（Japan）Cellulase（Sigma）Cellulysin（USA）

果膠酶類（主要來源于黑曲霉）

PectolyaseY23（Japan）MacerozymeR-10（Japan）Macerozyme（Japan）Pectinase（Sigma）Pectinal（USA）第五頁，共五十一頁。

如果溶液的滲透壓和細(xì)胞內(nèi)的滲透壓不同，原生質(zhì)體有可能被漲破或收縮。因此在酶液、洗滌液和培養(yǎng)液中滲透壓應(yīng)和原生質(zhì)體內(nèi)的相等或略大一些。廣泛使用的滲透壓調(diào)節(jié)劑是山梨醇和甘露醇，此外還有蔗糖、葡萄糖、和麥芽糖，濃度約在0.40~0.80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能夠提高原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性，增加完整原生質(zhì)體的數(shù)目和活力。3、滲透壓的調(diào)控第六頁，共五十一頁。4、原生質(zhì)體的游離（1）材料的預(yù)處理：有些材料經(jīng)預(yù)處理后可提高原生質(zhì)體分裂的頻率，如暗處理、預(yù)培養(yǎng)、低溫處理等。（2）

材料的滅菌：除試管苗、培養(yǎng)細(xì)胞等外，材料要進(jìn)行表面滅菌。

（3）酶解處理：酶的選擇因材料而異，愈傷和懸浮細(xì)胞用活性較強(qiáng)的酶，且酶的濃度也要大一些；葉片等材料酶濃度可小一些。pH值一般調(diào)在5.6~5.8，酶解處理一般靜止暗中進(jìn)行，懸浮細(xì)胞和愈傷組織則要置搖床低速振蕩。酶解時(shí)間5~24h，溫度一般為250C。第七頁，共五十一頁。滅菌試劑濃度（%）去除時(shí)間（min）效果次氯酸鈉2易5~30很好次氯酸鈣9~10易5~30很好過氧化氫10~12最易5~15好二氯化汞0.1~1.0較難5~15最好乙醇70~75易5~30秒好

常用的滅菌試劑第八頁，共五十一頁。

5、原生質(zhì)體收集與純化

通常用過濾和離心相結(jié)合的方法收集與純化。（1）

原生質(zhì)體混合液過篩（40~100m），除去未消化的細(xì)胞團(tuán)、篩管、導(dǎo)管等雜質(zhì)。（2）濾液離心沉淀原生質(zhì)體。（3）沉淀重新懸浮，再離心，重復(fù)洗三次。（4）用培養(yǎng)基清洗一次，最后用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)原生質(zhì)體的濃度（104~106/ml）進(jìn)行培養(yǎng)。第九頁，共五十一頁。

（1）細(xì)胞壁染色法：

熒光增白劑——細(xì)胞壁染色劑，既可以鑒定細(xì)胞壁是否除凈，也可檢查原生質(zhì)體細(xì)胞壁的再生情況。染色后在熒光顯微鏡下觀察（360~440nm），染料與細(xì)胞壁形成顯眼的綠色熒光，無細(xì)胞壁處則無熒光反應(yīng)，略帶紅色。6、原生質(zhì)體的活力鑒定第十頁，共五十一頁。

（2）原生質(zhì)體活力的測定：

有多種方法，如觀察細(xì)胞質(zhì)環(huán)流、Evans藍(lán)活性染料染色、測熒光素雙醋酸酯（FDA）染色、測定原生質(zhì)體光合活性等。一般常用的方法是FDA染色，F(xiàn)DA本身無熒光，進(jìn)入原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體中受酯酶的分解而產(chǎn)生有熒光的極性熒光物質(zhì)，積累在有活力的原生質(zhì)內(nèi)，便產(chǎn)生熒光。無活力的原生質(zhì)不能分解FDA，也就無熒光產(chǎn)生。第十一頁，共五十一頁。

矮牽牛（Petuniahybrida）葉片原生質(zhì)體分離的具體操作過程：

（1）取幼嫩葉片，用自來水洗凈，無離子水中浸泡1~2小時(shí)，無菌條件下在70%乙醇中浸泡兩秒鐘，0.1%升汞中浸泡分鐘，無菌水洗滌葉片（3~5次）。（2）

滅菌后撕去葉片的下表皮，平放于盛有酶液的培養(yǎng)皿中。酶液的組成為：2%纖維素酶（75-343，上海生化所東風(fēng)試劑廠）；0.5mol甘露醇，pH5.6，使用前用04.5m微孔濾膜抽濾滅菌。（3）酶液處理：260C度，約3小時(shí)，將懸浮有原生質(zhì)體的酶液200目鎳絲網(wǎng)過濾，離心（500rpm，3~5min），棄去酶液。收集原生質(zhì)體，用0.5mol甘露醇洗一次（離心），再用液體培養(yǎng)基洗一次，最后添加培養(yǎng)基，制成密度為1~2104/ml的原生質(zhì)體懸浮液。（原生質(zhì)體呈球形，葉綠體分布均勻，呈亮綠色。）

第十二頁，共五十一頁。

原生質(zhì)體經(jīng)分離純化后，在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件才能正常生長發(fā)育，最后再生成完整植株。由于沒有細(xì)胞壁，原生質(zhì)體對環(huán)境的刺激更敏感，培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)方法的變化都會引起細(xì)胞內(nèi)部生理、生化變化。三、植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)第十三頁，共五十一頁。1、原生質(zhì)體培養(yǎng)基

原生質(zhì)體培養(yǎng)基一般是在組織、細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)而制成。如常用的KM8P培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，NT培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)改進(jìn)而成。（1）滲透壓穩(wěn)定劑：常用的是甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等。這些物質(zhì)既保持培養(yǎng)基的滲透濃度，同時(shí)也是原生質(zhì)體生長的碳源。第十四頁，共五十一頁。

（2）無機(jī)鹽：是培養(yǎng)基的主要成分，分大量的微量元素兩部分。大量元素中影響最大的是Ca2+和NH4+。

較高的Ca2+濃度能提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，同樣也有利于原生質(zhì)體的生長發(fā)育。因此常用大量元素減半的MS培養(yǎng)基時(shí)，Ca2+濃度不降低；

高濃度NH4+

對原生質(zhì)體生長發(fā)育不利，很多原生質(zhì)體培養(yǎng)采用除去銨鹽而用有機(jī)氮做氮源的方法。其他如有機(jī)營養(yǎng)、激素等在組織、細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上根據(jù)培養(yǎng)要求適當(dāng)改進(jìn)。第十五頁，共五十一頁。

（1）

液體培養(yǎng)法：

培養(yǎng)基中不加固化劑，原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中。常用的有液體淺層培養(yǎng)法、微滴培養(yǎng)法。

液體淺層培養(yǎng)法操作簡便，對原生質(zhì)體傷害小，且便于添加培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，是廣泛應(yīng)用的方法之一；

2、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法第十六頁，共五十一頁。

微滴培養(yǎng)法是將懸有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液用滴管以0.1ml左右的小滴接種到無菌清潔干燥培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿封口防止干燥和污染（如果把培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)過來則成為懸滴培養(yǎng)）。該法的優(yōu)點(diǎn)是在一個(gè)培養(yǎng)皿中可做很多種培養(yǎng)基的對照實(shí)驗(yàn)，且其中一滴發(fā)生污染不會殃及整個(gè)實(shí)驗(yàn)；缺點(diǎn)是原生質(zhì)體分布不均勻（集中在中央），且易蒸發(fā)干燥。

第十七頁，共五十一頁。

（2）固體培養(yǎng)法：

該法是將懸浮在液體培養(yǎng)基中的原生質(zhì)體與熱融的含瓊脂（0.6%）的培養(yǎng)基等量混合，冷卻后原生質(zhì)體包埋在瓊脂培養(yǎng)基中。由于原生質(zhì)體被機(jī)械地彼此分開并固定了位置，因而避免了細(xì)胞間有害代謝產(chǎn)物的相互影響，且便于定點(diǎn)觀察，追蹤單個(gè)細(xì)胞的發(fā)育過程。第十八頁，共五十一頁。

（3）固液結(jié)合培養(yǎng)法：

即在培養(yǎng)皿的底部先鋪一層固體培養(yǎng)基（含或不含原生質(zhì)體），再在其上進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)。這樣固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分可緩慢向液體中釋放，以補(bǔ)充培養(yǎng)物對營養(yǎng)物的消耗，也可吸收培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，對培養(yǎng)物的生長更為有利。

用上述各方法，一般培養(yǎng)1~2d原生質(zhì)體體積顯著增大，2~3d即可形成新的細(xì)胞壁，3~7天后開始分裂，15d左右形成小的細(xì)胞團(tuán)(20~40個(gè)細(xì)胞)，30~40d發(fā)育成肉眼可見的小愈傷組織。第十九頁，共五十一頁。

當(dāng)愈傷組織直徑為1~2mm時(shí)，可將其轉(zhuǎn)移到固體分化培養(yǎng)基上，一般是先誘導(dǎo)芽分化，再誘導(dǎo)根分化。小愈傷組織在固體分化培養(yǎng)基上生長迅速，約30d后直徑可達(dá)礎(chǔ)0.5cm，同時(shí)愈組織變綠（不同來源的材料表現(xiàn)不一），進(jìn)一步誘導(dǎo)分化形成綠芽。然后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上或不含任何激素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化形成根，再生完整植株。第二十頁，共五十一頁。3.原生質(zhì)體的培養(yǎng)的技術(shù)流程

原生質(zhì)體可按Bergmann的細(xì)胞植板法用瓊脂平板進(jìn)行培養(yǎng)。如下圖所示。

第二十一頁，共五十一頁。第二十二頁，共五十一頁。4.植物原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株實(shí)例玉米小偃麥棉花第二十三頁，共五十一頁。玉米原生質(zhì)體植株再生1、從胚性愈傷組織分離的原生質(zhì)體。2、培養(yǎng)4天后再生細(xì)胞進(jìn)行第一次分裂。3、培養(yǎng)約三星期的小愈傷組織。4、分化的胚芽鞘。5、分化的小植株。第二十四頁，共五十一頁。小偃麥原生質(zhì)體植株再生第二十五頁，共五十一頁。棉花原生質(zhì)體植株再生第二十六頁，共五十一頁。

1、體細(xì)胞雜交的概念

凡是兩個(gè)細(xì)胞或原生質(zhì)體融合成一個(gè)細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞雜交（cellhybridization）。原生質(zhì)體可從體細(xì)胞和性細(xì)胞獲得，但植物細(xì)胞雜交都用來自葉肉、根尖、莖端、髓部等組織的體細(xì)胞原生質(zhì)體作為雜交親本，故常稱之為體細(xì)胞雜交（somatichybridization）。

四、植物體細(xì)胞雜交第二十七頁，共五十一頁。

通俗地說，細(xì)胞雜交（或融合）就是兩個(gè)不同種的活細(xì)胞緊密接觸在一起，使接觸部位的細(xì)胞膜發(fā)生融化，這樣兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器互相交流，最后完全合并成一個(gè)細(xì)胞。通過科學(xué)的培養(yǎng)技術(shù)，這個(gè)細(xì)胞有可能發(fā)育成完整的生物體，即原來兩個(gè)細(xì)胞所屬的物種的雜種后代。所形成的雜種后代有可能兼有兩個(gè)親本的一些優(yōu)良性狀，因而對改良品種，提高農(nóng)、林、牧業(yè)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。第二十八頁，共五十一頁。起源細(xì)胞細(xì)胞壁降解親本原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合聚集、粘連胞質(zhì)融合異核體核融合胞壁再生雜種細(xì)胞培養(yǎng)選擇雜種愈傷組織誘導(dǎo)分化雜種植株2、植物細(xì)胞雜交程序第二十九頁，共五十一頁。

3.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)包括以下三個(gè)環(huán)節(jié)：

誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合；選擇融合體或雜種細(xì)胞；雜種細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定。

第三十頁，共五十一頁。

（1）誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合

誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合是體細(xì)胞雜交的基本技術(shù)環(huán)節(jié)，常用的方法有化學(xué)方法和電融合方法。

1）化學(xué)方法：

化學(xué)方法最早是用硝酸鈣溶液作融合劑，但由于它本身對細(xì)胞有毒，且誘導(dǎo)融合的頻率不高。目前最常用的化學(xué)融合劑是聚乙二醇（PEG）。第三十一頁，共五十一頁。PEG毒性低，且沒有種、屬、科間的特異性，只要掌握好試劑的分子量、濃度、處理時(shí)間和操作技術(shù)，可得到較高的誘導(dǎo)融合率（一般在10%以上），且誘導(dǎo)的融合體在合適的培養(yǎng)條件下可再生植株。其缺點(diǎn)是易形成多融合體。在PEG溶液中加入融合促進(jìn)劑如刀豆球蛋白A、15%的二甲基亞砜、鏈霉蛋白酶、精胺、亞精胺等，都能明顯提高融合頻率。

第三十二頁，共五十一頁。

PEG溶液加到混合原生質(zhì)體懸液中，引起原生質(zhì)體凝集，但PEG誘導(dǎo)融合的機(jī)理目前還不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，將商品PEG純化后就完全失去了誘導(dǎo)融合的能力，但并不影響原生質(zhì)體的凝集。對純化除去的雜質(zhì)經(jīng)鑒定是一些抗氧化劑，如-生育酚（Ve）和其它酚類衍生物。如把純化的PEG與低分子量的脂肪酸結(jié)合應(yīng)用，融合頻率比商品PEG高15~20倍。第三十三頁，共五十一頁。

常用的PEG和高pH高Ca相結(jié)合誘導(dǎo)融合的具體操作程序：

混合雙親原生質(zhì)體懸液，吸一小滴懸液于小培養(yǎng)皿中，5~15min后原生質(zhì)體沉到底面形成薄層；每一小滴懸液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG溶液的組成：2難度ml溶液（內(nèi)含0.1mol葡萄糖、10.5mmolCaCI2、0.7molKH2PO4，KOH調(diào)節(jié)pH到5.5）加1gPEG-1560（或4000、6000，其它濃度）

250C保溫15~45min

第三十四頁，共五十一頁。

用0.5ml高pH高Ca溶液稀釋（50mmolCaCl2、0.3mol葡萄糖、50mmol甘氨酸、1000ml蒸餾水，NaOH調(diào)pH到10.5）.

15min后加另一滴（約0.5ml）高pH高Ca溶液；

15min后用1~2ml原生質(zhì)體培養(yǎng)基稀釋；用總量為20ml培養(yǎng)基洗滌5次；

在0.5ml左右原生質(zhì)體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第三十五頁，共五十一頁。

該技術(shù)從建立（1979）以來發(fā)展很快。電融合需要有特制的融合儀和融合板，原生質(zhì)體放在板上的兩電極之間。先給兩極通以交變電流，使原生質(zhì)體沿電場方向呈串珠狀排列，接著給以瞬間高強(qiáng)度電脈沖，使原生質(zhì)體膜局部損傷而導(dǎo)致融合。處理時(shí)原生質(zhì)體的適宜密度、CaCI2的濃度、

變電流的強(qiáng)度、電脈沖的大小、脈沖期寬度與間隔都影響融合的頻率。

2）電融合法：第三十六頁，共五十一頁。

兩親本原生質(zhì)體融合后形成異核體，進(jìn)行有絲分裂過程中發(fā)生核融合，形成雜種細(xì)胞：親合的雜種細(xì)胞；部分親合的雜種細(xì)胞；胞質(zhì)雜種；異核質(zhì)雜種；如何將雜種細(xì)胞與未融合的、同源融合的親本細(xì)胞區(qū)分開，是體細(xì)胞雜交技術(shù)的以一重要環(huán)節(jié)。

（2）異核體或雜種細(xì)胞的選擇第三十七頁，共五十一頁。類型細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)物1234A，BA，B（少量）A（少量），BA（或B）A（或B）A，BA，BA，BA，BA（或B）親和的雜種細(xì)胞部分親和的雜種細(xì)胞胞質(zhì)雜種胞質(zhì)雜種異核質(zhì)雜種第三十八頁，共五十一頁。1）利用生長特性的差異進(jìn)行選擇：

植物細(xì)胞對培養(yǎng)基成分的要求與反應(yīng)不同可作為選擇的依據(jù)。

如粉藍(lán)煙草和朗氏煙草的原生質(zhì)都需要外源激素，但它們間的雜種細(xì)胞能產(chǎn)生內(nèi)源激素，用無激素的培養(yǎng)基就可將雜種細(xì)胞選出來；又如曼陀羅與煙草的雜種細(xì)胞愈傷組織比兩親本的愈傷組織生長得快，這種生長速度上的差異也可作為選擇的依據(jù)。第三十九頁，共五十一頁。

原生質(zhì)體再生植株的能力作為選擇的依據(jù)。

在種內(nèi)、種間、屬間的體細(xì)胞雜交實(shí)驗(yàn)中，只要親本一方能再生植株，雜種細(xì)胞就能再生植株。因而可將原生質(zhì)體的再生能力看作顯性性狀，用來淘汰無再生能力的一方親本。再與其它方法相結(jié)合，將能再生的一方親本淘汰，選擇出雜種植株。

第四十頁，共五十一頁。

通過人為的方法導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)基的生長差異進(jìn)行選擇。

用不同的生化抑制劑處理親本原生質(zhì)體，使其代謝機(jī)能受阻，不能在培養(yǎng)基上生長。如碘乙酸酯處理使原生質(zhì)體核失活，羅達(dá)明6G能抑制氧化磷酸化過程，這些處理都能使原生質(zhì)體在培養(yǎng)基上不能分裂，而融合后產(chǎn)生的雜種細(xì)胞，由于重建了必要的代謝支路，能在培養(yǎng)基上正常生長可將其選擇出來。這是最為簡便且廣泛應(yīng)用的選擇方法。第四十一頁，共五十一頁。

突變細(xì)胞互補(bǔ)選擇是研究的較多的一種選擇方法，包括葉綠素缺失互補(bǔ)、營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)和抗性互補(bǔ)。前兩種為隱性性狀，后一種為顯性性狀，其互補(bǔ)的原理是一致的。

2）利用突變細(xì)胞系互補(bǔ)的方法選擇：第四十二頁，共五十一頁。選擇系統(tǒng)原則自養(yǎng)互補(bǔ)白化互補(bǔ)抗性互補(bǔ)自養(yǎng)aB+自養(yǎng)Ab自養(yǎng)AaBb白化aB+白化Ab綠色AaBb抗aB+抗Ab雙抗AaBb第四十三頁，共五十一頁。

當(dāng)非等位隱基因控制的兩個(gè)突變細(xì)胞融合后，由于每一親本細(xì)胞貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常的等位基因，糾正了親本對方的缺陷，使雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。當(dāng)兩個(gè)抗性系的原生質(zhì)體融合時(shí)，每個(gè)親本的藥物敏感性分別被親本對方的抗性所掩蓋，因而兩個(gè)單抗的親本細(xì)胞融合后產(chǎn)生雙抗的雜種細(xì)胞，用相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基就將雜種細(xì)胞選擇出來。

第四十四頁，共五十一頁。

人們已建立了通用雜交親本。通過有性雜交將硝酸還原酶缺陷的突變體與抗鏈霉素突變體綜合在一個(gè)突變系中，建立了同時(shí)具有顯、隱性突變的煙草雙突變體。它可以與任何一個(gè)無選擇標(biāo)記的原生質(zhì)體融合，利用親本對方對鏈霉素敏感及雙突變體特殊的營養(yǎng)要求（還原氮），很容易用選擇培養(yǎng)基將雜種細(xì)胞選擇出來。第四十五頁，共五十一頁。

目前構(gòu)建的雙突變體的隱性性狀都是硝酸還原酶