生物化學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)展-pcr技術(shù)2016級

中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué) 神奇而又簡單的PCRPCR可以在3小時內(nèi)把指數(shù)放PCRPCR：PolymeraseChain一、最初的理論描述—Khorana(1971)等最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNA?！钡捎诋?dāng)時序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未以及引物合成的，這種想法似乎沒有實(shí)際意義。加上70年代初分子克隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克隆和擴(kuò)增的途徑，所以，Khorana的設(shè)想們遺1985年，1985年，KaryMullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了Mullis要合成DNA引物來進(jìn)夠多的模板DNA序工作，卻常為沒有1983年4月的一個星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上二、二、PCR技術(shù)的發(fā)明—KaryPCR從構(gòu)想成為現(xiàn)1983年12Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個循環(huán)后的49長度的第一個PCR片段 號4,683,202），Mullis是第一發(fā)明人；在Science雜志 了第一篇PCR的學(xué)，Mullis是共同作者 有關(guān)PCR

PCRPCRPCR標(biāo)準(zhǔn)的PCR標(biāo)準(zhǔn)的PCR 各 各0.1～1.0TaqDNA聚合 0.5～緩沖液（Mg2+）1.5～模板 有關(guān)PCR有關(guān)PCR1983

有關(guān)PCR反

55℃退94℃變55℃退 XX℃延伸（DNA聚合酶 ??PCRPCRTaqDNA聚合酶（Thermus 60 Saiki,1988溫Saiki,1988 PCRPCR循19881988年第一臺PCR儀問世，PCR逐步實(shí)現(xiàn)自動 1993年，Mullis因此項(xiàng)技術(shù)榮 化學(xué)獎KaryB.KaryB.PCR儀的變?nèi)齻€水浴鍋，用手移PCR儀的變電加熱塊＋自來水冷 電加熱塊＋內(nèi)置循環(huán)液冷 三個加熱塊＋機(jī)械 半導(dǎo)體制冷和加熱（MJPEBioMetra空氣梯度PCRPCRLab-on-chip式的PCR儀(普通PCR儀、梯度PCR 全新4通道實(shí)時熒光定量PCR無細(xì)胞分子克隆法：以擬擴(kuò)增的NA分子為模板，以一對分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在NA聚合酶的作用下，按照半保留 的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。通過不斷重復(fù)這一過程，可以使目的 段得到擴(kuò)增。另一方面，合成的DN 段也可以作為模板，因而PCR技術(shù)可使NA的合成量呈指數(shù)型增長。過退火過退火變性變性延伸1st2nd3rd延伸1st2nd3rd 55 72

×30 PCRPCR靈敏度30輪循環(huán),擴(kuò)增量達(dá)230個拷貝（109拷貝將模板從皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水能從100萬個檢測的靈敏度可達(dá)3個細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)特異性引物序列與模板結(jié)合的特異快速簡加好反應(yīng)液，2～4小時即可完P(guān)CRPCR1）1）不對稱2多重LP-錨定PCR7位逆轉(zhuǎn)錄1.1.不對稱目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA用途：核酸序列測定的模板組DNA低濃度低濃度引 2PCR2PCRreverse 序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò) 文庫DNA；建 組步移文庫33PCR（復(fù)合在同一在同一PC反應(yīng)體系中，設(shè)計(jì)多對引物，同時擴(kuò)增一份DNA樣品中幾個不同靶區(qū)域的DN段，這一過程稱為多重PC?？捎糜跈z測特定序列的大小、缺失、突變是否存在。123443 電電泳DMDDMD條帶,說明外顯子8～19B：A中未擴(kuò)增外顯子多重PCR檢測DMD缺測目測目 4.LP-PCR（Labelled12341234標(biāo)記引觀 標(biāo)記引觀5.5.錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR的局限：需了解靶片段兩側(cè)的序?qū)τ谖粗蛄性趺崔k錨定PC首先合成第一鏈cDN,然后再添加一同聚物尾（與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn))一起作PC擴(kuò)增CC…CCCC…CC6.6.PCR可用 的制77原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Inls－PC）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測 來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序原位原位PCR既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（IH）,但在每個細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。R則可把這兩者結(jié)合起來,成為細(xì)胞學(xué) 中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi) 、細(xì)胞內(nèi) 重排以及分析細(xì)胞內(nèi)NA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在 方面也具有重要意義。細(xì)胞或組織固定細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片A.陽性對 B.對 C.原位檢測mRNA表8.8.逆轉(zhuǎn)錄

雜化雙ＤＮＡ聚合

99熒光定熒光定?或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR行標(biāo) ,實(shí) 反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng) 可熒光定量PCR?熒光定量PCR 熒光定量熒光定量PCRSYBRGreenSYBRGreenMolecularBeaconsDualAmplifluorSYBR-Green

SYBR-Green

分子信標(biāo)（MolecularBeacon熒光定量PCR與普通PCR的比實(shí)對樣品擴(kuò)增的整個過程進(jìn)行實(shí) ,能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)降低增加全 ,準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定結(jié)果分析更加快捷方便,普通PCR熒光定量PCRPCRPCR目 擴(kuò)增和鑒定；DNA序列測定；定點(diǎn)突變 表達(dá)分 其 PCR技術(shù)應(yīng)用于科學(xué)研分子克?。康牡墨@取和鑒定質(zhì)粒質(zhì)粒EcoREcoRBamHPCR(5’端引入限制酶識別位BamHEcoREcoRBamBamHPCRPCRK5通過抑制腫瘤血管新生抑制肝癌生長（RT-PCR技術(shù)獲得）0PBS0PBS0013182124293236grafedPBSgroupK5grouptumor

tumorYangX,etal.CancerBiology&Therapy,tumorGuX,YangX*,etal.Apoptosis.2011LiL,YangX*,etal.JBiolChem.2014.PCR技術(shù)應(yīng)用于科學(xué)研圍繞二硫鍵構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)的K5缺失突變體（PCR－缺失突變YangX,etal.JournalofCellularandMolecularMedicine,LiC,YangX,etal.Cornea.PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床檢臨內(nèi) AAPCR技術(shù)應(yīng)用于臨床檢 正常AA 病原微生物登登登登3：待測樣品 4：已5:待測樣品6:待測樣品37:陽性模前C區(qū)1896位點(diǎn)突變檢前C區(qū)1896位點(diǎn)突變檢測試劑分型檢測試劑在學(xué)分學(xué)分藥物治療方案的確隨藥物（療效評價恩替卡韋耐藥檢測試劑阿德福韋耐藥檢測試劑拉米夫定耐藥檢測試劑 試劑PCR-RFLP法：(PCR產(chǎn)物限制性酶切片斷多態(tài)性分RasRas限制性內(nèi)切突突限限制性內(nèi)切正 正突電泳電泳PCR技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒法醫(yī)學(xué)物證鑒方法：PCR-RFLP（限制片段長度多態(tài)性PCR-ASO