結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)及質(zhì)量控制課件

精品課件精品課件結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)

及質(zhì)量控制結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)

及質(zhì)量控制2007-10-113結(jié)核菌培養(yǎng)2007-10-113結(jié)核菌培養(yǎng)酸性羅氏培養(yǎng)管上結(jié)核分枝桿菌菌落酸性羅氏培養(yǎng)管上結(jié)核分枝桿菌菌落結(jié)核分枝桿菌顯微鏡下形態(tài)結(jié)核分枝桿菌顯微鏡下形態(tài)2007-10-116培養(yǎng)目的：一：增加分枝桿菌生產(chǎn)率，早期生長、早期診斷；二：提高陽性率，使少數(shù)細(xì)菌亦能生長出來；三：進(jìn)一步進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和菌型鑒定。2007-10-116培養(yǎng)目的：一：增加分枝桿菌生產(chǎn)率，早期2007-10-117培養(yǎng)敏感性、特異性更強(qiáng),,理論上10-100條菌/毫升可檢出陽性；獲得分枝桿菌培養(yǎng)物，是進(jìn)一步檢測(cè)的基礎(chǔ)需時(shí)長,根據(jù)接種量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可見菌落。需要培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器、培養(yǎng)基凝固器等設(shè)備相對(duì)涂片技術(shù)要求較高成本是直接涂片法的7-8倍。2007-10-117培養(yǎng)據(jù)2001版伯杰金氏手冊(cè)，結(jié)核桿菌現(xiàn)屬于新成立的放線菌門、放線菌綱、放線菌亞綱、放線菌目、棒桿菌亞目、分支桿菌科據(jù)2001版伯杰金氏手冊(cè)，結(jié)核桿菌現(xiàn)屬于新成立的放線菌門、放

結(jié)核分枝桿菌（MTb）結(jié)核病的病原體1882年郭霍（RobertKoch）發(fā)現(xiàn)繁殖時(shí)有分支生長的趨勢(shì)，故稱分支桿菌具有抗酸性,又稱抗酸桿菌,用抗酸染色的方法檢查分枝桿菌分枝桿菌有致病性和非致病性兩大類主要引起肺結(jié)核的致病性分枝桿菌有人型、牛型、非洲、田鼠分枝桿菌

結(jié)核分枝桿菌（MTb）結(jié)核病的病原體

二、痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作

結(jié)核桿菌（MTb）形態(tài)(桿菌型)結(jié)核分支桿菌是專性需氧菌，無鞭毛、莢膜，無運(yùn)動(dòng)能力；結(jié)核桿菌在痰液中多為單個(gè)存在或形成分枝，有時(shí)呈V、Y、人字形排列，痰菌量多時(shí)可排列為束狀或集聚成團(tuán)。結(jié)核分枝桿菌由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核物質(zhì)組成。菌體內(nèi)可有2-5個(gè)或更多的小圓形易染顆粒，異染顆?？沙^菌體橫徑。

顯微鏡下結(jié)核分支桿菌形態(tài)顯微鏡下結(jié)核分支桿菌形態(tài)結(jié)核分枝桿菌顯微鏡下形態(tài)結(jié)核分枝桿菌顯微鏡下形態(tài)2007-10-1113結(jié)核分枝桿菌生長特性：

緩慢：在一般培養(yǎng)基上分裂一代需要10多小時(shí)，一般10-30天肉眼可見菌落生長。菌落形態(tài)（羅氏培養(yǎng)基）：粗糙、凸起、致密，有表面皺折，呈顆粒、結(jié)節(jié)或菜花樣，淺黃色或米色，不透明。2007-10-1113結(jié)核分枝桿菌生長特性：2007-10-11142007-10-11142007-10-1115基本步驟：

制備培養(yǎng)基標(biāo)本前處理（去污染）接種孵育報(bào)告結(jié)果2007-10-1115基本步驟：2007-10-1116

酸性羅氏（Lowenstein-Jensen）培養(yǎng)基

天門冬素3.6g

或谷氨酸鈉（純度99%以上）7.2gKH2PO414.0gMgSO4.7H2O0.24g枸櫞酸鎂0.6g丙三醇12ml蒸餾水600ml新鮮雞卵液1000ml2%孔雀綠20ml一、培養(yǎng)基2007-10-1116酸性羅氏（Lowenstein-J結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)及質(zhì)量控制課件2007-10-1118原理：分枝桿菌對(duì)酸堿有相對(duì)強(qiáng)的耐受力。目的：液化標(biāo)本、去除雜菌、分離出分枝桿菌原則：

-盡可能殺滅標(biāo)本中的雜菌

-盡可能保存標(biāo)本中的分枝桿菌二、標(biāo)本前處理2007-10-1118原理：分枝桿菌對(duì)酸堿有相對(duì)強(qiáng)的耐受力2007-10-1119

操作

痰標(biāo)本1－2倍4%NaOH振蕩勻化靜置15分鐘2007-10-1119操作痰標(biāo)本1－2倍振蕩勻化靜置152007-10-1120

37℃豎直培養(yǎng)8周均勻接種0.1ml,2支/標(biāo)本斜面向上，37℃水平放置24小時(shí)三、接種和孵育2007-10-112037℃豎直培養(yǎng)8周均勻接種0.1m2007-10-1121接種后第3、7天各觀察一次菌落生長情況此后每周觀察一次，直至滿8周記錄菌落生長及污染情況。四、結(jié)果的觀察與報(bào)告2007-10-1121接種后第3、7天各觀察一次菌落生長情2007-10-1122報(bào)告方式分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長菌落生長不足斜面面積1/4者，報(bào)實(shí)際菌落數(shù)。分枝桿菌培養(yǎng)陽性（1+）：菌落生長占斜面面積的1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2+）：菌落生長占斜面面積的1/2分枝桿菌培養(yǎng)陽性（3+）：菌落生長占斜面面積的3/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（4+）：菌落生長布滿整個(gè)斜面2007-10-1122報(bào)告方式2007-10-1123

分離培養(yǎng)流程:渦旋振蕩2-3次痰標(biāo)本中加入1-2倍體積4%NaOH分別接種0.1ml前處理液至2只培養(yǎng)基斜面接種后3天、7天觀察，此后每周觀察一次置37oC溫箱培養(yǎng)有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認(rèn)，至第8周無菌落生長報(bào)告陰性室溫靜置15分鐘43256712007-10-1123分離培養(yǎng)流程:渦旋振蕩痰標(biāo)本中加入2007-10-1124涂陽培陰率過高？2007-10-1124涂陽培陰率過高？2007-10-1125污染率過高？2007-10-1125污染率過高？2007-10-1126菌種保存原則：一個(gè)有利的休眠環(huán)境，干燥、低溫、缺氧、缺乏營養(yǎng)和添加保護(hù)劑等。一：長期保存

1ml分枝桿菌菌液經(jīng)離心沉淀后，去上清，將沉淀懸浮于1ml7H-9OADC-0.5%TWEEN80-50%丙三醇中，-70oC保存。

OADC:0.5%BSA、0.2%葡萄糖、0.06%油酸、140mmol/LNaCl和0.05%Tween802007-10-1126菌種保存原則：一個(gè)有利的休眠環(huán)境，干2007-10-1127二：短期保存

1.1ml分枝桿菌菌液-70oC保存；

2.羅氏培養(yǎng)基上菌落加無菌液體石蠟后，4oC保存。2007-10-1127二：短期保存結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)質(zhì)量控制目前缺少標(biāo)準(zhǔn)的分離培養(yǎng)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法?。〗Y(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)質(zhì)量控制結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)1.建立標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室2.快速/安全的標(biāo)本運(yùn)輸工作系統(tǒng)3.便于患者標(biāo)本集中培養(yǎng)4.安全可靠的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)備和材料5.工作人員培訓(xùn)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)1.建立標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的基本要求房間及設(shè)施：一個(gè)獨(dú)立房間、有上下水及電的供應(yīng)、通風(fēng)和照明良好儀器：培養(yǎng)箱、冰箱（4℃）、蒸汽凝固滅菌器（若自制培養(yǎng)基）、渦旋振蕩器、定時(shí)器、酒精燈耗材：痰盒、培養(yǎng)管及架移液、管廢液（物）缸試劑:氫氧化鈉、蒸餾水、磷酸二氫鉀、硫酸鎂·7H2O、檸檬酸鎂、谷氨酸鈉、孔雀綠、鮮雞蛋（若自制培養(yǎng)基）生物安全：Ⅱ型生物安全柜、高壓滅菌鍋、紫外燈、消毒劑、工作服、口罩、帽、手套分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的基本要求房間及設(shè)施：一個(gè)獨(dú)立房間、有上下水及按照高致病性病原微生物的要求進(jìn)行檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為P2或P2以上級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)有二級(jí)生物安全柜；標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程；良好的個(gè)人防護(hù)措施以及定期對(duì)操作人員進(jìn)行體檢并進(jìn)行生物安全培訓(xùn)；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有完善的規(guī)章制度和應(yīng)急預(yù)案等。分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室生物安全基本要求按照高致病性病原微生物的要求進(jìn)行檢測(cè)；分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室生物安全如何獲得合格標(biāo)本

標(biāo)本采集：痰液應(yīng)來自患者肺部。痰標(biāo)本應(yīng)以膿痰、血痰、干酪痰或粘液痰為合格痰標(biāo)本，唾液和口水為不合格標(biāo)本。按照標(biāo)本采集時(shí)間分為即時(shí)痰、夜間痰、晨痰。肺結(jié)核病人結(jié)核桿菌檢出率與痰標(biāo)本采集的好壞有直接關(guān)系。醫(yī)生或檢驗(yàn)人員應(yīng)告訴初診病人留取合格痰標(biāo)本的方法。

如何獲得合格標(biāo)本標(biāo)本采集：如何獲得合格標(biāo)本標(biāo)本保藏和運(yùn)送：在運(yùn)送可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本時(shí)，須按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》的要求進(jìn)行審批、包裝、運(yùn)輸、操作、保藏和管理。采集后立即送檢，當(dāng)天不能檢查的痰標(biāo)本置4oC冰箱保存。外送標(biāo)本要認(rèn)真核對(duì)痰盒和化驗(yàn)單上姓名、序號(hào)等項(xiàng)目，7天內(nèi)必須進(jìn)行培養(yǎng)。如何獲得合格標(biāo)本標(biāo)本保藏和運(yùn)送：結(jié)核菌培養(yǎng)及藥敏標(biāo)本采集送檢須知結(jié)核菌培養(yǎng)及藥敏標(biāo)本采集送檢須知培養(yǎng)一些指標(biāo)污染率:3-5%(固體培養(yǎng));5-10%(液體培養(yǎng))陽性結(jié)果需要的平均時(shí)間

:4-5周涂陰培陽率:<10%培養(yǎng)一些指標(biāo)污染率:3-5%(固體培養(yǎng));5-10%影響因素：培養(yǎng)基質(zhì)量NaOH的量消化時(shí)間離心力離心時(shí)間接種量培養(yǎng)箱的溫度影響因素：分枝桿菌藥敏試驗(yàn)

分枝桿菌藥敏試驗(yàn)我國是高耐藥國家2010年第五次流行病調(diào)查總耐藥：37.79%初治：35.16%復(fù)治：55.17%MDR:8.36%XDR:0.6%我國是高耐藥國家2010年第五次流行病調(diào)查

耐藥性檢測(cè)目的指導(dǎo)用藥化療前藥敏————選擇用藥療效不佳時(shí)藥敏——觀察有無耐藥性、調(diào)整用藥監(jiān)測(cè)社會(huì)中耐藥結(jié)核菌株的流行情況評(píng)價(jià)和改進(jìn)國家結(jié)核病控制措施的重要參考因素之一。耐藥性檢測(cè)目的指導(dǎo)用藥耐藥性檢測(cè)指針初治結(jié)核病人觀察起始耐藥菌感染復(fù)發(fā)結(jié)核病人痰菌陰轉(zhuǎn)后復(fù)陽的病人化療3~6個(gè)月痰菌持續(xù)陽性者痰菌減少后又持續(xù)增加者非結(jié)核分枝桿菌感染者結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查耐藥性檢測(cè)指針初治結(jié)核病人觀察起始耐藥菌感染耐藥性測(cè)定常用方法絕對(duì)濃度法:是我國30多年來一直沿用的藥敏試驗(yàn)方法，為目前我國大多數(shù)結(jié)核病?？漆t(yī)院常規(guī)使用的用于臨床檢測(cè)的方法。比例法:是WHO全球耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)方法，目前為我國流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和耐多藥結(jié)核病規(guī)劃管理項(xiàng)目所采用的方法。二者在臨界藥物濃度接種菌量、結(jié)果判讀方法等方面都有一定差別。耐藥性測(cè)定常用方法絕對(duì)濃度法:是我國30多年來一直沿用的藥比例法

該法是WHO全球耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)方法。它是二種濃度的細(xì)菌接種在一種濃度的含藥培養(yǎng)基上，以計(jì)算耐藥百分比:

含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上菌落數(shù)*100%，若耐藥百分比大于1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。

比例法

該法是WHO全球耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中推薦的標(biāo)比例法

比例法藥敏試驗(yàn)藥物終濃度藥物L(fēng)-J培養(yǎng)基中最終藥物（ug/ml）

INH（異煙肼）0.2SM（鏈霉素）4.0EMB（乙胺丁醇）2.0RFP（利福平）40.0OFX（氧氟沙星）2.0K（卡那霉素）30.0AK（阿米卡星）30.0CPM（卷曲霉素）40.0

比例法結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)及質(zhì)量控制課件藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)備藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)備比例法

菌液制備和稀釋用接種環(huán)刮取生長旺盛的菌落（注意不要取個(gè)別菌落，要廣泛取樣）置于加有少許PBＳ緩沖液的磨菌管底部，充分研磨，使呈乳酪樣均勻菌液，用比濁管比濁配成1mg/ml菌液。用刻度吸管或22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)沾取2滿環(huán)１mg/ml的菌液，移至2ml滅菌生理鹽水中，即稀釋成10-2mg/ml菌液；用同樣方法再進(jìn)行100倍稀釋，即成10-4mg/ml菌液。（注：22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)：金屬絲直徑0.7mm,接種環(huán)內(nèi)徑3mm，滿環(huán)移液0.01ml）。比例法菌液制備和稀釋比例法

接種和培養(yǎng)用22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別沾取1環(huán)（即0.01ml）10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用劃線法均勻接種至對(duì)照及含藥培養(yǎng)基表面，應(yīng)注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基斜面。最終接種菌量為10-4mg和10-6mg。接種后的培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，至4周后報(bào)告結(jié)果。比例法接種和培養(yǎng)比例法

結(jié)果報(bào)告記錄并報(bào)告菌落生長情況融合成片（≥500個(gè)菌落）4+

大部分融合（200～500個(gè)菌落）3+100～200個(gè)菌落2+50～100個(gè)菌落1+<50個(gè)菌落報(bào)告菌落實(shí)數(shù)比例法結(jié)果報(bào)告比例法

結(jié)果報(bào)告及解釋計(jì)算耐藥百分比:耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上菌落數(shù)*100%若耐藥百分比大于1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。比例法結(jié)果報(bào)告及解釋國家參比實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)對(duì)各省參比實(shí)驗(yàn)室的熟練度測(cè)試，每年一次。每套熟練度測(cè)試的菌株的不少于30管培養(yǎng)物。測(cè)試菌中應(yīng)包括不同耐藥譜的菌株和一定數(shù)量的敏感菌株。國家參比實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)對(duì)各省參比實(shí)驗(yàn)室的熟練度測(cè)試，每年一次。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)及質(zhì)量控制課件精品課件精品課件結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)

及質(zhì)量控制結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)

及質(zhì)量控制2007-10-1154結(jié)核菌培養(yǎng)2007-10-113結(jié)核菌培養(yǎng)酸性羅氏培養(yǎng)管上結(jié)核分枝桿菌菌落酸性羅氏培養(yǎng)管上結(jié)核分枝桿菌菌落結(jié)核分枝桿菌顯微鏡下形態(tài)結(jié)核分枝桿菌顯微鏡下形態(tài)2007-10-1157培養(yǎng)目的：一：增加分枝桿菌生產(chǎn)率，早期生長、早期診斷；二：提高陽性率，使少數(shù)細(xì)菌亦能生長出來；三：進(jìn)一步進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和菌型鑒定。2007-10-116培養(yǎng)目的：一：增加分枝桿菌生產(chǎn)率，早期2007-10-1158培養(yǎng)敏感性、特異性更強(qiáng),,理論上10-100條菌/毫升可檢出陽性；獲得分枝桿菌培養(yǎng)物，是進(jìn)一步檢測(cè)的基礎(chǔ)需時(shí)長,根據(jù)接種量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可見菌落。需要培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器、培養(yǎng)基凝固器等設(shè)備相對(duì)涂片技術(shù)要求較高成本是直接涂片法的7-8倍。2007-10-117培養(yǎng)據(jù)2001版伯杰金氏手冊(cè)，結(jié)核桿菌現(xiàn)屬于新成立的放線菌門、放線菌綱、放線菌亞綱、放線菌目、棒桿菌亞目、分支桿菌科據(jù)2001版伯杰金氏手冊(cè)，結(jié)核桿菌現(xiàn)屬于新成立的放線菌門、放

結(jié)核分枝桿菌（MTb）結(jié)核病的病原體1882年郭霍（RobertKoch）發(fā)現(xiàn)繁殖時(shí)有分支生長的趨勢(shì)，故稱分支桿菌具有抗酸性,又稱抗酸桿菌,用抗酸染色的方法檢查分枝桿菌分枝桿菌有致病性和非致病性兩大類主要引起肺結(jié)核的致病性分枝桿菌有人型、牛型、非洲、田鼠分枝桿菌

結(jié)核分枝桿菌（MTb）結(jié)核病的病原體

二、痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作

結(jié)核桿菌（MTb）形態(tài)(桿菌型)結(jié)核分支桿菌是專性需氧菌，無鞭毛、莢膜，無運(yùn)動(dòng)能力；結(jié)核桿菌在痰液中多為單個(gè)存在或形成分枝，有時(shí)呈V、Y、人字形排列，痰菌量多時(shí)可排列為束狀或集聚成團(tuán)。結(jié)核分枝桿菌由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核物質(zhì)組成。菌體內(nèi)可有2-5個(gè)或更多的小圓形易染顆粒，異染顆?？沙^菌體橫徑。

顯微鏡下結(jié)核分支桿菌形態(tài)顯微鏡下結(jié)核分支桿菌形態(tài)結(jié)核分枝桿菌顯微鏡下形態(tài)結(jié)核分枝桿菌顯微鏡下形態(tài)2007-10-1164結(jié)核分枝桿菌生長特性：

緩慢：在一般培養(yǎng)基上分裂一代需要10多小時(shí)，一般10-30天肉眼可見菌落生長。菌落形態(tài)（羅氏培養(yǎng)基）：粗糙、凸起、致密，有表面皺折，呈顆粒、結(jié)節(jié)或菜花樣，淺黃色或米色，不透明。2007-10-1113結(jié)核分枝桿菌生長特性：2007-10-11652007-10-11142007-10-1166基本步驟：

制備培養(yǎng)基標(biāo)本前處理（去污染）接種孵育報(bào)告結(jié)果2007-10-1115基本步驟：2007-10-1167

酸性羅氏（Lowenstein-Jensen）培養(yǎng)基

天門冬素3.6g

或谷氨酸鈉（純度99%以上）7.2gKH2PO414.0gMgSO4.7H2O0.24g枸櫞酸鎂0.6g丙三醇12ml蒸餾水600ml新鮮雞卵液1000ml2%孔雀綠20ml一、培養(yǎng)基2007-10-1116酸性羅氏（Lowenstein-J結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)及質(zhì)量控制課件2007-10-1169原理：分枝桿菌對(duì)酸堿有相對(duì)強(qiáng)的耐受力。目的：液化標(biāo)本、去除雜菌、分離出分枝桿菌原則：

-盡可能殺滅標(biāo)本中的雜菌

-盡可能保存標(biāo)本中的分枝桿菌二、標(biāo)本前處理2007-10-1118原理：分枝桿菌對(duì)酸堿有相對(duì)強(qiáng)的耐受力2007-10-1170

操作

痰標(biāo)本1－2倍4%NaOH振蕩勻化靜置15分鐘2007-10-1119操作痰標(biāo)本1－2倍振蕩勻化靜置152007-10-1171

37℃豎直培養(yǎng)8周均勻接種0.1ml,2支/標(biāo)本斜面向上，37℃水平放置24小時(shí)三、接種和孵育2007-10-112037℃豎直培養(yǎng)8周均勻接種0.1m2007-10-1172接種后第3、7天各觀察一次菌落生長情況此后每周觀察一次，直至滿8周記錄菌落生長及污染情況。四、結(jié)果的觀察與報(bào)告2007-10-1121接種后第3、7天各觀察一次菌落生長情2007-10-1173報(bào)告方式分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長菌落生長不足斜面面積1/4者，報(bào)實(shí)際菌落數(shù)。分枝桿菌培養(yǎng)陽性（1+）：菌落生長占斜面面積的1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2+）：菌落生長占斜面面積的1/2分枝桿菌培養(yǎng)陽性（3+）：菌落生長占斜面面積的3/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（4+）：菌落生長布滿整個(gè)斜面2007-10-1122報(bào)告方式2007-10-1174

分離培養(yǎng)流程:渦旋振蕩2-3次痰標(biāo)本中加入1-2倍體積4%NaOH分別接種0.1ml前處理液至2只培養(yǎng)基斜面接種后3天、7天觀察，此后每周觀察一次置37oC溫箱培養(yǎng)有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認(rèn)，至第8周無菌落生長報(bào)告陰性室溫靜置15分鐘43256712007-10-1123分離培養(yǎng)流程:渦旋振蕩痰標(biāo)本中加入2007-10-1175涂陽培陰率過高？2007-10-1124涂陽培陰率過高？2007-10-1176污染率過高？2007-10-1125污染率過高？2007-10-1177菌種保存原則：一個(gè)有利的休眠環(huán)境，干燥、低溫、缺氧、缺乏營養(yǎng)和添加保護(hù)劑等。一：長期保存

1ml分枝桿菌菌液經(jīng)離心沉淀后，去上清，將沉淀懸浮于1ml7H-9OADC-0.5%TWEEN80-50%丙三醇中，-70oC保存。

OADC:0.5%BSA、0.2%葡萄糖、0.06%油酸、140mmol/LNaCl和0.05%Tween802007-10-1126菌種保存原則：一個(gè)有利的休眠環(huán)境，干2007-10-1178二：短期保存

1.1ml分枝桿菌菌液-70oC保存；

2.羅氏培養(yǎng)基上菌落加無菌液體石蠟后，4oC保存。2007-10-1127二：短期保存結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)質(zhì)量控制目前缺少標(biāo)準(zhǔn)的分離培養(yǎng)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法??！結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)質(zhì)量控制結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)1.建立標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室2.快速/安全的標(biāo)本運(yùn)輸工作系統(tǒng)3.便于患者標(biāo)本集中培養(yǎng)4.安全可靠的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)備和材料5.工作人員培訓(xùn)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)1.建立標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的基本要求房間及設(shè)施：一個(gè)獨(dú)立房間、有上下水及電的供應(yīng)、通風(fēng)和照明良好儀器：培養(yǎng)箱、冰箱（4℃）、蒸汽凝固滅菌器（若自制培養(yǎng)基）、渦旋振蕩器、定時(shí)器、酒精燈耗材：痰盒、培養(yǎng)管及架移液、管廢液（物）缸試劑:氫氧化鈉、蒸餾水、磷酸二氫鉀、硫酸鎂·7H2O、檸檬酸鎂、谷氨酸鈉、孔雀綠、鮮雞蛋（若自制培養(yǎng)基）生物安全：Ⅱ型生物安全柜、高壓滅菌鍋、紫外燈、消毒劑、工作服、口罩、帽、手套分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的基本要求房間及設(shè)施：一個(gè)獨(dú)立房間、有上下水及按照高致病性病原微生物的要求進(jìn)行檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為P2或P2以上級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)有二級(jí)生物安全柜；標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程；良好的個(gè)人防護(hù)措施以及定期對(duì)操作人員進(jìn)行體檢并進(jìn)行生物安全培訓(xùn)；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有完善的規(guī)章制度和應(yīng)急預(yù)案等。分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室生物安全基本要求按照高致病性病原微生物的要求進(jìn)行檢測(cè)；分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室生物安全如何獲得合格標(biāo)本

標(biāo)本采集：痰液應(yīng)來自患者肺部。痰標(biāo)本應(yīng)以膿痰、血痰、干酪痰或粘液痰為合格痰標(biāo)本，唾液和口水為不合格標(biāo)本。按照標(biāo)本采集時(shí)間分為即時(shí)痰、夜間痰、晨痰。肺結(jié)核病人結(jié)核桿菌檢出率與痰標(biāo)本采集的好壞有直接關(guān)系。醫(yī)生或檢驗(yàn)人員應(yīng)告訴初診病人留取合格痰標(biāo)本的方法。

如何獲得合格標(biāo)本標(biāo)本采集：如何獲得合格標(biāo)本標(biāo)本保藏和運(yùn)送：在運(yùn)送可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本時(shí)，須按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》的要求進(jìn)行審批、包裝、運(yùn)輸、操作、保藏和管理。采集后立即送檢，當(dāng)天不能檢查的痰標(biāo)本置4oC冰箱保存。外送標(biāo)本要認(rèn)真核對(duì)痰盒和化驗(yàn)單上姓名、序號(hào)等項(xiàng)目，7天內(nèi)必須進(jìn)行培養(yǎng)。如何獲得合格標(biāo)本標(biāo)本保藏和運(yùn)送：結(jié)核菌培養(yǎng)及藥敏標(biāo)本采集送檢須知結(jié)核菌培養(yǎng)及藥敏標(biāo)本采集送檢須知培養(yǎng)一些指標(biāo)污染率:3-5%(固體培養(yǎng));5-10%(液體培養(yǎng))陽性結(jié)果需要的平均時(shí)間

:4-5周涂陰培陽率:<10%培養(yǎng)一些指標(biāo)污染率:3-5%(固體培養(yǎng));5-10%影響因素：培養(yǎng)基質(zhì)量NaOH的量消化時(shí)間離心力離心時(shí)間接種量培養(yǎng)箱的溫度影響因素：分枝桿菌藥敏試驗(yàn)

分枝桿菌藥敏試驗(yàn)我國是高耐藥國家2010年第五次流行病調(diào)查總耐藥：37.79%初治：35.16%復(fù)治：55.17%MDR:8.36%XDR:0.6%我國是高耐藥國家2010年第五次流行病調(diào)查

耐藥性檢測(cè)目的指導(dǎo)用藥化療前藥敏————選擇用藥療效不佳時(shí)藥敏——觀察有無耐藥性、調(diào)整用藥監(jiān)測(cè)社會(huì)中耐藥結(jié)核菌株的流行情況評(píng)價(jià)和改進(jìn)國家結(jié)核病控制措施的重要參考因素之一。耐藥性檢測(cè)目的指導(dǎo)用藥耐藥性檢測(cè)指針初治結(jié)核病人觀察起始耐藥菌感染復(fù)發(fā)結(jié)核病人痰菌陰轉(zhuǎn)后復(fù)陽的病人化療3~6個(gè)月痰菌持續(xù)陽性者痰菌減少后又持續(xù)增加者非結(jié)核分枝桿菌感染者結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查耐藥性檢測(cè)指針初治結(jié)核病人觀察起始耐藥菌感染耐藥性測(cè)定常用方法絕對(duì)濃度法:是我國30多年來一直沿用的藥敏試驗(yàn)方法，為目前我國大多數(shù)結(jié)核病專科醫(yī)院常規(guī)使用的用于臨床檢測(cè)的方法。比例法:是WHO全球耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)方法，目前為我國流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和耐多藥結(jié)核病規(guī)劃管理項(xiàng)目所采用的方法。二者在臨界藥物濃度接種菌量、結(jié)果判讀方法等方面都有一定差別。耐藥性測(cè)定常用方法絕對(duì)濃度法:是我國30多年來一直沿用的藥比例法

該法是WHO全球耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)方法。它是二種濃度的細(xì)菌接種在一種濃度的含藥培養(yǎng)基上，以計(jì)算耐藥百分比:

含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上菌落數(shù)*100%，若耐藥百分比大于1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。

比例法

該法是WHO全球耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中推薦的標(biāo)比例法

比例法藥敏試驗(yàn)藥物終濃度藥物L(fēng)-J培養(yǎng)基中最終藥物（ug/ml）

INH（異煙肼）0.2SM（鏈霉素）4.0