莪術(shù)、黃芪誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

【】目的：證實中藥莪術(shù)、黃芪對熱休克肝癌細(xì)胞細(xì)胞株N1S1的促凋亡作用，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。方法：1.N1S12.分別用不同濃度的莪術(shù)、黃芪處理細(xì)胞，用Annecxin-V和PI雙染流式細(xì)胞分析測定凋亡細(xì)胞數(shù)；3、用用western-blot方法檢測BCL-2和HSP70表達(dá)變化。結(jié)果：莪術(shù)、黃芪能明顯促進(jìn)熱休克處理N1S1細(xì)胞的凋亡，明顯減少細(xì)胞內(nèi)BCL-2及HSP70的表達(dá)。【】莪術(shù)黃芪熱休克模型N1S1細(xì)胞 凋HS70是分子量約7kD的熱休克蛋，是熱休蛋白中組重的一員，被、、、、7kDa等的0多種蛋白。分子量7KD的熱休克蛋白（）研究中最多一種。尤其是對S70的結(jié)構(gòu)、功以及表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究較多，正常情況下HS70HS70迅速增加，漿內(nèi)量存在細(xì)胞處于恢階時，核內(nèi)的HS70，漿仍有低水平HS70表達(dá)。目前，S70被認(rèn)為是哺乳動物細(xì)胞HSs的HSs，這與它所有的生物學(xué)性密切相關(guān)：生界的普遍性從核生物到真核生物都有HS70HS70%-%HS70氨基酸序列的N端2/3部分較C端1/3部分還要保守得多。正常情況下HS70S70的合成速度顯正常情況下HS70位于胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞激作用時，S70迅速移入細(xì)胞核并包圍核仁細(xì)胞漿內(nèi)存在；而應(yīng)激消后細(xì)胞處于復(fù)階段時，細(xì)胞核內(nèi)HS706S70成員在細(xì)胞的分布不，但均具有與核酸特別是與AP或ATP總蛋白量的%-1%。向外周逐漸衰減，至42-60℃的過度區(qū)內(nèi)，殘存的腫瘤細(xì)胞啟動凋亡，但隨著過渡區(qū)前預(yù)防RFA術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的重要課題。N1S1肝癌細(xì)胞的熱休克模型來觀察莪術(shù)黃芪超濾膜提取物的誘導(dǎo)肝臟腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)，進(jìn)一步檢測莪術(shù)黃芪誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中HSP70的變化，探討肝癌熱休克模主要試劑與儀器RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛（Gibco公司），5%CO2恒溫密閉式孵箱，流式細(xì)胞儀，電泳儀（HV3000型），紫外線透射反射分析儀（ZF3型），流式雙染試劑盒，．抗人HSP70的多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗IgG抗體均購自Abcam公司細(xì)胞株肝癌細(xì)胞株N1S1，常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2恒溫密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)和傳代。莪術(shù)黃芪超濾膜提取物的莪術(shù)，黃芪以1:1比例混合，按正交試驗結(jié)果，81h81h，4層紗布過濾濾液，再用脫脂棉過濾，兩次藥液混合，將濾液倒入平板超濾機(jī)，進(jìn)行膜分離處理（PNA中空纖維超濾膜，壓力5-6kg25℃，流量100ml/h）將超濾膜濾液取回后噴霧干燥，濃縮，制成每克生成藥相當(dāng)于0.159g的提取物干燥藥粉，封裝保存。肝癌熱休克模型將肝癌肝癌細(xì)胞株N1S1穩(wěn)定傳代，細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞貼45℃5%CO210min，直接實驗分組分為藥物干預(yù)組（0.2、0.4、0.81.6g/L組)和對照組以及空白對照組。其中藥物干預(yù)組每組8個復(fù)孔，在熱休克程序后，全濕條件下，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，48h，72h，96h，對照72小時，空白對照組為無干預(yù)同條件培養(yǎng)下穩(wěn)定傳流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡采用FITC-annexin-inV/PI雙染法,分別收集各組細(xì)胞10mL10000/ml,80005min后棄去培養(yǎng)1次,80005minPI標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞室溫下避光孵育15min,12000離心5min沉淀細(xì)胞,孵育緩沖液洗1次。加入AnnexinV-FITCPI5uL,420min400uLPBS用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。每個樣品檢測1萬個細(xì)胞,用cellquest軟件分析細(xì)胞凋亡情況。western-blot檢測細(xì)胞中HSP70的表達(dá)：Westernblot檢測HSP70蛋白表達(dá)：換用含藥物的RPMI164072h后，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS100“L含PMSF的裂解液，于冰上裂解．超聲(150．200W)3S，10次．離心，分裝倒0．5mL的離心管中．用BCA法將細(xì)胞的蛋白樣品定量，并100℃，5rain100mL／L40mL／L的濃縮膠，按每孔60ug蛋白上樣．電泳時電壓調(diào)至最大，電流強(qiáng)度濃縮膠30mA，分離膠40mA(恒流)．用100V電壓轉(zhuǎn)膜60．90min．轉(zhuǎn)膜完畢后用封閉液封閉1．5h．再用TBST液洗3次，每次10min．加入HSP70的一抗。4℃冰箱過夜．一抗?jié)舛龋壕鶠閘：500．用含50g／L脫脂牛奶的TBST稀釋．一抗孵育成功后用TBST液洗3次，每次10min．加入二抗室溫下孵育1h．二抗?jié)舛葹?：2000，用含50g／L脫脂牛奶的TBST稀釋．最后再用TBST液洗3次，每次10min．每張膜加l：l的發(fā)光液1mL，在暗室中5．7min，等條帶清晰后將膠片取出，掃描后用TanonGis3500軟件半莪術(shù)黃芪超濾膜提取物增加熱休克狀態(tài)肝癌細(xì)胞株H1S1(1～3)不同濃度莪術(shù)黃芪超濾膜提取物對人肝癌細(xì)胞株H1S1有誘導(dǎo)凋亡作用，這種作用呈時間劑量依賴性。24h以上各實驗組抑制率均高于對照組，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意莪術(shù)黃芪超濾膜提取物減少熱休克狀態(tài)肝癌細(xì)胞株H1S1熱休克蛋白70（HSP70） 不同濃度的莪術(shù)黃芪超濾膜提取物均能減少熱休克狀態(tài)肝癌細(xì)胞株H1S1熱休克蛋白70的表達(dá)，在72小時內(nèi)，莪術(shù)黃芪超濾膜提取物對HSP70的抑制作用呈時間劑量依賴性，其中1.6g/L組HSP70蛋白表達(dá)量最低，與各組有統(tǒng)計學(xué)差異，P小于0.03，96小時后0.8g/L組及1.6g/L組與72小時組無統(tǒng)計學(xué)差異，0.2g/L組及0.4g/L組在時間梯度上隨著藥物作用時間增加，HSP70表達(dá)量逐漸增加，但均低于72小時血藥經(jīng)典藥對黃芪一莪術(shù)，觀察其配伍使用對人肝癌細(xì)胞H1S1熱點。中藥與傳統(tǒng)化療藥物比較，有副作用小、毒性低、骨髓抑制輕、成本優(yōu)點。胞H1S1內(nèi)熱休克蛋白HSP70儀分析顯示，提取物與細(xì)胞作用24h即可誘導(dǎo)典型的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)；72h后，提取物濃度在1.6g/L時達(dá)到飽和，進(jìn)一步證實了莪術(shù)黃芪超濾膜提取物可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株H1S1凋亡?？傊ㄟ^流式細(xì)胞儀法觀察莪術(shù)黃芪超濾膜提取物增加熱休克人肝癌細(xì)胞株H1S1的凋亡率，通過蛋白電泳發(fā)現(xiàn)熱休克后的人肝癌H1S1細(xì)胞中HSP70H1S1中HSP70的通過抑制細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)，增加細(xì)胞對熱的敏感性，從而增加細(xì)胞的凋亡，本研對人肝癌細(xì)胞H1S1的凋亡通路需進(jìn)一步研究。[1],胡明月,,等.細(xì)胞凋亡與腫瘤[J].中華醫(yī)學(xué)實雜志20032(783-汪朝陽,,,等.中醫(yī)中藥對細(xì)胞凋亡的影響研究進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2000,20(9):712-714.LiuQH,LiuSY,QiH,etal.PreliminarystudyonthemechanismofapoptosisinEhrlichascitestumorcellsbysonochemicalactivatedhematoporphyrin[J].ActaZoolSinica,2005,51(6):1073-1079.TanC,DlugoszPJ,PengJ,etal.Auto-activationofapoptosisproteinBaxincreasesmitochondrialmembranepermeabilityandisinhibitedbyBcl-2[J].JBiolChem,2006,281(21):14764-14775.Liu