第七章生物信息學(xué)與生物芯片技術(shù)

主要內(nèi)容§7.1基因芯片原理與應(yīng)用§7.2蛋白質(zhì)芯片原理與應(yīng)用1第一頁(yè)，共四十五頁(yè)。生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期以來(lái)影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。2第二頁(yè)，共四十五頁(yè)。

1995年秋天，在斯坦福大學(xué)做博士后的MarkSchena(M.謝納）等人在Science雜志上發(fā)表論文，第一次成功地應(yīng)用了基因芯片技術(shù)對(duì)擬南芥的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。標(biāo)志著基因芯片進(jìn)入了廣泛應(yīng)用的新階段。MarkSchena,DariShalon,RonaldW.Davis,andPatrickO.Brown.QuantitativeMonitoringofGeneExpressionPatternswithaComplementaryDNAMicroarray.Science,

1995:467-470.3第三頁(yè)，共四十五頁(yè)。生物芯片:是將生物分子(寡聚核苷酸、cDNA、基因組DNA、多肽、抗原、抗體等)固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等固相介質(zhì)上形成的生物分子點(diǎn)陣。生物芯片技術(shù)是生命科學(xué)研究中繼基因克隆技術(shù)、基因自動(dòng)測(cè)序技術(shù)、PCR技術(shù)后的又一次革命性技術(shù)突破。4第四頁(yè)，共四十五頁(yè)。生物芯片基因芯片蛋白質(zhì)芯片生物芯片的特點(diǎn)：1）高度集成2）微型化3）自動(dòng)化4）快速5第五頁(yè)，共四十五頁(yè)?！?.1基因芯片原理與應(yīng)用6第六頁(yè)，共四十五頁(yè)。一、基因芯片基本原理基因芯片（genechip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過(guò)雜交檢測(cè)信息?；蛐酒汛罅恳阎蛄刑结樇稍谕粋€(gè)基片上，經(jīng)過(guò)標(biāo)記的若干靶核酸序列通過(guò)與芯片特定位置上的探針雜交,便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。7第七頁(yè)，共四十五頁(yè)。DNA微陣列（microarray）8第八頁(yè)，共四十五頁(yè)。9第九頁(yè)，共四十五頁(yè)。Affymetrix公司（昂飛）由美國(guó)著名科學(xué)家斯蒂文?弗爾多博士(StephenFodor)在1992年創(chuàng)辦,總部位于美國(guó)加利福尼亞州硅谷。公司于1996年在美國(guó)納斯達(dá)克(NASDAQ)上市。公司在加州首府Sacramento、Emeryville、波士頓、英國(guó)倫敦、日本東京、新加坡都設(shè)有分部。昂飛是生物芯片產(chǎn)業(yè)的先驅(qū)，公司長(zhǎng)期與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院、斯坦福大學(xué)、麻省理工、哈佛、耶魯、加州大學(xué)伯克利等世界知名院校和研究所合作,在生物芯片行業(yè)中始終處于國(guó)際領(lǐng)先地位。美國(guó)昂飛公司10第十頁(yè)，共四十五頁(yè)。11第十一頁(yè)，共四十五頁(yè)。博奧生物中國(guó)最好的芯片公司12第十二頁(yè)，共四十五頁(yè)。mRNA表達(dá)譜芯片服務(wù)內(nèi)容：39個(gè)物種13第十三頁(yè)，共四十五頁(yè)。上海伯豪生物

14第十四頁(yè)，共四十五頁(yè)。（一）基因芯片設(shè)計(jì)提出基因芯片要解決的問(wèn)題，確定研究目標(biāo)。根據(jù)所選擇的基因序列，設(shè)計(jì)探針陣列，確定每個(gè)探針以及探針在芯片上的排列。二、基因芯片工作基本步驟

15第十五頁(yè)，共四十五頁(yè)。根據(jù)探針的類型和長(zhǎng)度，基因芯片可分為兩類。其中一類是較長(zhǎng)的DNA探針（100mer）芯片這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，通過(guò)點(diǎn)樣方法將探針固定在芯片上，主要用于mRNA的表達(dá)分析。另一類是短的寡核苷酸探針芯片其探針長(zhǎng)度為25mer左右，一般通過(guò)在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于mRNA的表達(dá)監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析。16第十六頁(yè)，共四十五頁(yè)。根據(jù)探針標(biāo)記方法，基因芯片也可分為兩類1）同位素標(biāo)記探針

32P、33P2）非同位素標(biāo)記探針生物素、地高辛17第十七頁(yè)，共四十五頁(yè)。一是在片合成法在片合成法是基于組合化學(xué)的合成原理。在片合成法制備DNA芯片的關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和固相合成化學(xué)技術(shù)的精巧結(jié)合。另一種方法是點(diǎn)樣法

首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫(kù)，然后通過(guò)特殊的針頭或微噴頭,分別把不同的探針溶液，逐點(diǎn)分配在固相基底表面上的不同位點(diǎn),并通過(guò)物理或化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點(diǎn)。（二）基因芯片的制備（主要有兩種基本方法）18第十八頁(yè)，共四十五頁(yè)。（三）樣品制備及芯片雜交根據(jù)基因芯片的檢測(cè)目的不同,可以把樣品制備方法分為：1）用于表達(dá)譜測(cè)量的mRNA樣品制備2）用于多態(tài)性(或突變)研究的基因樣品的制備19第十九頁(yè)，共四十五頁(yè)。雜交：檢測(cè)過(guò)程平行化，可以同時(shí)檢測(cè)成百上千的基因序列，而且由于集成的顯微化，使得雜交所需的探針及待檢測(cè)樣品均大為減少，雜交時(shí)間明顯縮短，一般的分子雜交過(guò)程可在30分鐘內(nèi)完成。常規(guī)：1）雜交時(shí)間長(zhǎng)4-24h2）樣品處理數(shù)量少（1-幾個(gè)）20第二十頁(yè)，共四十五頁(yè)。（四）雜交信號(hào)檢測(cè)對(duì)于用熒光素標(biāo)記經(jīng)擴(kuò)增（也可用其他放大技術(shù)）的序列或樣品，與芯片上的探針進(jìn)行雜交，然后沖洗，采集熒光圖像。圖像的采集用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、激光掃描儀、半導(dǎo)體傳感器等進(jìn)行。21第二十一頁(yè)，共四十五頁(yè)。三、生物信息學(xué)在基因芯片中的應(yīng)用生物信息學(xué)在基因芯片中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在三個(gè)方面:確定芯片檢測(cè)目標(biāo)芯片設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)管理與分析22第二十二頁(yè)，共四十五頁(yè)。（一）藥物篩選和新藥開發(fā)由于所有藥物（或獸藥）都是直接或間接地通過(guò)修飾、改變?nèi)祟悾ɑ蛳嚓P(guān)動(dòng)物）基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的功能而生效，而芯片技術(shù)具有高通量、大規(guī)模、平行性地分析基因表達(dá)的能力，在藥物篩選方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)。用芯片作大規(guī)模的篩選研究可以省略大量的動(dòng)物試驗(yàn)甚至臨床，縮短藥物篩選所用時(shí)間，提高效率，降低風(fēng)險(xiǎn)。四、基因芯片的應(yīng)用23第二十三頁(yè)，共四十五頁(yè)。（二）疾病診斷基因芯片作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二是快速簡(jiǎn)便；三是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。采用基因芯片技術(shù)，疾病的早期診斷率將大大提高，而誤診率會(huì)大大降低，同時(shí)有利于醫(yī)生綜合地了解各個(gè)系統(tǒng)的疾病狀況。24第二十四頁(yè)，共四十五頁(yè)。（三）環(huán)境保護(hù)在環(huán)境保護(hù)上，基因芯片也廣泛的用途，一方面可以快速檢測(cè)污染微生物或有機(jī)化合物對(duì)環(huán)境、人體、動(dòng)植物的污染和危害，同時(shí)也能夠通過(guò)大規(guī)模的篩選尋找保護(hù)基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。（四）司法如果建立全國(guó)甚至全世界的DNA指紋庫(kù)，可直接在犯罪現(xiàn)場(chǎng)對(duì)疑犯留下來(lái)的頭發(fā)、唾液、血液、精液等進(jìn)行分析，并與DNA指紋庫(kù)系統(tǒng)進(jìn)行比較，以快速、準(zhǔn)確地破案。目前，科學(xué)家正著手于將生物芯片技術(shù)應(yīng)用于親子鑒定中，應(yīng)用生物芯片后，鑒定精度將大幅提高。25第二十五頁(yè)，共四十五頁(yè)?；蛐酒夹g(shù)可以用來(lái)篩選農(nóng)作物的基因突變，并尋找高產(chǎn)量、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關(guān)基因，也可以用于基因掃描及基因文庫(kù)作圖、商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。目前該類市場(chǎng)尚待開發(fā)。（五）現(xiàn)代農(nóng)業(yè)26第二十六頁(yè)，共四十五頁(yè)。（六）研究領(lǐng)域一組寡核苷酸探針—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補(bǔ)序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATCATACGTTA1測(cè)定未知序列27第二十七頁(yè)，共四十五頁(yè)。2DNA序列突變檢測(cè)分析有兩種方法可以進(jìn)行已知突變點(diǎn)的分析:一種方法是對(duì)于目標(biāo)序列上已知的突變點(diǎn)，以該點(diǎn)為中心，從目標(biāo)序列選取一個(gè)片段，作為設(shè)計(jì)探針的參考序列。根據(jù)參考序列，分別設(shè)計(jì)四個(gè)高度特異的探針，這四個(gè)探針除中心位置外均相同并與參考序列互補(bǔ)。另一種方法是對(duì)于目標(biāo)序列上已知的突變點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)四組探針，其中每一組探針?lè)謩e檢測(cè)一種核苷酸替換。同一組中的各個(gè)探針長(zhǎng)度相同，相互之間交疊，并且每個(gè)探針均覆蓋對(duì)應(yīng)的突變點(diǎn)。28第二十八頁(yè)，共四十五頁(yè)。29第二十九頁(yè)，共四十五頁(yè)。3SNP分析同一物種的不同個(gè)體基因組約有99.9％相同，正是0.1％的不同才體現(xiàn)了個(gè)體的差異或多樣性。單核苷酸多態(tài)性（SNP)：是指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最小一種在群體中的頻率不小于1％。人-3％0.1％序列變化—1％---改變蛋白質(zhì)功能—900個(gè)基因產(chǎn)物不同。與生物進(jìn)化歷程、種族關(guān)系、疾病發(fā)生相關(guān)。30第三十頁(yè)，共四十五頁(yè)。4、基因表達(dá)分析基因表達(dá)是以基因的DNA為模板進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯合成的過(guò)程，各種基因的表達(dá)存在差異，一種組織中不同基因表達(dá)水平的差異可達(dá)1萬(wàn)倍。功能基因研究的一種重要的方法就是采用高通量基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)，全面分析基因的表達(dá)水平，了解基因的功能。31第三十一頁(yè)，共四十五頁(yè)。32第三十二頁(yè)，共四十五頁(yè)。5、尋找新基因在缺乏任何序列信息的條件下，基因芯片也可用于基因發(fā)現(xiàn)。如HME基因和黑色素瘤生長(zhǎng)刺激因子就是通過(guò)基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)的。目前，大量涌現(xiàn)的人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的序列資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中ESTs代表了人類基因，因此ESTs微陣列可在缺乏其它序列信息的條件下用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)檢測(cè)，從而加快人類基因組功能分析的進(jìn)程。

33第三十三頁(yè)，共四十五頁(yè)?！?.2蛋白質(zhì)芯片原理與應(yīng)用34第三十四頁(yè)，共四十五頁(yè)。蛋白質(zhì)芯片的提出DNA芯片的成功證明了生物芯片是可行的

DNA芯片對(duì)醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究產(chǎn)生了巨大影響

DNA芯片成為研究活體基因組的強(qiáng)有力工具DNA芯片不能作為蛋白質(zhì)檢測(cè)的直接依據(jù)

mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平不直接相關(guān)蛋白質(zhì)組計(jì)劃需要一種新的蛋白質(zhì)分析技術(shù)35第三十五頁(yè)，共四十五頁(yè)。盡管還存在許多問(wèn)題,2000年秋天,Schreiber小組展示了他們可以制造高密度蛋白質(zhì)芯片并且保持蛋白質(zhì)成鍵能力的技術(shù)。

36第三十六頁(yè)，共四十五頁(yè)。蛋白芯片技術(shù)的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測(cè)用的芯片；然后，用標(biāo)記了特定熒光抗體的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂洗將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去；再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到測(cè)定各種蛋白質(zhì)功能的目的。一、蛋白質(zhì)芯片基本原理蛋白質(zhì)固定（探針）雜交掃描成像或進(jìn)行質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)功能鑒定37第三十七頁(yè)，共四十五頁(yè)。38第三十八頁(yè)，共四十五頁(yè)。1）保持蛋白質(zhì)的活性。2）保證蛋白質(zhì)正確定位。3）與現(xiàn)存的mRNA芯片研究工具要相兼容。4）缺乏與PCR等價(jià)的蛋白質(zhì)擴(kuò)增技術(shù)，因而對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)是蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的極大挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)芯片要解決的問(wèn)題：39第三十九頁(yè)，共四十五頁(yè)。蛋白質(zhì)活性保持在制備芯片過(guò)程中,為了保證被固定在載體上的蛋白質(zhì)依然保持天然的構(gòu)象和生物學(xué)活性,他們?cè)诘鞍踪|(zhì)點(diǎn)樣的磷酸緩沖液（PBS)中加入40%的甘油,以防止因液體的蒸發(fā)而造成的蛋白質(zhì)變性。40第四十頁(yè)，共四十五頁(yè)。彈性蛋白模擬物亮氨酸鏈蛋白質(zhì)固定化學(xué)表面型蛋白質(zhì)芯片和生物表面型蛋白質(zhì)芯片?；瘜W(xué)表面芯片又可分為疏水型、親水型、弱陽(yáng)離子、強(qiáng)陰離子、金屬離子螯合、特異結(jié)合等，以適用檢測(cè)不同情況下蛋白表達(dá)。生物表面芯片人又可分為抗原-抗體、受體-配體、DNA－蛋白質(zhì)、酶等芯片。41第四十一頁(yè)，共四十五頁(yè)。二、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)具有快速、并行、自動(dòng)化和高通量的特點(diǎn),它能同時(shí)對(duì)全基因組水平的上千種不同蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,是蛋白質(zhì)組研究的重要手段。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜的分析、蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的研究、臨床疾病(如腫瘤等)的診斷和療效評(píng)價(jià)、藥物新靶點(diǎn)的篩選和新藥的研制等各個(gè)領(lǐng)域。42第四十二頁(yè)，共四十五頁(yè)。1、蛋白質(zhì)研究方面的應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)目前是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最具有應(yīng)用前景的一項(xiàng)技術(shù)。1）氨基酸序列測(cè)定（與質(zhì)譜聯(lián)用）。2）差異表達(dá)蛋白的篩選鑒定。43第四十三頁(yè)，共四十五頁(yè)。2研