蛋白質(zhì)分析和膜泡轉(zhuǎn)運

關(guān)于蛋白質(zhì)分析和膜泡轉(zhuǎn)運第1頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六第一節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分選

細胞內(nèi)合成的蛋白質(zhì)之所以能夠定向的轉(zhuǎn)運到特定的細胞器取決于蛋白質(zhì)中包含的特殊信號序列和細胞器上特定的信號識別裝置。第2頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六一、信號假說與蛋白質(zhì)分選信號蛋白質(zhì)的分選（proteinsorting）信號序列的發(fā)現(xiàn)和證實1972年Milstein等發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細胞中提取的免疫球蛋白分子的N端要比分泌到細胞外的免疫球蛋白分子N端的氨基酸序列多出一截。1975年Blobel和Sabatini等提出了”信號假說“布洛貝爾因為發(fā)現(xiàn)“蛋白質(zhì)具有控制其在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移和定位的信號”而獲得1999年度諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎。

G.Blobel第3頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六1.信號假說信號肽（signalpeptide）信號識別顆粒（signalrecognitionparticle，SRP）信號識別顆粒的受體（又稱停泊蛋白，dockingprotein，DP）第4頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（1）信號肽（signalpeptide）位于蛋白質(zhì)的N端，一般由16～26個殘基組成包括疏水核心區(qū)、信號肽的C端和N端等3部分原核細胞某些分泌性蛋白的N端也具有信號序列信號肽的一級結(jié)構(gòu)序列第5頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六信號肽似乎沒有嚴格的專一性第6頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（2）信號識別顆粒（SRP）由6種不同的蛋白質(zhì)和一個由300個核苷酸組成的7SRNA結(jié)合組成的一種核糖核蛋白復(fù)合體第7頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六蛋白質(zhì)翻譯過程與SRP、DP和微粒體的關(guān)系體外非細胞系統(tǒng)（cellfreesystem）進行蛋白質(zhì)合成實驗，證實分泌性蛋白向rER（微粒體）腔內(nèi)的轉(zhuǎn)運是同蛋白質(zhì)翻譯過程偶聯(lián)進行的，這種分泌蛋白在信號肽引導(dǎo)下邊翻譯邊跨膜轉(zhuǎn)運的過程稱為共翻譯轉(zhuǎn)運（cotranslationaltranslocation）第8頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（3）分泌性蛋白的合成與其共翻譯轉(zhuǎn)運分泌性蛋白的合成與其跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的共翻譯轉(zhuǎn)運圖解圖示信號肽、SRP、DP及移位子之間的相互作用第9頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（3）分泌性蛋白的合成與其共翻譯轉(zhuǎn)運第10頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（3）分泌性蛋白的合成與其共翻譯轉(zhuǎn)運第11頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（4）膜整合蛋白的信號序列開始轉(zhuǎn)移序列（starttransfersequence）內(nèi)在停止轉(zhuǎn)移錨定序列（internalstop-transferanchor

sequence,STA）內(nèi)在信號錨定序列（internalsignalanchorsequence,SA）第12頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜整合蛋白的拓撲學(xué)類型第13頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六2.蛋白質(zhì)分選信號序列第14頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六信號肽與信號斑第15頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六二、蛋白質(zhì)分選轉(zhuǎn)運的基本途徑與類型途徑（1）后翻譯轉(zhuǎn)運途徑（2）共翻譯轉(zhuǎn)運途徑類型（1）蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運（2）膜泡運輸（3）選擇性的門控轉(zhuǎn)運（4）細胞質(zhì)基質(zhì)中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運第16頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六1.翻譯后轉(zhuǎn)運途徑：在細胞質(zhì)基質(zhì)游離核糖體上完成多肽鏈合成，然后轉(zhuǎn)運至膜圍繞的細胞器，如線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、細胞核及細胞質(zhì)基質(zhì)的特定部位。2.共翻譯轉(zhuǎn)運途徑：蛋白質(zhì)合成起始后轉(zhuǎn)移至粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，新生肽邊合成邊轉(zhuǎn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，隨后經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運至溶酶體、細胞膜或分泌到細胞外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體本身的蛋白也是通過這條途徑分選的。蛋白質(zhì)分選的基本途徑第17頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六跨膜轉(zhuǎn)運：主要指再細胞質(zhì)基質(zhì)中合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體（包括葉綠體）和過氧化物酶體等細胞器。膜泡運輸：蛋白質(zhì)通過不同類型的轉(zhuǎn)運小泡從糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成部位轉(zhuǎn)運至高爾基體，進而分選轉(zhuǎn)運至細胞的不同部位，其中涉及各種不同的運輸小泡的定向轉(zhuǎn)運，以及膜泡出芽與融合的過程。選擇性的門控轉(zhuǎn)運：在細胞質(zhì)基質(zhì)中合成的蛋白質(zhì)通過核孔復(fù)合體選擇性地完成核輸入或從細胞核返回細胞質(zhì)（核輸出）。細胞質(zhì)基質(zhì)中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運：可能與細胞骨架系統(tǒng)相關(guān)。蛋白質(zhì)分選轉(zhuǎn)運的4種基本類型第18頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六真核細胞蛋白質(zhì)分選的主要途徑與類型第19頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六三、蛋白質(zhì)向線粒體、葉綠體和過氧化物酶體的分選信號肽導(dǎo)肽轉(zhuǎn)運肽PTS1/PTS2核定位信號NLS第20頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（一）蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體基質(zhì)蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體膜間隙第21頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體基質(zhì)線粒體蛋白通過3種途徑從細胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體內(nèi)膜線粒體蛋白通過兩種途徑從細胞質(zhì)基質(zhì)輸入到線粒體膜間隙核基因編碼的線粒體蛋白的轉(zhuǎn)運第22頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（二）葉綠體基質(zhì)蛋白與類囊體蛋白的靶向輸入外膜蛋白內(nèi)膜蛋白葉綠體基質(zhì)蛋白類囊體膜蛋白類囊體腔蛋白第23頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六葉綠體蛋白從細胞質(zhì)基質(zhì)輸入到類囊體腔第24頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六（三）過氧化物酶體蛋白的分選C端SKL(Ser-Lys-Leu)靶向序列可溶性細胞質(zhì)受體過氧化物酶體膜受體信號序列不被切除ATP水解(?)第25頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六第二節(jié)膜泡轉(zhuǎn)運第26頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六細胞猶如繁忙而巨大的港口，將正確的貨物在正確的時間運送到正確的地點是最為要緊的，囊泡就是港口的“穿梭巴士”。人們早已了解大量分子(即“乘客”)是“搭乘”囊泡在細胞內(nèi)外往來，卻一直不了解這輛巴士是如何確定自己的啟程時間及目的地的。第27頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六JamesE.RothmanRandyW.SchekmanThomasC.SüdhofPrizemotivation:"fortheirdiscoveriesofmachineryregulatingvesicletraffic,amajortransportsysteminourcells"2013NobelPrizeinPhysiologyandMedicine第28頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六蘭迪·謝克曼

早在上世紀(jì)70年代，蘭迪·謝克曼便利用酵母作為模型，開始研究其遺傳學(xué)基礎(chǔ)。在基因篩選過程中，謝克曼分離出一類異常轉(zhuǎn)運機制的酵母細胞。這株酵母的“運輸狀況”與混亂的公共交通系統(tǒng)類似，囊泡都堆積在細胞的某一個角落。隨后，謝克曼發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致這一擁堵狀況的罪魁禍?zhǔn)住?類編碼調(diào)節(jié)囊泡運輸關(guān)鍵蛋白的基因。第29頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六上世紀(jì)80年代~90年代，詹姆斯·羅斯曼在哺乳動物細胞研究中發(fā)現(xiàn)了囊泡與“乘客”精確對接的奧秘——囊泡的膜及目的細胞器的膜上均有高度特異性的蛋白復(fù)合物，兩者能夠像拉鏈一樣緊密嵌合，從而使囊泡融合到細胞膜之中，由此解決了囊泡“釋放”問題，確保了“乘客”準(zhǔn)確、及時到達。更為重要的是，回顧蘭迪·謝克曼發(fā)現(xiàn)的控制囊泡運輸?shù)年P(guān)鍵基因中，含有編碼詹姆斯·羅斯曼教授所發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的基因，說明囊泡運輸在進化上的保守性。從低等生物(酵母)到高等生物(哺乳動物)均存在囊泡運輸，說明它是生命活動的基本途徑。第30頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六如果說羅斯曼與謝克曼的發(fā)現(xiàn)可以解釋囊泡作為一輛“穿梭巴士”是如何準(zhǔn)確接送“乘客”的，那么祖德霍夫的研究成果則闡明細胞運輸系統(tǒng)在時間上的精確性，并指出“乘客”須有指令方能下車的信號問題。上世紀(jì)90年代，祖德霍夫聚焦于神經(jīng)細胞中的鈣離子敏感蛋白，描摹出鈣離子流動的分子機制，并發(fā)現(xiàn)了突觸囊泡感受外界信號的關(guān)鍵因子和關(guān)鍵蛋白——鈣離子和鈣結(jié)合蛋白，通過它們，突觸小泡接受信號，快速準(zhǔn)確地釋放，完成神經(jīng)信號的傳遞。第31頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六一、膜泡運輸概觀1.蛋白質(zhì)在rER合成，通過共翻譯轉(zhuǎn)運途徑跨膜運輸2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽，形成轉(zhuǎn)運膜泡并與高爾基體融合3.從高爾基體順面膜囊和高爾基體順面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)到rER的逆向運輸4.高爾基體膜囊從順面→反面成熟遞進（非膜泡過程）5.從高爾基體后期膜囊→早期膜囊的逆向運輸6.組成型分泌7.調(diào)節(jié)型分泌8.分選到溶酶體9.胞吞途徑蛋白質(zhì)的分泌與胞吞途徑概觀第32頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六三種包被的膜泡COPⅡ（coatproteinⅡ）包被膜泡COPⅠ（coatproteinⅠ）包被膜泡網(wǎng)格蛋白/接頭蛋白（clathrin/adaptorprotein）包被膜泡第33頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六三種包被膜泡特征比較第34頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六二、COPⅡ包被膜泡的裝配與運輸COPⅡ包被蛋白組分小分子GTP結(jié)合蛋白Sar1Sec23/Sec24復(fù)合物Sec13/Sec31復(fù)合物大的纖維蛋白Sec16第35頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六細胞質(zhì)中可溶性Sar1-GDP與ER膜蛋白Sec12（鳥苷酸交換因子）相互作用，催化GTP置換GDP形成Sar1-GTP，GTP的結(jié)合引發(fā)Sar1構(gòu)象改變暴露出疏水N端并插入ER膜，膜結(jié)合Sar1對包被蛋白進一步裝配起募集者作用小分子GTP結(jié)合蛋白Sar1第36頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六1.Sar1與膜結(jié)合GTP交換2.COPⅡ包被裝配3.GTP水解4.COPⅡ包被去裝配Sar1蛋白在CopⅡ包被膜泡裝配與去裝配中作用第37頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間，分別由COPⅡ和COPⅠ膜泡介導(dǎo)蛋白質(zhì)順向和逆向轉(zhuǎn)運不同類型的膜泡運輸?shù)?8頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六KDEL受體在從高爾基體回收內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔駐留蛋白中的作用不同類型的膜泡運輸?shù)?9頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六在供體膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽及其轉(zhuǎn)運蛋白的包裝示意圖不同類型的膜泡運輸?shù)?0頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六三、COPⅠ包被膜泡的裝配與運輸COPⅠ包被含有7種不同的蛋白質(zhì)亞基和一種調(diào)節(jié)膜泡轉(zhuǎn)運的GTP結(jié)合蛋白ARF。ARF也是一種結(jié)合GDP/GTP轉(zhuǎn)換的分子開關(guān)調(diào)控蛋白。包被蛋白復(fù)合物的裝配與去裝配依賴于ARF所結(jié)合的核苷酸交換與水解過程第41頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六KDEL的受體主要定位在高爾基體TGN區(qū)、COPⅡ和COPⅠ包被膜泡的膜上，它們能識別并結(jié)合KDEL分選信號。如果在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生錯誤包裝和轉(zhuǎn)運，由于COPⅠ膜泡上也有KDEL受體，所以也能保證逃逸蛋白被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收KDEL的受體第42頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六四、網(wǎng)格蛋白/接頭蛋白包被膜泡的裝配與運輸網(wǎng)格蛋白/接頭蛋白包被膜泡介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分選途徑從高爾基體TGN向胞內(nèi)體或向溶酶體、黑（色）素體、血小板囊泡和液泡的運輸受體介導(dǎo)的胞吞途徑中負責(zé)將物質(zhì)從細胞表面運往胞內(nèi)體轉(zhuǎn)而到溶酶體的運輸?shù)?3頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六網(wǎng)格蛋白及其包被膜泡的形成第44頁，共51頁，2022年，5月20日，7點45分，星期六五、轉(zhuǎn)運膜泡與靶膜的錨定與融合①供體膜的出芽、裝配和斷裂，形成不同的包被轉(zhuǎn)運膜泡②在細胞內(nèi)由馬達蛋白驅(qū)動