色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件

第七章

色譜分離技術(shù)第七章

色譜分離技術(shù)

隨著科學(xué)的進(jìn)步，某些關(guān)系到人們生命安全的生物藥品，尤其是注射藥品和生物工程產(chǎn)品等，都需要高度純化。但是，經(jīng)典的分離方法（如萃取、結(jié)晶等）很難滿足需要。色譜法應(yīng)運(yùn)而生。

產(chǎn)生的必然性隨著科學(xué)的進(jìn)步，某些關(guān)系到人們生命安全的生物藥品，尤

色譜分離是一組相關(guān)技術(shù)的總稱，又叫做色譜法、層析法，是一種高效而有用的生物分離技術(shù)。是產(chǎn)品的最后純化工序（精制），即在用色譜純化之前需要經(jīng)過其他方法進(jìn)行提取和初步純化。近40年來，色譜技術(shù)已成為生物大分子分離和純化技術(shù)中極重要的組成部分。胰島素、干擾素、疫苗、抗凝血因子、生長(zhǎng)激素等。色譜分離是一組相關(guān)技術(shù)的總稱，又叫做色譜法、層析法，概述

化學(xué)分析方法的基本要求是其選擇性要高。即，在分析過程中，待測(cè)物與潛在的干擾物的分離是最為重要的步驟！

20世紀(jì)中期，大量采用一些經(jīng)典的分離方法：沉淀、蒸餾和萃取。現(xiàn)代分析中，大量采用色譜和電泳分離方法。迄今為止，色譜方法是最為有效的分離手段！其應(yīng)用涉及每個(gè)科學(xué)領(lǐng)域。

1903年，俄國植物學(xué)家MikhailTswett最先發(fā)明。他采用填充有固體CaCO3細(xì)粒子的玻璃柱，將植物色素的混合物(葉綠素和葉黃素chlorophylls&xanthophylls)加于柱頂端，然后以溶劑淋洗，被分離的組份在柱中顯示了不同的色帶，他稱之為色譜(希臘語中“chroma”=color;“graphein”=write)。

20世紀(jì)50年代，色譜發(fā)展最快（一些新型色譜技術(shù)的發(fā)展，復(fù)雜組分分析發(fā)展的要求）。概述化學(xué)分析方法的基本要求是其選擇性要高。即，在色譜法的發(fā)展歷史色譜法的發(fā)展歷史色譜法起過關(guān)鍵作用的諾貝爾獎(jiǎng)研究工作色譜法起過關(guān)鍵作用的諾貝爾獎(jiǎng)研究工作色譜分離基本原理：使用外力使含有樣品的流動(dòng)相（氣體、液體或超臨界流體）通過一固定于柱或平板上、與流動(dòng)相互不相溶的固定相表面。處于柱起始端的樣品中各組份與兩相進(jìn)行不同程度的作用。與固定相作用強(qiáng)的組份隨流動(dòng)相流出的速度慢，而與固定相作用弱的組份隨流動(dòng)相流出的速度快。由于流出的速度的差異，使得混合組份最終形成各個(gè)組份的“帶(band)”或“區(qū)(zone)”，對(duì)依次流出的各個(gè)組份物質(zhì)可分別進(jìn)行定性、定量分析。色譜分離基本原理：

色譜分類方法按照分離過程中相系統(tǒng)的形式和特征，可分為：柱色譜法

填充柱色譜法毛細(xì)管色譜法平板色譜法

紙色譜法薄層色譜法色譜分類方法按照分離過程中相系統(tǒng)的形式和特征，可分為：按流動(dòng)相，可分為：氣相色譜法液相色譜法超臨界色譜法按固定相物態(tài)，氣相色譜法可分為：氣固色譜法氣液色譜法按流動(dòng)相物態(tài)，液相色譜法可分為：液固色譜法液液色譜法柱色譜法的分類見表8-1。按流動(dòng)相，可分為：柱色譜法的分類見表8-1。色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件按色譜動(dòng)力學(xué)過程，可分為：洗脫色譜頂替色譜迎頭色譜洗脫色譜(a)、頂替色譜(b)、迎頭色譜(c)按色譜動(dòng)力學(xué)過洗脫色譜(a)、頂替色譜(b)、迎頭色譜(c)按組份在固定相上的物理化學(xué)原理，分為：吸附色譜：不同組份在固定相的吸附作用不同；分配色譜：不同組份在固定相上的溶解能力不同；離子交換色譜：不同組份在固定相（離子交換劑）上的親和力不同；凝膠色譜:（尺寸排阻色譜）：不同尺寸分子在固定相上的滲透作用；按組份在固定相上的物理化學(xué)原理，分為：色譜法的特點(diǎn)1分離效率高復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。2靈敏度高可以檢測(cè)出10-11—10-13g的物質(zhì)量。3分析速度快一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。4應(yīng)用范圍廣氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：被分離組分的定性較為困難。色譜法的特點(diǎn)1分離效率高概述吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法高效液相色譜法親和色譜法概述

一、概述1.發(fā)展史創(chuàng)始人：茨維特（Tsweet）1906菊根粉或碳酸鈣石油醚連續(xù)色帶—色層或色譜色譜法得名紙色譜薄層色譜氣相色譜高效液相色譜離子色譜、凝膠色譜、親和色譜植物色素的石油醚提取液一、概述1.發(fā)展史創(chuàng)始人：茨維特（Tsweet）192.色譜法的特點(diǎn)

（1）概念色譜法是一種物理的分離方法，利用不同物質(zhì)在兩相中具有不同的分配系數(shù)，并通過兩相不斷的相對(duì)運(yùn)動(dòng)而實(shí)現(xiàn)分離的方法。其中一相是固定相，通常是表面積很大的或多孔性固體；另一相是流動(dòng)相，是液體或氣體。2.色譜法的特點(diǎn)（1）概念

流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，由于物質(zhì)在兩相間的分配情況不同，經(jīng)過多次差別分配而達(dá)到分離；或者說，易分配于固定相中的物質(zhì)移動(dòng)速度慢，易分配于流動(dòng)相中的物質(zhì)移動(dòng)速度快，因而逐步分離。流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，由于物質(zhì)在兩相間的分配情況不同，

（2）基本特點(diǎn)：

①分離效率高。其效率是所有分離純化技術(shù)中最高的，這種高效的分離尤其適于極復(fù)雜混合物。②應(yīng)用范圍廣。（非）極性、（非）離子型、小分子和大分子、無機(jī)和有機(jī)及生物活性物質(zhì)、熱（不）穩(wěn)定化合物；尤其是對(duì)生物大分子的分離，其他方法無法取代。③選擇性強(qiáng)?？勺儏?shù)很多：不同的色譜分離方法、固定相和流動(dòng)相、操作條件。④設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，且不含強(qiáng)烈的操作條件，因而不容易使物質(zhì)變性，特別適于不穩(wěn)定的大分子有機(jī)化合物。（2）基本特點(diǎn)：

缺點(diǎn)：處理量小、操作周期長(zhǎng)、不能連續(xù)操作，因此主要用于實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較少。缺點(diǎn)：3.色譜法的分類分離機(jī)理操作方法流動(dòng)相的物態(tài)實(shí)驗(yàn)技術(shù)吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法親和色譜法柱色譜法紙色譜法薄層色譜法氣相色譜法液相色譜法迎頭法頂替法洗脫分析法3.色譜法的分類分離機(jī)理吸附色譜法柱色譜法氣相色譜法迎頭法4.色譜分離方法的選擇初級(jí)代謝產(chǎn)物：氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸、單糖類、脂肪酸次級(jí)代謝產(chǎn)物：生物堿、萜類、糖苷、色素、鞣質(zhì)類、抗生素生物大分子：蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸、多糖目的產(chǎn)物4.色譜分離方法的選擇初級(jí)代謝產(chǎn)物：氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸

色譜分離方法的選擇依據(jù)：

①目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)及相對(duì)分子質(zhì)量；②主要雜質(zhì)，特別是分子結(jié)構(gòu)、大小和理化特性與目的產(chǎn)物相近的雜質(zhì)成分與含量；③目的產(chǎn)物在色譜分離過程中的生理活性的穩(wěn)定性。色譜分離方法的選擇依據(jù)：

二、吸附色譜法

依靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。

吸附劑是一些多孔性物質(zhì)，表面布滿許多吸附位點(diǎn)，即活性中心。吸附色譜過程就是樣品中各組分的分子與流動(dòng)相分子不斷爭(zhēng)奪吸附劑活性中心并不斷達(dá)到平衡的過程。被吸附的物質(zhì)稱為吸附物。

吸附力主要是范德華力，有時(shí)也可能形成氫鍵或化學(xué)鍵。二、吸附色譜法依靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力

（一）基本原理溶液中某組分的分子在運(yùn)動(dòng)中碰到一個(gè)固體表面時(shí)，分子會(huì)貼在固體表面上，發(fā)生吸附作用。

1.發(fā)生吸附作用的原理：固體表面分子（或原子）與固體內(nèi)部分子（或原子）所處的狀態(tài)不同：固體內(nèi)部分子（或原子）受臨近四周分子的作用力是對(duì)稱的，作用力總和為零，即彼此互相抵消，故分子處于平衡狀態(tài)。

界面上的分子所受的力不對(duì)稱，作用力總和不等于零，合力指向固體內(nèi)部。（一）基本原理

2.吸附的類型：

物理吸附化學(xué)吸附交換吸附2.吸附的類型：物理吸附物理吸附化學(xué)吸附產(chǎn)生方式分子力（范德華力）庫侖力(電子轉(zhuǎn)移，生成化學(xué)鍵)活化能低高進(jìn)行溫度低溫高溫釋放熱量小很大速度較快，容易達(dá)到平衡慢，平衡慢選擇性不嚴(yán)格強(qiáng)物理吸附化學(xué)吸附產(chǎn)生方式分子力（范德華力）庫侖

交換吸附：吸附劑表面如果由極性分子或離子組成，則會(huì)吸引溶液中帶相反電荷的離子形成雙電層，同時(shí)放出等物質(zhì)的量的離子，發(fā)生離子交換。

離子的電荷是決定因素，離子所帶電荷越多，在吸附劑表面的相反電荷點(diǎn)上的吸附力越強(qiáng)。電荷相同的離子，水化半徑越小，越容易被吸附。交換吸附：

3.常用的吸附劑：

有機(jī)吸附劑：無機(jī)吸附劑：

活性炭、纖維素、大孔吸附樹脂、聚酰胺

氧化鋁、硅膠、人造沸石、磷酸鈣、氫氧化鋁按化學(xué)結(jié)構(gòu)分3.常用的吸附劑：有機(jī)吸附劑：活性炭、纖維素、大孔吸4.吸附色譜的基本過程和分類

固定相對(duì)各組分吸附力的大小次序：

（1）過程4.吸附色譜的基本過程和分類固定相對(duì)各組分吸附力（2）分類吸附薄層色譜法柱色譜法操作方法的不同（2）分類吸附薄層色譜法操作方法的不同

5.吸附薄層色譜法（thinlayerchromatography,TLC）薄層色譜法：將吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上，鋪成一薄層，然后把要分離的樣品點(diǎn)到薄層的起始線上，用合適的溶劑展開，最后使樣品中各組分得到分離。5.吸附薄層色譜法

（1）原理：

利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差異，在層析過程中，在不相溶的兩相中分布不同，從而達(dá)到分離的目的。吸附劑：涂布在薄層板上（固定相）展開劑：在展開過程中流過固定相的溶劑（流動(dòng)相）兩相（1）原理：吸附劑：涂布在薄層板上（固定相）兩相

將待分離的樣品溶液點(diǎn)在薄層板的一端，在密閉的容器中用適宜的溶劑（展開劑）展開。將待分離的樣品溶液點(diǎn)在薄層板的一端，在密閉的容器中用適宜

當(dāng)溶劑流過時(shí)，不同物質(zhì)在吸附劑和展開劑之間發(fā)生連續(xù)不斷的吸附、解吸附、再吸附、再解吸附。

由于吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力大小不同：對(duì)極性大的物質(zhì)吸附力強(qiáng)，對(duì)極性小的物質(zhì)吸附力弱。當(dāng)溶劑流過時(shí)，不同物質(zhì)在吸附劑和展開劑之間發(fā)生連續(xù)不斷

移動(dòng)速度的不同：易被吸附的物質(zhì)相對(duì)移動(dòng)較慢，在薄層板上移動(dòng)的距離就小；較難被吸附的物質(zhì)移動(dòng)較快，移動(dòng)的距離大。移動(dòng)速度的不同：

經(jīng)過一段時(shí)間的展開，不同物質(zhì)就被彼此分開，最后形成互相分離的斑點(diǎn)。將展開完畢的薄層板從密閉容器中取出后，用特定的方法使斑點(diǎn)顯色，達(dá)到定性和定量的目的。經(jīng)過一段時(shí)間的展開，不同物質(zhì)就被彼此分開，最后形成互相分

（2）吸附劑和展開劑的選擇：

吸附劑：氧化鋁、硅膠和聚酰胺展開劑：由實(shí)驗(yàn)確定。極性越大，對(duì)物質(zhì)的洗脫能力越強(qiáng)（2）吸附劑和展開劑的選擇：

（3）基本操作

薄層色譜板的制備點(diǎn)樣展開顯色（3）基本操作薄層色譜板的制備點(diǎn)樣展開顯色

①薄層板的制備：

在一塊玻璃板（薄厚一致，表面光滑平整）表面涂上很薄的吸附劑，如硅膠或氧化鋁等。(--涂布)

為了增加薄層的牢固性且易于保存，可在涂布過程中加入某些黏合劑。如羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）①薄層板的制備：

②點(diǎn)樣：用毛細(xì)管吸取樣品溶液，輕輕接觸到薄層上，使樣品自動(dòng)吸到薄層上。1.5–2cm直徑<3mm②點(diǎn)樣：1.5–2cm直徑<3mm

③展開：在密閉容器中進(jìn)行：層析缸。最常用的展開法：上行展開法

薄板放入層析缸時(shí)，切勿使溶劑浸沒樣品點(diǎn)。當(dāng)溶劑移動(dòng)到接近薄板上端邊緣時(shí)，取出薄板，劃出溶劑前沿。③展開：

④顯色：也稱定位，即用某種方法使經(jīng)色譜展開后的混合物各組分斑點(diǎn)呈現(xiàn)顏色。每類化合物都有特定的顯色劑。各類物質(zhì)常用的顯色劑和萬能薄層顯色劑④顯色：

顯色的方法：噴霧顯色法紫外線照射法碘蒸氣顯色法生物顯跡法有些化合物在紫外燈下會(huì)產(chǎn)生熒光或暗色斑點(diǎn)在充滿碘蒸氣的容器中，多數(shù)天然藥物成分會(huì)產(chǎn)生棕色斑點(diǎn)抗生素等生物活性物質(zhì)每類化合物都有特定的顯色劑顯色的方法：噴霧顯色法有些化合物在紫外燈下會(huì)產(chǎn)生熒光或暗

6.吸附柱色譜法（1）基本原理同薄層色譜法。吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺、活性炭

（2）色譜柱：玻璃柱6.吸附柱色譜法（1）基本原理同薄層色譜法。柱色譜裝置柱色譜裝置（3）基本操作裝柱上樣洗脫吸附劑干法裝柱濕法裝柱被分離物質(zhì)干法上樣濕法上樣梯度洗脫，各組分先后被洗出（3）基本操作裝柱上樣洗脫吸附劑干法裝柱被分離物質(zhì)干法上樣梯

三、分配色譜法

分配色譜法：利用溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的方法。三、分配色譜法分配色譜法：利用溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)

分配色譜法：利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體之間的分布情況不同而使混合物得到分離。（相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑提取方法，只是把其中一個(gè)溶劑設(shè)法固定，用另一種溶劑來沖洗，這種分離不經(jīng)過吸附程序，僅由溶劑的提取而完成，所以叫~。）（一）基本原理分配色譜法：利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體固定相：固定在柱內(nèi)的液體流動(dòng)相：用作沖洗的液體載體：使固定相停留在柱內(nèi)的固體

在洗脫過程中，流動(dòng)相與固定相發(fā)生接觸，由于樣品中各成分在兩相之間的分布不同，因此向下移動(dòng)的速度不同，易溶于流動(dòng)相中的成分移動(dòng)快，而在固定相中溶解度大的成分移動(dòng)慢，因此得到分離。（溶解度）將含固定相的載體裝在柱內(nèi)加入被分離溶液洗脫分離：固定相：固定在柱內(nèi)的液體載體：使固定相停留在柱內(nèi)的固體（二）載體、固定相和流動(dòng)相的選擇1.載體的選擇惰性、無吸附能力、能吸留較大量固定相。主要有硅膠、硅藻土、纖維素，聚乙烯粉2.固定相的選擇

水、緩沖液、酸的水溶液

“反相層析法”：有機(jī)溶劑作固定相3.展開劑的選擇（二）載體、固定相和流動(dòng)相的選擇1.載體的選擇（三）基本操作裝柱上樣洗脫（三）基本操作裝柱上樣洗脫

四、離子交換色譜法

與離子交換法的區(qū)別？離子交換法：應(yīng)用離子交換劑作為吸附劑，通過靜電引力將溶液中帶相反電荷的物質(zhì)吸附在離子交換劑上，然后用合適的洗脫劑將吸附物從離子交換劑上洗脫下來，從而達(dá)到分離、濃縮、純化的目的。離子交換樹脂組成活性離子離子交換色譜法的固定相應(yīng)該是什么？四、離子交換色譜法與離子交換法的區(qū)別？

離子交換色譜法：利用離子交換樹脂作為固定相，以適宜的溶劑作為流動(dòng)相，使溶質(zhì)按它們的離子交換親和力的不同而得到分離的方法。利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測(cè)定溶液中陽離子和陰離子的一種分離方法。離子交換色譜法：利用離子交換樹脂作為固定相，以適宜的溶劑

基本原理：帶電物質(zhì)因電荷力作用而在固定相和流動(dòng)相之間分配得以相互分離。兩性電解質(zhì)（蛋白質(zhì)、氨基酸）在不同溶液中所帶的凈電荷的種類和數(shù)量不同：

pH=pI;pH<pI；pH>pI

?

溶液pH偏離pI越遠(yuǎn)，則凈電荷量越大?；驹恚?/p>

由于各種蛋白質(zhì)等生物大分子的等電點(diǎn)不同，可以通過改變?nèi)芤旱膒H和離子強(qiáng)度來影響它們與離子交換樹脂的吸附作用，從而將它們分離。離子交換樹脂（固定相）的性質(zhì)、種類、選擇依據(jù)、離子交換色譜的操作及應(yīng)用由于各種蛋白質(zhì)等生物大分子的等電點(diǎn)不同，可以通過改變?nèi)芤?/p>

五、凝膠色譜法

凝膠色譜法：以凝膠為固定相、基于分子大小不同而進(jìn)行分離的一種方法。因其整個(gè)過程和過濾相似，又稱凝膠過濾、分子篩過濾等。

凝膠：一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)就如一個(gè)篩子。五、凝膠色譜法凝膠色譜法：以凝膠為固定相、基于分

利用有一定孔徑的多孔的親水性凝膠作為載體，當(dāng)分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時(shí)，直徑大于凝膠孔徑的大分子由于不能進(jìn)入膠粒內(nèi)部，便隨著溶劑在膠粒間隙向下移動(dòng)并最先流出柱外；直徑小于凝膠孔徑的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。這樣不同大小的分子由于所經(jīng)的路徑不同從而得到分離，大分子物質(zhì)先被洗脫下來，小分子物質(zhì)后被洗脫下來。（一）原理利用有一定孔徑的多孔的親水性凝膠作為載體，當(dāng)分子大小分子小分子（二）凝膠過濾介質(zhì)基本要求：

不能與原料組分發(fā)生除排阻之外的任何其他相互作用，如電荷作用、化學(xué)作用、生物學(xué)作用高物理強(qiáng)度、高化學(xué)穩(wěn)定性耐高溫高壓、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿高化學(xué)惰性內(nèi)孔徑分布范圍窄顆粒大小均一度高（二）凝膠過濾介質(zhì)基本要求：不能與原料組分發(fā)生除排阻之外的常用的凝膠過濾介質(zhì)葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠常用的凝膠過濾介質(zhì)葡聚糖凝膠1.葡聚糖凝膠

應(yīng)用最廣泛的一類凝膠。由葡聚糖Dextran交聯(lián)而得。在制備凝膠時(shí)添加不同比例的交聯(lián)劑可得到交聯(lián)度不同的凝膠。交聯(lián)劑在原料總質(zhì)量中所占的百分?jǐn)?shù)叫做交聯(lián)度。交聯(lián)度大：網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，吸水量小交聯(lián)度?。壕W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，吸水量多化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，不溶于水、弱酸、堿和鹽溶液1.葡聚糖凝膠2.瓊脂糖凝膠來源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價(jià)交聯(lián)，而是以氫鍵交聯(lián)，鍵能較弱。

孔隙度通過改變瓊脂糖濃度而達(dá)到（與葡聚糖不同）（聯(lián)系瓊脂糖凝膠電泳）化學(xué)穩(wěn)定性：瓊脂糖凝膠<葡聚糖凝膠沒有干膠，必須在溶脹狀態(tài)保存。2.瓊脂糖凝膠

能分離幾萬至幾千萬高相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)，分離范圍隨著凝膠濃度上升而下降，顆粒強(qiáng)度隨濃度上升而提高。適用于核酸、多糖和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的分離。能分離幾萬至幾千萬高相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)，分離范圍隨著凝膠濃3.聚丙烯酰胺凝膠人工合成，在溶劑中能自動(dòng)吸水溶脹成凝膠。對(duì)芳香族、雜環(huán)化合物有不同程度的吸附作用。3.聚丙烯酰胺凝膠（三）操作方法凝膠的預(yù)處理層析柱的選擇凝膠柱的裝填樣品處理和加樣洗脫與收集凝膠的保存（三）操作方法凝膠的預(yù)處理層析柱的選擇凝膠柱的裝填樣品處理和1、凝膠的預(yù)處理：充分溶脹2、層析柱的選擇①體積②柱比：層析柱的長(zhǎng)度與直徑的比（樣品的數(shù)量、性質(zhì)、分離目的）3、凝膠柱的裝填進(jìn)膠過程宜連續(xù)、均勻、不中斷，并不斷攪拌。4、樣品處理和加樣（樣品的濃度、黏度）5、洗脫與收集（洗脫液的成分、流速、目的物）6、凝膠的保存（去除雜質(zhì)）

1、凝膠的預(yù)處理：充分溶脹

六、高效液相色譜法(HighperformanceLiquidchromatography,HPLC)

高效液相色譜法：特指一種以液體為流動(dòng)相的色譜分離分析方法。它是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣象色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。六、高效液相色譜法高效液相色譜法：

（一）HPLC的分類和基本原理

固定相液-液色譜液-固色譜作用原理液-固吸附色譜液-液分配色譜凝膠滲透或體積排除色譜離子交換色譜親和色譜（一）HPLC的分類和基本原理固定相液-液色譜作用原1.液-固吸附色譜流動(dòng)相—液體固定相—固體吸附劑（活性吸附劑）分離機(jī)制：被分離的組分分子（溶質(zhì)分子）與流動(dòng)相爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心，靠溶質(zhì)分子的吸附系數(shù)的差別而分離。與薄層色譜在分離機(jī)理上有很大的相似性，主要按樣品極性的大小進(jìn)行分離。1.液-固吸附色譜2.液-液分配色譜流動(dòng)相—液體固定相—載體+固定液以液體為流動(dòng)相，把另一種液體涂漬在載體上作為固定相。分離機(jī)制:

流動(dòng)相與固定相互不相溶，兩者之間有一明顯的分界面，樣品各組分借助于它們?cè)趦上嚅g的分配系數(shù)的差異而獲得分離。（與液-液萃取的機(jī)理相似）2.液-液分配色譜3.離子交換色譜

流動(dòng)相—液體固定相—人工合成的離子交換樹脂分離能在溶液中電離的樣品。4.凝膠滲透或體積排除色譜（凝膠色譜）

流動(dòng)相—液體固定相—多孔凝膠近似于分子篩效應(yīng)，樣品按分子大小不同進(jìn)行分離。3.離子交換色譜4.凝膠滲透或體積排除色譜（凝膠色譜）5.親和色譜

利用生物大分子與某些對(duì)應(yīng)的專一分子有特異的親和力將混合物進(jìn)行分離。用于分離任何兩種有特異性相互作用的生物大分子。5.親和色譜

（二）高效液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)輔助裝置：自動(dòng)進(jìn)樣、數(shù)據(jù)處理主要部分（二）高效液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)主要部分色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件2.進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣器是供樣品進(jìn)入色譜柱的通道1.高壓輸液系統(tǒng)

高壓泵是高壓輸液系統(tǒng)的核心部件，是高效液相色譜的動(dòng)力部件，用它來完成流動(dòng)相和試樣的輸送，使其以恒定的流量流經(jīng)色譜柱。2.進(jìn)樣系統(tǒng)1.高壓輸液系統(tǒng)3.分離系統(tǒng)—色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，由色譜柱管和固定相兩部分組成。4.檢測(cè)系統(tǒng)將色譜柱流出物中樣品含量的變化轉(zhuǎn)變?yōu)榭晒┯^測(cè)的信號(hào)（通常是電信號(hào)），以便自動(dòng)記錄下來。這種電信號(hào)又稱為色譜圖。應(yīng)用較多的：紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器等3.分離系統(tǒng)—色譜柱4.檢測(cè)系統(tǒng)

（三）應(yīng)用實(shí)例

—HPLC測(cè)膽固醇含量鑒別地溝油

原理：餐廚廢油脂中的地溝油是多種動(dòng)、植物油脂的混合物，其中含有大量的動(dòng)物油脂，動(dòng)物油脂中含有膽固醇，植物油中一般不含或只含極少量的膽固醇。利用HPLC測(cè)定油中膽固醇含量來分析是否摻了廢油脂。（三）應(yīng)用實(shí)例原理：色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件

七、親和色譜法

親和色譜法：利用生物大分子與某些對(duì)應(yīng)的專一分子特異識(shí)別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種色譜方法。如抗原與抗體，酶與底物，激素與受體等廣泛用于酶、抗體、核酸、激素等的分離與純化，特別是對(duì)含量極少而又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)最有效。七、親和色譜法親和色譜法：利用生物大分子與某些（一）基本原理

親和色譜是應(yīng)用生物分子對(duì)它的互補(bǔ)結(jié)合體（配基）的生物識(shí)別能力，使目標(biāo)產(chǎn)物得以分離純化的液相層析法。配基的固定化吸附樣品樣品解析（洗脫）具有親和力的兩個(gè)分子中的一個(gè)（配基）以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑樣品（流動(dòng)相）流經(jīng)層析柱時(shí)，配基選擇性吸附目的分子，雜質(zhì)不能被吸附而流出。選擇適宜的條件將被吸附的目的分子洗脫（一）基本原理親和色譜是應(yīng)用生物分子對(duì)它的互補(bǔ)結(jié)合配基載體親和層析親和物雜質(zhì)+洗滌洗脫再生配基載體親和層析親和物雜質(zhì)+洗滌洗脫再生色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件（二）親和吸附劑的制備載體的選擇配基的選擇載體的活化與偶聯(lián)（二）親和吸附劑的制備載體的選擇配基的選擇載體的活化與偶聯(lián)1.載體的選擇①具有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性②具有大量可供活化和配基結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)③高度的水不溶性和親水性④有稀松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使大分子能自由進(jìn)入⑤有良好的機(jī)械性能，顆粒均勻1.載體的選擇2.配基的選擇①特殊配基抗原的抗體，酶的專一抑制劑，激素的受體②通用配基可適于一類物質(zhì)的分離提純3.載體的活化與偶聯(lián)載體具有惰性先活化再與配基偶聯(lián)活化的作用：

載體表面活化后產(chǎn)生的活性基團(tuán)可在簡(jiǎn)單的化學(xué)條件下與配基上的氨基、羧基、羥基或醛基等發(fā)生共價(jià)結(jié)合2.配基的選擇3.載體的活化與偶聯(lián)（三）影響吸附親和力的因素配基濃度：高空間障礙：在載體與配基之間插入多烴鏈“手臂”配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)載體孔徑（三）影響吸附親和力的因素配基濃度：高（四）操作方法具有親和力的一對(duì)分子中的一個(gè)作為配基，與不溶性載體結(jié)合，使之固化，裝入色譜柱含目的物的混合液作為流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱，配基選擇性吸附目的物質(zhì)，雜質(zhì)不能被吸附而直接流出。改變條件使配基與其親和物解離親和層析的基本過程：（四）操作方法具有親和力的一對(duì)分子中的一個(gè)作為配基，與不溶性具體操作：①樣品制備含雜質(zhì)，需預(yù)處理：②配體與配基結(jié)合條件的選擇pH、緩沖液濃度、離子強(qiáng)度③柱操作④流速的控制⑤清洗⑥洗脫⑦柱的再生蛋白沉淀、離子交換柱層析柱的大小、長(zhǎng)短高速度、高效率除去不結(jié)合的所有物質(zhì)特異性洗脫（競(jìng)爭(zhēng)性置換目的物）非特異性洗脫（調(diào)節(jié)pH、離子強(qiáng)度和種類、溫度）具體操作：①樣品制備蛋白沉淀、離子交換柱層析柱的大小、長(zhǎng)短（五）親和色譜法的應(yīng)用1.親和色譜法的特點(diǎn)：專一、高效、簡(jiǎn)便、快速

2.應(yīng)用①分離和純化各種生物分子純化生物大分子，適于從組織或發(fā)酵液中分離以下物質(zhì)：雜質(zhì)與目的物間的溶解度、分子大小、電荷分布等性質(zhì)差異小，相對(duì)含量低，其他經(jīng)典手段分離有困難的高分子物質(zhì)；尤其是對(duì)分離某些不穩(wěn)定的高分子物質(zhì)更具有優(yōu)越性。如：酶、rRNA、抗原和抗體的分離，激素的提純（五）親和色譜法的應(yīng)用1.親和色譜法的特點(diǎn)：②分離純化各種功能細(xì)胞、細(xì)胞器、膜片段和病毒顆粒③用于各種生化成分的分析檢測(cè)④與親和色譜有關(guān)的特殊技術(shù)應(yīng)用②分離純化各種功能細(xì)胞、細(xì)胞器、膜片段和病毒顆粒吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法親和色譜法高效液相色譜法混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，由于固定相對(duì)混合物中各組分的吸附能力不同對(duì)其分離固定相和流動(dòng)性都是液體，根據(jù)混合物中各組分在兩相中的分配系數(shù)不同而分離。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而進(jìn)行分離以凝膠為固定相，依靠各物質(zhì)的分子大小和形狀不同對(duì)混合物進(jìn)行分離利用生物大分子與某些對(duì)應(yīng)的專一分子特異識(shí)別和可逆結(jié)合的特性對(duì)其進(jìn)行分離課堂總結(jié)吸附色譜法混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，由于固定相對(duì)混合物中各氣相色譜系統(tǒng)記錄儀色譜處理機(jī)氣體鋼瓶色譜主機(jī)空氣壓縮機(jī)氣相色譜系統(tǒng)記錄儀色譜氣體鋼瓶色譜主機(jī)空氣壓縮機(jī)氣相色譜儀整機(jī)氣相色譜整機(jī)氣相色譜儀整機(jī)氣鋼瓶與減壓閥氮?dú)鈿錃怃撈颗c減壓閥氮?dú)鈿錃鈿庀嗌V儀主機(jī)控溫柱室色譜電路控制氣相色譜儀主機(jī)控色氣相色譜儀柱室控溫柱室控溫方式：恒溫或程序控溫氣相色譜儀柱室控控溫方式：恒溫或程序控溫第七章

色譜分離技術(shù)第七章

色譜分離技術(shù)

隨著科學(xué)的進(jìn)步，某些關(guān)系到人們生命安全的生物藥品，尤其是注射藥品和生物工程產(chǎn)品等，都需要高度純化。但是，經(jīng)典的分離方法（如萃取、結(jié)晶等）很難滿足需要。色譜法應(yīng)運(yùn)而生。

產(chǎn)生的必然性隨著科學(xué)的進(jìn)步，某些關(guān)系到人們生命安全的生物藥品，尤

色譜分離是一組相關(guān)技術(shù)的總稱，又叫做色譜法、層析法，是一種高效而有用的生物分離技術(shù)。是產(chǎn)品的最后純化工序（精制），即在用色譜純化之前需要經(jīng)過其他方法進(jìn)行提取和初步純化。近40年來，色譜技術(shù)已成為生物大分子分離和純化技術(shù)中極重要的組成部分。胰島素、干擾素、疫苗、抗凝血因子、生長(zhǎng)激素等。色譜分離是一組相關(guān)技術(shù)的總稱，又叫做色譜法、層析法，概述

化學(xué)分析方法的基本要求是其選擇性要高。即，在分析過程中，待測(cè)物與潛在的干擾物的分離是最為重要的步驟！

20世紀(jì)中期，大量采用一些經(jīng)典的分離方法：沉淀、蒸餾和萃取?，F(xiàn)代分析中，大量采用色譜和電泳分離方法。迄今為止，色譜方法是最為有效的分離手段！其應(yīng)用涉及每個(gè)科學(xué)領(lǐng)域。

1903年，俄國植物學(xué)家MikhailTswett最先發(fā)明。他采用填充有固體CaCO3細(xì)粒子的玻璃柱，將植物色素的混合物(葉綠素和葉黃素chlorophylls&xanthophylls)加于柱頂端，然后以溶劑淋洗，被分離的組份在柱中顯示了不同的色帶，他稱之為色譜(希臘語中“chroma”=color;“graphein”=write)。

20世紀(jì)50年代，色譜發(fā)展最快（一些新型色譜技術(shù)的發(fā)展，復(fù)雜組分分析發(fā)展的要求）。概述化學(xué)分析方法的基本要求是其選擇性要高。即，在色譜法的發(fā)展歷史色譜法的發(fā)展歷史色譜法起過關(guān)鍵作用的諾貝爾獎(jiǎng)研究工作色譜法起過關(guān)鍵作用的諾貝爾獎(jiǎng)研究工作色譜分離基本原理：使用外力使含有樣品的流動(dòng)相（氣體、液體或超臨界流體）通過一固定于柱或平板上、與流動(dòng)相互不相溶的固定相表面。處于柱起始端的樣品中各組份與兩相進(jìn)行不同程度的作用。與固定相作用強(qiáng)的組份隨流動(dòng)相流出的速度慢，而與固定相作用弱的組份隨流動(dòng)相流出的速度快。由于流出的速度的差異，使得混合組份最終形成各個(gè)組份的“帶(band)”或“區(qū)(zone)”，對(duì)依次流出的各個(gè)組份物質(zhì)可分別進(jìn)行定性、定量分析。色譜分離基本原理：

色譜分類方法按照分離過程中相系統(tǒng)的形式和特征，可分為：柱色譜法

填充柱色譜法毛細(xì)管色譜法平板色譜法

紙色譜法薄層色譜法色譜分類方法按照分離過程中相系統(tǒng)的形式和特征，可分為：按流動(dòng)相，可分為：氣相色譜法液相色譜法超臨界色譜法按固定相物態(tài)，氣相色譜法可分為：氣固色譜法氣液色譜法按流動(dòng)相物態(tài)，液相色譜法可分為：液固色譜法液液色譜法柱色譜法的分類見表8-1。按流動(dòng)相，可分為：柱色譜法的分類見表8-1。色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件按色譜動(dòng)力學(xué)過程，可分為：洗脫色譜頂替色譜迎頭色譜洗脫色譜(a)、頂替色譜(b)、迎頭色譜(c)按色譜動(dòng)力學(xué)過洗脫色譜(a)、頂替色譜(b)、迎頭色譜(c)按組份在固定相上的物理化學(xué)原理，分為：吸附色譜：不同組份在固定相的吸附作用不同；分配色譜：不同組份在固定相上的溶解能力不同；離子交換色譜：不同組份在固定相（離子交換劑）上的親和力不同；凝膠色譜:（尺寸排阻色譜）：不同尺寸分子在固定相上的滲透作用；按組份在固定相上的物理化學(xué)原理，分為：色譜法的特點(diǎn)1分離效率高復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。2靈敏度高可以檢測(cè)出10-11—10-13g的物質(zhì)量。3分析速度快一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。4應(yīng)用范圍廣氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：被分離組分的定性較為困難。色譜法的特點(diǎn)1分離效率高概述吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法高效液相色譜法親和色譜法概述

一、概述1.發(fā)展史創(chuàng)始人：茨維特（Tsweet）1906菊根粉或碳酸鈣石油醚連續(xù)色帶—色層或色譜色譜法得名紙色譜薄層色譜氣相色譜高效液相色譜離子色譜、凝膠色譜、親和色譜植物色素的石油醚提取液一、概述1.發(fā)展史創(chuàng)始人：茨維特（Tsweet）192.色譜法的特點(diǎn)

（1）概念色譜法是一種物理的分離方法，利用不同物質(zhì)在兩相中具有不同的分配系數(shù)，并通過兩相不斷的相對(duì)運(yùn)動(dòng)而實(shí)現(xiàn)分離的方法。其中一相是固定相，通常是表面積很大的或多孔性固體；另一相是流動(dòng)相，是液體或氣體。2.色譜法的特點(diǎn)（1）概念

流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，由于物質(zhì)在兩相間的分配情況不同，經(jīng)過多次差別分配而達(dá)到分離；或者說，易分配于固定相中的物質(zhì)移動(dòng)速度慢，易分配于流動(dòng)相中的物質(zhì)移動(dòng)速度快，因而逐步分離。流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，由于物質(zhì)在兩相間的分配情況不同，

（2）基本特點(diǎn)：

①分離效率高。其效率是所有分離純化技術(shù)中最高的，這種高效的分離尤其適于極復(fù)雜混合物。②應(yīng)用范圍廣。（非）極性、（非）離子型、小分子和大分子、無機(jī)和有機(jī)及生物活性物質(zhì)、熱（不）穩(wěn)定化合物；尤其是對(duì)生物大分子的分離，其他方法無法取代。③選擇性強(qiáng)?？勺儏?shù)很多：不同的色譜分離方法、固定相和流動(dòng)相、操作條件。④設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，且不含強(qiáng)烈的操作條件，因而不容易使物質(zhì)變性，特別適于不穩(wěn)定的大分子有機(jī)化合物。（2）基本特點(diǎn)：

缺點(diǎn)：處理量小、操作周期長(zhǎng)、不能連續(xù)操作，因此主要用于實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較少。缺點(diǎn)：3.色譜法的分類分離機(jī)理操作方法流動(dòng)相的物態(tài)實(shí)驗(yàn)技術(shù)吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法親和色譜法柱色譜法紙色譜法薄層色譜法氣相色譜法液相色譜法迎頭法頂替法洗脫分析法3.色譜法的分類分離機(jī)理吸附色譜法柱色譜法氣相色譜法迎頭法4.色譜分離方法的選擇初級(jí)代謝產(chǎn)物：氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸、單糖類、脂肪酸次級(jí)代謝產(chǎn)物：生物堿、萜類、糖苷、色素、鞣質(zhì)類、抗生素生物大分子：蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸、多糖目的產(chǎn)物4.色譜分離方法的選擇初級(jí)代謝產(chǎn)物：氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸

色譜分離方法的選擇依據(jù)：

①目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)及相對(duì)分子質(zhì)量；②主要雜質(zhì)，特別是分子結(jié)構(gòu)、大小和理化特性與目的產(chǎn)物相近的雜質(zhì)成分與含量；③目的產(chǎn)物在色譜分離過程中的生理活性的穩(wěn)定性。色譜分離方法的選擇依據(jù)：

二、吸附色譜法

依靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。

吸附劑是一些多孔性物質(zhì)，表面布滿許多吸附位點(diǎn)，即活性中心。吸附色譜過程就是樣品中各組分的分子與流動(dòng)相分子不斷爭(zhēng)奪吸附劑活性中心并不斷達(dá)到平衡的過程。被吸附的物質(zhì)稱為吸附物。

吸附力主要是范德華力，有時(shí)也可能形成氫鍵或化學(xué)鍵。二、吸附色譜法依靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力

（一）基本原理溶液中某組分的分子在運(yùn)動(dòng)中碰到一個(gè)固體表面時(shí)，分子會(huì)貼在固體表面上，發(fā)生吸附作用。

1.發(fā)生吸附作用的原理：固體表面分子（或原子）與固體內(nèi)部分子（或原子）所處的狀態(tài)不同：固體內(nèi)部分子（或原子）受臨近四周分子的作用力是對(duì)稱的，作用力總和為零，即彼此互相抵消，故分子處于平衡狀態(tài)。

界面上的分子所受的力不對(duì)稱，作用力總和不等于零，合力指向固體內(nèi)部。（一）基本原理

2.吸附的類型：

物理吸附化學(xué)吸附交換吸附2.吸附的類型：物理吸附物理吸附化學(xué)吸附產(chǎn)生方式分子力（范德華力）庫侖力(電子轉(zhuǎn)移，生成化學(xué)鍵)活化能低高進(jìn)行溫度低溫高溫釋放熱量小很大速度較快，容易達(dá)到平衡慢，平衡慢選擇性不嚴(yán)格強(qiáng)物理吸附化學(xué)吸附產(chǎn)生方式分子力（范德華力）庫侖

交換吸附：吸附劑表面如果由極性分子或離子組成，則會(huì)吸引溶液中帶相反電荷的離子形成雙電層，同時(shí)放出等物質(zhì)的量的離子，發(fā)生離子交換。

離子的電荷是決定因素，離子所帶電荷越多，在吸附劑表面的相反電荷點(diǎn)上的吸附力越強(qiáng)。電荷相同的離子，水化半徑越小，越容易被吸附。交換吸附：

3.常用的吸附劑：

有機(jī)吸附劑：無機(jī)吸附劑：

活性炭、纖維素、大孔吸附樹脂、聚酰胺

氧化鋁、硅膠、人造沸石、磷酸鈣、氫氧化鋁按化學(xué)結(jié)構(gòu)分3.常用的吸附劑：有機(jī)吸附劑：活性炭、纖維素、大孔吸4.吸附色譜的基本過程和分類

固定相對(duì)各組分吸附力的大小次序：

（1）過程4.吸附色譜的基本過程和分類固定相對(duì)各組分吸附力（2）分類吸附薄層色譜法柱色譜法操作方法的不同（2）分類吸附薄層色譜法操作方法的不同

5.吸附薄層色譜法（thinlayerchromatography,TLC）薄層色譜法：將吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上，鋪成一薄層，然后把要分離的樣品點(diǎn)到薄層的起始線上，用合適的溶劑展開，最后使樣品中各組分得到分離。5.吸附薄層色譜法

（1）原理：

利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差異，在層析過程中，在不相溶的兩相中分布不同，從而達(dá)到分離的目的。吸附劑：涂布在薄層板上（固定相）展開劑：在展開過程中流過固定相的溶劑（流動(dòng)相）兩相（1）原理：吸附劑：涂布在薄層板上（固定相）兩相

將待分離的樣品溶液點(diǎn)在薄層板的一端，在密閉的容器中用適宜的溶劑（展開劑）展開。將待分離的樣品溶液點(diǎn)在薄層板的一端，在密閉的容器中用適宜

當(dāng)溶劑流過時(shí)，不同物質(zhì)在吸附劑和展開劑之間發(fā)生連續(xù)不斷的吸附、解吸附、再吸附、再解吸附。

由于吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力大小不同：對(duì)極性大的物質(zhì)吸附力強(qiáng)，對(duì)極性小的物質(zhì)吸附力弱。當(dāng)溶劑流過時(shí)，不同物質(zhì)在吸附劑和展開劑之間發(fā)生連續(xù)不斷

移動(dòng)速度的不同：易被吸附的物質(zhì)相對(duì)移動(dòng)較慢，在薄層板上移動(dòng)的距離就?。惠^難被吸附的物質(zhì)移動(dòng)較快，移動(dòng)的距離大。移動(dòng)速度的不同：

經(jīng)過一段時(shí)間的展開，不同物質(zhì)就被彼此分開，最后形成互相分離的斑點(diǎn)。將展開完畢的薄層板從密閉容器中取出后，用特定的方法使斑點(diǎn)顯色，達(dá)到定性和定量的目的。經(jīng)過一段時(shí)間的展開，不同物質(zhì)就被彼此分開，最后形成互相分

（2）吸附劑和展開劑的選擇：

吸附劑：氧化鋁、硅膠和聚酰胺展開劑：由實(shí)驗(yàn)確定。極性越大，對(duì)物質(zhì)的洗脫能力越強(qiáng)（2）吸附劑和展開劑的選擇：

（3）基本操作

薄層色譜板的制備點(diǎn)樣展開顯色（3）基本操作薄層色譜板的制備點(diǎn)樣展開顯色

①薄層板的制備：

在一塊玻璃板（薄厚一致，表面光滑平整）表面涂上很薄的吸附劑，如硅膠或氧化鋁等。(--涂布)

為了增加薄層的牢固性且易于保存，可在涂布過程中加入某些黏合劑。如羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）①薄層板的制備：

②點(diǎn)樣：用毛細(xì)管吸取樣品溶液，輕輕接觸到薄層上，使樣品自動(dòng)吸到薄層上。1.5–2cm直徑<3mm②點(diǎn)樣：1.5–2cm直徑<3mm

③展開：在密閉容器中進(jìn)行：層析缸。最常用的展開法：上行展開法

薄板放入層析缸時(shí)，切勿使溶劑浸沒樣品點(diǎn)。當(dāng)溶劑移動(dòng)到接近薄板上端邊緣時(shí)，取出薄板，劃出溶劑前沿。③展開：

④顯色：也稱定位，即用某種方法使經(jīng)色譜展開后的混合物各組分斑點(diǎn)呈現(xiàn)顏色。每類化合物都有特定的顯色劑。各類物質(zhì)常用的顯色劑和萬能薄層顯色劑④顯色：

顯色的方法：噴霧顯色法紫外線照射法碘蒸氣顯色法生物顯跡法有些化合物在紫外燈下會(huì)產(chǎn)生熒光或暗色斑點(diǎn)在充滿碘蒸氣的容器中，多數(shù)天然藥物成分會(huì)產(chǎn)生棕色斑點(diǎn)抗生素等生物活性物質(zhì)每類化合物都有特定的顯色劑顯色的方法：噴霧顯色法有些化合物在紫外燈下會(huì)產(chǎn)生熒光或暗

6.吸附柱色譜法（1）基本原理同薄層色譜法。吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺、活性炭

（2）色譜柱：玻璃柱6.吸附柱色譜法（1）基本原理同薄層色譜法。柱色譜裝置柱色譜裝置（3）基本操作裝柱上樣洗脫吸附劑干法裝柱濕法裝柱被分離物質(zhì)干法上樣濕法上樣梯度洗脫，各組分先后被洗出（3）基本操作裝柱上樣洗脫吸附劑干法裝柱被分離物質(zhì)干法上樣梯

三、分配色譜法

分配色譜法：利用溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的方法。三、分配色譜法分配色譜法：利用溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)

分配色譜法：利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體之間的分布情況不同而使混合物得到分離。（相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑提取方法，只是把其中一個(gè)溶劑設(shè)法固定，用另一種溶劑來沖洗，這種分離不經(jīng)過吸附程序，僅由溶劑的提取而完成，所以叫~。）（一）基本原理分配色譜法：利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體固定相：固定在柱內(nèi)的液體流動(dòng)相：用作沖洗的液體載體：使固定相停留在柱內(nèi)的固體

在洗脫過程中，流動(dòng)相與固定相發(fā)生接觸，由于樣品中各成分在兩相之間的分布不同，因此向下移動(dòng)的速度不同，易溶于流動(dòng)相中的成分移動(dòng)快，而在固定相中溶解度大的成分移動(dòng)慢，因此得到分離。（溶解度）將含固定相的載體裝在柱內(nèi)加入被分離溶液洗脫分離：固定相：固定在柱內(nèi)的液體載體：使固定相停留在柱內(nèi)的固體（二）載體、固定相和流動(dòng)相的選擇1.載體的選擇惰性、無吸附能力、能吸留較大量固定相。主要有硅膠、硅藻土、纖維素，聚乙烯粉2.固定相的選擇

水、緩沖液、酸的水溶液

“反相層析法”：有機(jī)溶劑作固定相3.展開劑的選擇（二）載體、固定相和流動(dòng)相的選擇1.載體的選擇（三）基本操作裝柱上樣洗脫（三）基本操作裝柱上樣洗脫

四、離子交換色譜法

與離子交換法的區(qū)別？離子交換法：應(yīng)用離子交換劑作為吸附劑，通過靜電引力將溶液中帶相反電荷的物質(zhì)吸附在離子交換劑上，然后用合適的洗脫劑將吸附物從離子交換劑上洗脫下來，從而達(dá)到分離、濃縮、純化的目的。離子交換樹脂組成活性離子離子交換色譜法的固定相應(yīng)該是什么？四、離子交換色譜法與離子交換法的區(qū)別？

離子交換色譜法：利用離子交換樹脂作為固定相，以適宜的溶劑作為流動(dòng)相，使溶質(zhì)按它們的離子交換親和力的不同而得到分離的方法。利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測(cè)定溶液中陽離子和陰離子的一種分離方法。離子交換色譜法：利用離子交換樹脂作為固定相，以適宜的溶劑

基本原理：帶電物質(zhì)因電荷力作用而在固定相和流動(dòng)相之間分配得以相互分離。兩性電解質(zhì)（蛋白質(zhì)、氨基酸）在不同溶液中所帶的凈電荷的種類和數(shù)量不同：

pH=pI;pH<pI；pH>pI

?

溶液pH偏離pI越遠(yuǎn)，則凈電荷量越大。基本原理：

由于各種蛋白質(zhì)等生物大分子的等電點(diǎn)不同，可以通過改變?nèi)芤旱膒H和離子強(qiáng)度來影響它們與離子交換樹脂的吸附作用，從而將它們分離。離子交換樹脂（固定相）的性質(zhì)、種類、選擇依據(jù)、離子交換色譜的操作及應(yīng)用由于各種蛋白質(zhì)等生物大分子的等電點(diǎn)不同，可以通過改變?nèi)芤?/p>

五、凝膠色譜法

凝膠色譜法：以凝膠為固定相、基于分子大小不同而進(jìn)行分離的一種方法。因其整個(gè)過程和過濾相似，又稱凝膠過濾、分子篩過濾等。

凝膠：一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)就如一個(gè)篩子。五、凝膠色譜法凝膠色譜法：以凝膠為固定相、基于分

利用有一定孔徑的多孔的親水性凝膠作為載體，當(dāng)分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時(shí)，直徑大于凝膠孔徑的大分子由于不能進(jìn)入膠粒內(nèi)部，便隨著溶劑在膠粒間隙向下移動(dòng)并最先流出柱外；直徑小于凝膠孔徑的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。這樣不同大小的分子由于所經(jīng)的路徑不同從而得到分離，大分子物質(zhì)先被洗脫下來，小分子物質(zhì)后被洗脫下來。（一）原理利用有一定孔徑的多孔的親水性凝膠作為載體，當(dāng)分子大小分子小分子（二）凝膠過濾介質(zhì)基本要求：

不能與原料組分發(fā)生除排阻之外的任何其他相互作用，如電荷作用、化學(xué)作用、生物學(xué)作用高物理強(qiáng)度、高化學(xué)穩(wěn)定性耐高溫高壓、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿高化學(xué)惰性內(nèi)孔徑分布范圍窄顆粒大小均一度高（二）凝膠過濾介質(zhì)基本要求：不能與原料組分發(fā)生除排阻之外的常用的凝膠過濾介質(zhì)葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠常用的凝膠過濾介質(zhì)葡聚糖凝膠1.葡聚糖凝膠

應(yīng)用最廣泛的一類凝膠。由葡聚糖Dextran交聯(lián)而得。在制備凝膠時(shí)添加不同比例的交聯(lián)劑可得到交聯(lián)度不同的凝膠。交聯(lián)劑在原料總質(zhì)量中所占的百分?jǐn)?shù)叫做交聯(lián)度。交聯(lián)度大：網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，吸水量小交聯(lián)度?。壕W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，吸水量多化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，不溶于水、弱酸、堿和鹽溶液1.葡聚糖凝膠2.瓊脂糖凝膠來源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價(jià)交聯(lián)，而是以氫鍵交聯(lián)，鍵能較弱。

孔隙度通過改變瓊脂糖濃度而達(dá)到（與葡聚糖不同）（聯(lián)系瓊脂糖凝膠電泳）化學(xué)穩(wěn)定性：瓊脂糖凝膠<葡聚糖凝膠沒有干膠，必須在溶脹狀態(tài)保存。2.瓊脂糖凝膠

能分離幾萬至幾千萬高相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)，分離范圍隨著凝膠濃度上升而下降，顆粒強(qiáng)度隨濃度上升而提高。適用于核酸、多糖和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的分離。能分離幾萬至幾千萬高相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)，分離范圍隨著凝膠濃3.聚丙烯酰胺凝膠人工合成，在溶劑中能自動(dòng)吸水溶脹成凝膠。對(duì)芳香族、雜環(huán)化合物有不同程度的吸附作用。3.聚丙烯酰胺凝膠（三）操作方法凝膠的預(yù)處理層析柱的選擇凝膠柱的裝填樣品處理和加樣洗脫與收集凝膠的保存（三）操作方法凝膠的預(yù)處理層析柱的選擇凝膠柱的裝填樣品處理和1、凝膠的預(yù)處理：充分溶脹2、層析柱的選擇①體積②柱比：層析柱的長(zhǎng)度與直徑的比（樣品的數(shù)量、性質(zhì)、分離目的）3、凝膠柱的裝填進(jìn)膠過程宜連續(xù)、均勻、不中斷，并不斷攪拌。4、樣品處理和加樣（樣品的濃度、黏度）5、洗脫與收集（洗脫液的成分、流速、目的物）6、凝膠的保存（去除雜質(zhì)）

1、凝膠的預(yù)處理：充分溶脹

六、高效液相色譜法(HighperformanceLiquidchromatography,HPLC)

高效液相色譜法：特指一種以液體為流動(dòng)相的色譜分離分析方法。它是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣象色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。六、高效液相色譜法高效液相色譜法：

（一）HPLC的分類和基本原理

固定相液-液色譜液-固色譜作用原理液-固吸附色譜液-液分配色譜凝膠滲透或體積排除色譜離子交換色譜親和色譜（一）HPLC的分類和基本原理固定相液-液色譜作用原1.液-固吸附色譜流動(dòng)相—液體固定相—固體吸附劑（活性吸附劑）分離機(jī)制：被分離的組分分子（溶質(zhì)分子）與流動(dòng)相爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心，靠溶質(zhì)分子的吸附系數(shù)的差別而分離。與薄層色譜在分離機(jī)理上有很大的相似性，主要按樣品極性的大小進(jìn)行分離。1.液-固吸附色譜2.液-液分配色譜流動(dòng)相—液體固定相—載體+固定液以液體為流動(dòng)相，把另一種液體涂漬在載體上作為固定相。分離機(jī)制:

流動(dòng)相與固定相互不相溶，兩者之間有一明顯的分界面，樣品各組分借助于它們?cè)趦上嚅g的分配系數(shù)的差異而獲得分離。（與液-液萃取的機(jī)理相似）2.液-液分配色譜3.離子交換色譜

流動(dòng)相—液體固定相—人工合成的離子交換樹脂分離能在溶液中電離的樣品。4.凝膠滲透或體積排除色譜（凝膠色譜）

流動(dòng)相—液體固定相—多孔凝膠近似于分子篩效應(yīng)，樣品按分子大小不同進(jìn)行分離。3.離子交換色譜4.凝膠滲透或體積排除色譜（凝膠色譜）5.親和色譜

利用生物大分子與某些對(duì)應(yīng)的專一分子有特異的親和力將混合物進(jìn)行分離。用于分離任何兩種有特異性相互作用的生物大分子。5.親和色譜

（二）高效液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)輔助裝置：自動(dòng)進(jìn)樣、數(shù)據(jù)處理主要部分（二）高效液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)主要部分色譜分離技術(shù)經(jīng)典課件2.進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣器是供樣品進(jìn)入色譜柱的通道1.高壓輸液系統(tǒng)

高壓泵是高壓輸液系統(tǒng)的核心部件，是高效液相色譜的動(dòng)力部件，用它來完成流動(dòng)相和試樣的輸送，使其以恒定的流量流經(jīng)色譜柱。2.進(jìn)樣系統(tǒng)1.高