基因工程的質粒載體課件

第四章基因工程的質粒載體第四章基因工程的質粒載體1載體通論（一）基本概念載體：在基因工程中，用于承載、克隆、轉移目的基因(DNA片段)，能自我復制的DNA分子。（二）分類

克隆載體表達載體質粒載體噬菌體載體人工染色體按載體功能分按載體性質分載體通論（一）基本概念按載體功能分按載體性質分2在基因克隆時：將目的片段轉移到宿主細胞中進行復制克隆——克隆載體；在基因導入受體時：將目的片段轉移到受體細胞中并進行使之表達——轉化載體或表達載體。常用基因工程載體有：細菌質粒(克隆)；λ噬菌體(克隆)；柯斯質粒(克隆)；穿梭質粒(克隆/表達)；細菌人工染色體(克隆/表達)；酵母人工染色體(克隆/表達)；Ti質粒及其衍生載體(轉化)。常用基因工程載體有：3表達體載體宿主第一代原核生物表達體系質粒、噬菌體細菌第二代酵母表達體系穿梭質粒酵母第三代哺乳類細胞表達體系病毒、脂質體培養(yǎng)動物細胞第四代基因直接導入DNA本身生殖細胞、體細胞、個體表達體載體宿主第一代原核生物表達體系質粒、噬菌體細菌第二代4（三）基因工程載體必須具備的條件：

※（1）有復制起點

※（2）具有若干個限制性內(nèi)切酶的單一識別位點

※（3）具備合適的篩選標記

※（4）具備合適的拷貝數(shù)目（5）分子量要相對較小（6）在細胞內(nèi)穩(wěn)定性要高（7）易分離純化※表示載體必須具備的條件（三）基因工程載體必須具備的條件：5（四）基因工程中常用的載體

基因工程中常用的載體有5類：

質粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體M13

噬菌體的衍生物柯斯質粒（cosmid）

動物病毒（virus）

（四）基因工程中常用的載體基因工程中常用的載體有56質粒*受體細胞結構插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒載體的種類和特征質粒*受體細胞結構插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pU7第一節(jié)

質粒載體

一、質粒（plasmid）是獨立于染色體以外的能自主復制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。第一節(jié)質粒載體一、質粒（plasmid）8大腸桿菌的質粒大腸桿菌的質粒9在大腸桿菌的各種菌體中找到了許多種不同類型的質粒，其中已經(jīng)作了比較詳盡研究的主要有F質粒、R質粒和Col質粒。

①F質粒又叫F因子或性質粒（sexplasmid）。它們能夠使寄主染色體上的基因和F質粒一道轉移到原先不存在該質粒的受體細胞中去。

②R質粒通稱抗藥性因子。它們編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且通常能夠將此種抗性轉移到缺乏該質粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。

③Col質粒即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌是一類可以使不帶有Col質粒的親緣關系密切的細菌菌株致死的蛋白質。在大腸桿菌的各種菌體中找到了許多種不同類型的質粒，其中已經(jīng)作10（1）分子小：1.質粒的一般生物學特性1—200kb（2）編碼基因少：2—3個中等大小的蛋白質。（3）環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀DNA。（酵母的“殺傷質?！笔荝NA）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細菌一些額外的特性（非必須）。（1）分子小：1.質粒的一般生物學特性1—200kb（111．當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結構時，稱之為共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA），這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構型；

2．如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結構，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口時，稱之為開環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構型；

3．若質粒DNA經(jīng)過適當?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后，發(fā)生雙鏈斷裂形成線性分子（IDNA），通稱L構型（4）質粒的空間構型：1．當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結構時，稱之為共價閉12（5）質粒空間構型與電泳速率在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構型的同一種質粒DNA，盡管分子量相同，仍具有不同的電泳遷移就緒。其中走在最前沿的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNASCOCL（5）質?？臻g構型與電泳速率在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構型的同13（1）質粒的類型：在大腸桿菌中的質粒，可以分為：接合型質粒:非接合型質粒能自我轉移不能自我轉移2質粒DNA的轉移（1）質粒的類型：在大腸桿菌中的質粒，可以分為：接合型質粒14按接合轉移功能分類主要基因按抗性記號分類非接合型質粒自主復制基因，產(chǎn)生大腸桿菌素基因Col質粒自主復制基因，抗菌素抗性基因R質粒(R因子)接合型質粒自主復制基因，轉移基因，細菌染色體區(qū)段F質粒（F因子）自主復制基因，轉移基因，大腸桿菌素基因Col質粒自主復制基因，轉移基因，抗菌素抗性基因R質粒(R因子)自主復制基因，轉移基因，大腸桿菌素基因Ent質粒按接合轉移功能分類主要基因按抗性記號分類非接合型質粒自主復制15除了帶有自我復制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌配對和質粒接合轉移的基因。如：F質粒（性質粒、或F因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉移到原先不存在該質粒的受體菌中。又叫自我轉移型質粒。（1.1）接合型質粒不符合基因工程的安全要求。除了帶有自我復制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌配對和質16（2）F質粒(Fplasmid)又稱F因子、致育因子或性因子，是大腸桿菌等細菌決定性別并有轉移能力的質粒。分子量約為大小94kb，共編碼19個轉移基因。F質粒在寄主細胞中有三種存在形式：以染色體外環(huán)形雙鏈質粒DNA形式存在，不帶來自寄主染色體的基因或DNA區(qū)段。以染色體外環(huán)形雙鏈質粒DNA形式存在，攜帶著細菌的染色體基因或DNA區(qū)段。以線性DNA形式從不同位點整合到寄主染色體上。（2）F質粒(Fplasmid)17F質粒結構：tra區(qū)（轉移區(qū)，與質粒轉移和性菌毛合成有關）oriT（轉移起始點）oriS復制起始點）inc（不相容群）rep（復制功能）轉座因子F質粒結構：18根據(jù)F質粒在細胞中的存在方式，可把大腸桿菌分成四種不同接合型菌株。（1）F+菌株F+菌株即“雄性”菌株，指細胞內(nèi)存在一至幾個F質粒，并在細胞表面著生一至幾條性菌毛的菌株。（2）F-菌株F-菌株即“雌性”菌株，指細胞中無F質粒、細胞表面也無性菌毛的菌株。根據(jù)F質粒在細胞中的存在方式，可把大腸桿菌分成四種不同接合型19（3）Hfr菌株（高頻重組菌株）在Hfr菌株（高頻重組菌株）細胞中，因質粒由游離態(tài)轉為在核染色體組特定位點上的整合態(tài)，故Hfr菌株與F-菌株相接合后，發(fā)生基因重組的頻率比單純用F+與F-接合后的頻率高出數(shù)百倍。（4）F’菌株當Hfr菌株細胞內(nèi)的F質粒因不正常切離而脫離核染色體組時，可重新形成游離的、但攜帶整合位點鄰近一小段核染色體基因的特殊F質粒，稱F’質粒或F’因子。（3）Hfr菌株（高頻重組菌株）20在合適的條件下，將雄性細胞和雌性細胞混合培養(yǎng)，由于性須的作用，就會形成雌-雄細胞配對，這種過程稱為細菌的接合作用（conjunction）。F因子DNA拷貝，需1分鐘時間從雄性細胞轉移到雌性細胞在合適的條件下，將雄性細胞和雌性細胞混合培養(yǎng)，由于性須的作用21（3）質粒DNA的接合轉移

①細胞交配對的形成雄性細胞的性須頂端與受體細胞表面接觸之后，便會迅速收縮，把給體細胞與受體細胞拉在一起。因此，性須在確立配對細胞表面間的緊密接觸方面，起著至關重要的作用。

大腸桿菌雄性細胞是不會同其它的亦帶有F質粒的細胞發(fā)生配對作用的，因為traS和traT編碼的“表面排斥”蛋白質，使此種細胞無法成為接合作用的受體。這就決定了雄性細胞只能同不具F因子的雌性細胞配對的特異性。

②質粒DNA的轉移F質粒DNA的轉移是從轉移起點oriT開始的。當細胞交配對建立之后，TraY和TraI蛋白質首先在oriT位點作單鏈切割，隨后缺口鏈在其游離的5′-端的引導下轉移到受體細胞，并作為模板合成互補鏈，形成新的質粒分子。于是受體細胞便轉變成為具有F因子的雄性細胞。（3）質粒DNA的接合轉移

①細胞交配對的形成22基因工程的質粒載體課件232.非接合型質粒：雖然帶有自我復制所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質粒接合轉移的基因，因此不能從一個細胞轉移到另一個細胞。（1）R質粒（抗性質粒）：帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。2.非接合型質粒：雖然帶有自我復制所必需的遺傳信息，但失去24基因工程的質粒載體課件25帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col質粒：大腸桿菌素對不帶Col質粒的大腸桿菌有毒。Col質?；騌質粒如果帶有轉移基因，也可以成為接合型質粒。帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col26

非接合型的質粒，由于分子小，不足以編碼全部轉移體系所需要的基因，因而不能夠自我轉移。但如果在其寄主細胞中存在著一種接合型的質粒，那么它們通常也是可以被轉移的。這種由共存的接合型質粒引發(fā)的非接合型質粒的轉移過程，叫做質粒的遷移作用（mobilization）。

ColE1是一種可以遷移但是屬于非接合型的質粒。需要質粒自己編碼的兩種基因參與。一個是位于ColE1DNA上的特異位點bom；另一個是ColE1質粒特有的彌散的基因產(chǎn)物，即mob基因（mobilizationgene）編碼的核酸酶。3質粒DNA的遷移作用非接合型的質粒，由于分子小，不足以編碼全部轉移體系所需要27基因工程的質粒載體課件28相容性的兩種質粒F和ColE1共存于同一細菌細胞中，F(xiàn)質?？梢詾镃olE1質粒提供其所缺乏的結合功能，這樣使得ColE1質粒也能夠發(fā)生轉移作用。（a）表示位于F-細胞中的ColE1質粒的狀，它的mob基因進行了轉錄，其產(chǎn)物使bom位點發(fā)生單鏈斷裂而出現(xiàn)缺口，于是ColE1DNA便從超盤旋的的結構轉變成為缺口環(huán)狀的構型。但ColE1質粒缺乏形成性須的能力，無力進行結合配對，所以它的DNA也就不能從一個細胞轉移到另一個細胞。正是由于不能夠發(fā)生轉移，這種從超盤旋到缺口環(huán)狀的構型轉變過程，就有可能被回復，所以就出現(xiàn)這兩種構型之間的平衡狀態(tài)。（b）中的細胞同時含有F和ColE1兩種質粒。F因子能夠導致性須的合成，為其DNA轉移提供了轉移裝置，因此ColE1可以被轉移。而在F質粒提供的這種轉移裝置被分離掉的情況下，ColE1的mob-突變體便不能夠轉移。遺傳分析證明，mob-突變是隱性的，mob基因編碼一種蛋白質。而且當這種突變體質粒被分離出來時，并不是以松弛復合物的形式存在。（c）所示，F(xiàn)質粒無力幫助mob-突變體進行轉移，其中F性須和轉移裝置雖已形成，但ColE1DNA并沒有發(fā)生缺口。（d）表示另一種具mob+表型并帶有一個順式顯性突變的ColE1突變體，它缺失了bom位點。在這樣的寄主細胞中，雖然能夠合成mob蛋白質，但由于不能發(fā)生缺口，因此仍然不能夠轉移。相容性的兩種質粒F和ColE1共存于同一細菌細胞中，F(xiàn)質?？?94質粒DNA的復制類型1.低拷貝數(shù)的質粒拷貝數(shù)少，只有1—3份拷貝，也稱為“嚴緊型”復制控制的質粒（stringentplasmid）2.高拷貝的質?？截悢?shù)多，有10—60份拷貝，也稱為“松弛型”復制控制的質粒（relaxedplasmid）（非接合型質粒分子量小，一般屬松弛型）。根據(jù)寄主細胞所含的拷貝數(shù)的多少，將質粒分為低拷貝數(shù)的質粒和高拷貝數(shù)的質粒4質粒DNA的復制類型1.低拷貝數(shù)的質粒拷貝數(shù)少，只有1—30質?？截悢?shù)：每條細菌染色體所平均具有的質粒DNA分子數(shù)目。質粒的結合轉移能力，同它們的分子大小及復制類型間存在一定的相關性。接合型質粒，分子量大，一般屬嚴緊型非接合型質粒分子量小，一般屬松弛型質粒拷貝數(shù)：每條細菌染色體所平均具有的質粒DNA分子數(shù)目。31基因工程的質粒載體課件32（1）質粒的不親和性現(xiàn)象

所謂質粒的不親和性（plasmidincompatibility），有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質粒稱為不親和質粒

不親和群（incompatibilitygroup），指具有親緣關系，但彼此之間是互不相容的質粒。

5質粒的不親和性（1）質粒的不親和性現(xiàn)象

5質粒的不親和性33（2）質粒不親和性的分子基礎

質粒不親和性的分子基礎，主要是由于它們在復制功能之間的相互干擾造成的。

大多數(shù)質粒都會產(chǎn)生出一種控制質粒復制的阻遏蛋白質，其濃度是與質粒的拷貝數(shù)成正比的。阻遏蛋白質通過同其靶序列間的相互作用，使雙鏈DNA中的一條鏈斷裂，從而導致質粒DNA復制的啟動，并建立起一種調(diào)節(jié)質?？截悢?shù)的負反饋環(huán)（negativefeedbackloop）。當質粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白質時，其復制活動便被抑制；而當質粒處于低拷貝和低濃度遏蛋白質的條件下，它的復制反應便會繼續(xù)進行。

由于每一種質粒的復制速率和拷貝數(shù)控制，都是由一對不相容質粒產(chǎn)生的阻遏蛋白質總濃度聯(lián)合調(diào)控的，這種交叉抑制的結果，使細胞中質?？截悢?shù)，比其單獨感染狀態(tài)下的正常拷貝數(shù)減少許多。（2）質粒不親和性的分子基礎

質粒不親和性的分子基礎，主34同一細胞中含有兩種不相容的質粒，其產(chǎn)生的阻遏蛋白質不僅調(diào)節(jié)自身的復制，也會調(diào)節(jié)另一種與之共存的不相容質粒的復制同一細胞中含有兩種不相容的質粒，其產(chǎn)生的阻遏蛋白質不僅調(diào)節(jié)自35一．質粒DNA復制的多樣性不同質粒DNA的復制在如下幾個方面存多樣性：（i）對寄生酶的依賴性

有的完全利用寄主細胞所提供的核酸酶，有的自身也編碼若干核酸酶，參加DNA復制（ii）DNA聚合酶的利用

多數(shù)利用polIII,有的質粒利用polI（iii）復制的方向性

有純單向的，純雙向的，有既有單向又又雙向的（iv）復制的終止

單向復制，在起點處終止復制雙向復制，在復制叉到達同一位點時終止，或有一固定的終止位點（v）復制型

蝶狀復制第二節(jié)質粒DNA的復制與拷貝數(shù)的控制一．質粒DNA復制的多樣性第二節(jié)質粒DNA的復制與拷貝數(shù)的36ColE1質粒DNA的復制，是從一個特定的復制起點（ori）開始，并沿著環(huán)DNA分子單向性地進行?？刂拼朔N質粒DNA復制啟動的兩種關鍵因素RNAI和RNAⅡ兩種RNA分子，都是由ColE1DNA轉錄產(chǎn)生的。RNAⅡ也叫做復制引物。RNAⅡ分子在轉錄起點附近同互補的模板DNA形成一種雜交分子，被RnaseH酶所切割，從而釋放出3′-OH末端，作為供DNA聚合酶Ⅰ合成DNA的引物。RNAⅠ可以通過同RNAⅡ結合，以阻止其與模板DNA發(fā)生雜交作用。

從本質上講，ColE1質粒的復制啟動顯然是受一種負反饋機理控制的。根據(jù)這種模型，細胞中RNAⅠ分子的濃度是隨著質粒拷貝數(shù)的多寡而增減的。例如，若細胞中質?？截悢?shù)下降到正常數(shù)值以下的水平，RNAⅠ的濃度也就相應降低，于是質粒的復制也就受到較少的抑制，結果導致其拷貝數(shù)的上升。二．ColE1質粒DNA復制的啟動ColE1質粒DNA的復制，是從一個特定的復制起點（ori）37三．質粒復制控制的分子模型質粒DNA復制控制機理的分子模型有兩種：自體阻遏蛋白質模型（autorepressormodel）：阻遏蛋白質的合成受負反饋（negativefeedback）機理調(diào)節(jié)，而且其濃度是恒定的。抑制蛋白質稀釋模型（inhibitordilutionmodel）：阻遏蛋白質是組成型合成，其濃度同質粒的拷貝數(shù)成正比。三．質粒復制控制的分子模型質粒DNA復制控制機理的分子模型有38（1）抑制蛋白質稀釋模型質粒DNA編碼的抑制蛋白質同質粒DNA的復制起點（oir）結合阻斷起始蛋白質Rep的合成細胞中Cop蛋白質的濃度是同質粒分子的拷貝數(shù)成正比，它抑制質粒DNA復制活性的作用方式有兩種途徑（1）抑制蛋白質稀釋模型質粒DNA編碼的抑制蛋白質同質粒DN391.質粒DNA的復制是由一種叫做起始蛋白質Rep引發(fā)的Rep蛋白質編碼基因rep和自體阻遏蛋白質編碼基因atr是屬于同一個操縱子，它們共轉錄成同一個mRNA分子。自體阻遏蛋白質通過同啟動子-操縱基因區(qū)（P/O）的結合作用，調(diào)節(jié)質粒DNA的轉錄作用，以維持細胞中Atr和Rep蛋白質處于恒定的水平。由Atr蛋白質調(diào)節(jié)產(chǎn)生的Rep蛋白質，則是通過同復制起點（ori）的結合，來引發(fā)質粒DNA的復制2.Rep蛋白質是一種具有雙重功能的蛋白質既具有自體阻遏蛋白質的功能，可同P/O區(qū)結合而抑制轉錄作用又具有起始蛋白質的功能，能對復制起點（ori）發(fā)生作用，引發(fā)質粒DNA進行復制（2）自體阻遏蛋白質模型1.質粒DNA的復制是由一種叫做起始蛋白質Rep引發(fā)的（2）40基因工程的質粒載體課件41第三節(jié)質粒DNA的分離與純化應用質粒作為基因克隆的載體分子，一個重要的條件是要獲得批量的純化的質粒DNA分子。通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來促使大腸桿菌細胞裂解的，絕大部分的染色體DNA分子都將以高分子量的形式釋放出來，這樣便可以應用高速離心的方法使之與細胞碎片一起被沉淀除去，得到了比較清亮的裂解液。第三節(jié)質粒DNA的分離與純化應用質粒作為基因克隆的載體分42一．氯化銫密度梯度離心法

在細胞裂解及DNA分離的過程上，大分子量的細菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應的線性片段，而質粒DNA則由于其分子量較小、結構緊密，因此仍能保持完整的狀態(tài)。

氯化銫-EtBr密度梯度離心法，就是根據(jù)這一差別建立的純化質粒DNA的經(jīng)典技術。當將含有溴化乙錠（EtBr）的氯化銫（CsCl）溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中時，EtBr扁平分子便會通過在堿基對之間的嵌入作用而結合成DNA分子鏈上，并因此導致雙螺旋結構發(fā)生解旋反應。線性的或開環(huán)的DNA分子，例如大腸桿菌染色體DNA片段，可結合相當大量的EtBr分子。而像質粒這樣的共價閉合環(huán)狀的DNA（cccDNA）分子，EtBr分子的結合數(shù)量相對較少。在DNA-EtBr復合物中，結合的EtBr分子數(shù)量越多，其密度也就越低。通過氯化銫密度梯度離心之后，根據(jù)它們的不同密度，就會平衡在不同的位置，從而達到純化質粒DNA的目的。一．氯化銫密度梯度離心法43線性的或開環(huán)的DNA分子，可結合相當大量的EtBr分子，密度低共價閉合環(huán)狀的質粒DNA（cccDNA）分子，EtBr分子的結合數(shù)量相對較少，密度高通過氯化銫密度梯度離心，根據(jù)它們的不同密度，就會平衡在不同的位置，從而達到純化質粒DNA的目的。線性的或開環(huán)的DNA分子，可結合相當大量的EtBr分子，密度44基因工程的質粒載體課件45

根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNA與線性染色體DNA片段之間，在拓撲學上的差異而發(fā)展出來的。

通過加熱，在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，連接DNA互補鏈之間的氫鍵會被斷裂，但由于cccDNA的雙螺旋主鏈骨架的彼此盤繞作用，互補的兩條鏈仍然會緊密地結合在一起。通過致冷或恢復中性pH值更會迅速地復性，復性迅速而準確。

線性的染色體DNA分子，在此過程中彼此已經(jīng)分離開來的互補鏈之間的復性作用就不會那么迅速而準確。它們聚集形成的網(wǎng)狀結構，通過離心分離便會與變性的蛋白質及RNA一道沉淀下來。仍然滯留在上清液中的質粒cccDNA則可用酒精沉淀法收集。二．堿變性法根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNA與線性染色體DNA片段之間，在46

微量堿變性法具有簡單快速、經(jīng)濟實惠的優(yōu)點，是當前分子生物學及基因工程研究工作中最常用的一種分離純化質粒DNA的方法

第一步，取1.5毫升含有質粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物加在微量離心管中，離心收集細胞沉淀，并用100微升冰冷的溶液I[50mM葡萄糖，25MmTris-HCl（Ph8.0），10MmEDTA，4～5mg溶菌酶/mL]重新懸浮。將反應混合物在室溫下靜置5分鐘，讓溶菌酶充分發(fā)揮效力，促使大腸桿菌細胞變得脆弱而易于裂解。溶菌酶對反應液的pH值有很大的依賴關系，TrisHCl緩沖體系和適量的葡萄糖而有利于pH的調(diào)節(jié)。乙二胺四乙酸（EDTA），可抑制酸酶的活性，從而保護質粒DNA免被降解。

第二步，加入200微升冰冷的溶液Ⅱ[0.2NNaOH,1.0%SDS]，緩緩混勻后，置室溫下5分鐘。SDS的作用在于使細胞裂解，以釋放質粒及染色體的DNA。在高pH值（12.0～12.5）的反應體系中，則會使線性缺口的質粒DNA以及線性的染色體DNA片段被選擇性地變性，而共價閉合環(huán)狀的質粒DNA則不會受影響。三．微量堿變性法微量堿變性法具有簡單快速、經(jīng)濟實惠的優(yōu)點，是當前分子生物47第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸鈉，緩緩震蕩10秒鐘后，放置在冰浴中5分鐘。PH4.8的醋酸鈉溶液降低了反應混合物中的pH值，起到中和作用，從而使線性的質粒及染色體DNA復性，并聚集成不可溶的網(wǎng)絡狀聚合物。同時高濃度的醋酸鈉亦會引起蛋白質-SDS復合物和高分子量的RNA分子發(fā)生沉淀。通過離心處理，便可把網(wǎng)絡狀的DNA聚合物同變性的蛋白質-DNA及RNA等以復合物形式沉淀出來，從而使質粒DNA得到純化。第四步，將上述離心所得的主要是含有質粒cccDNA上的清液，用苯酚抽提數(shù)次除去蛋白質污染物，最后按酒精沉淀法收集質粒DNA。

按照這種方法制備的質粒DNA，其純度完全可以滿足常規(guī)的基因克隆實驗要求。如有必要亦可用凝膠過濾法作進一步的純化。第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸鈉，緩緩震蕩48（1）寄主菌株的遺傳背景

大腸桿菌寄主菌株的正確選擇，是獲得高產(chǎn)量質粒DNA的重要條件之下。建議使用endA基因發(fā)生突變的（endA1）大腸桿菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突變的結果，使大腸桿菌寄主細胞失去了合成具有功能活性的核酸內(nèi)切酶I的能力，從而增進了所含有的質粒DNA分子的穩(wěn)定性。所以從這類寄主細胞中制備的質粒DNA不僅在質量上有所改進，同時在產(chǎn)量上也得到了提高。四．影響質粒DNA產(chǎn)量的因素（1）寄主菌株的遺傳背景

大腸桿菌寄主菌株的正確選擇，是49（2）質粒的拷貝數(shù)及分子大小

細菌培養(yǎng)物中質粒DNA之理論產(chǎn)量，可以根據(jù)公布的質粒的拷貝數(shù)和分子量大?。╞p）及每毫升培養(yǎng)物中的大腸桿菌細胞總數(shù)三者相乘得出。質粒分子拷貝數(shù)的多寡和質粒分子大小是決定其DNA產(chǎn)量的重要因素之一。（2）質粒的拷貝數(shù)及分子大小

細菌培養(yǎng)物中質粒DNA之理50（1）分子量大，拷貝數(shù)低第四節(jié)質粒載體的構建1.天然質粒的局限性第一個用于基因克隆的天然質粒pSC101，分子長

9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當克隆位點，Tetr作為篩選標志。天然質粒,是指那些沒有經(jīng)過以基因克隆為目標的體外修飾改造的質粒。在大腸桿菌中，常見的要用于基因克隆的天然質粒有ColE1RSF2124和pSC101等。（1）分子量大，拷貝數(shù)低第四節(jié)質粒載體的構建1.天然質粒51基因工程的質粒載體課件52基因工程的質粒載體課件53ColE1質粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。（2）篩選標志不理想可以通過插入失活篩選。但細菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細胞…….colicinE1能殺死不含ColE1質粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內(nèi)部。ColE1質粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE54ColE1ColE155（1）

具有復制起點（ORI）2.質粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點：是篩選的標志。理想的載體應該有兩種抗菌素抗性基因。用來插入外源DNA片斷。且插入后不影響復制功能。（1）具有復制起點（ORI）2.質粒載體必須具備的基本條56（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。57氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性

（Kanr）四環(huán)素抗性

（Tetr）鏈霉素抗性

（Strr）氯霉素抗性

（Cmlr）3.質粒的選擇標記及其工作原理：（1）選擇標記①抗菌素抗性絕大多數(shù)質粒載體都是用抗菌素抗性標記：在基因克隆中采用的質粒載體的選擇記號，包括有新陳代謝特性、對大腸桿菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多種。氨芐青霉素抗性（Ampr）3.質粒的選擇標記及其工作原理58

常用抗菌素的抗性工作原理i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通過干擾細菌細胞壁合成的末端反應，殺死生長的細菌。a）抑菌原理b）細菌抗性原理Ampr基因編碼-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)。常用抗菌素的抗性工作原理i）氨芐青霉素（Ampicilli59ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通過與50S核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細菌。b）細菌抗性原理Cmlr

編碼乙酰轉移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ睢）抑菌原理ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通過與60a）殺菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通過與70S核糖體結合，導致mRNA發(fā)生錯讀。殺死細菌。b）細菌抗性原理Kanr

編碼的氨基糖苷磷酸轉移酶，對卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結合作用。a）殺菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通61iv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理通過與30S核糖體亞基結合，導致mRNA錯譯。殺死細菌。b）細菌抗性原理Strr

編碼一種氨基糖苷磷酸轉移酶對鏈霉素進行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結合作用。iv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理62v）四環(huán)素（Tetracycline，Tet）b）細菌抗性原理a）抑菌原理通過于30S核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細菌。Tetr編碼特異性蛋白質，對細菌的膜結構進行修飾，組止四環(huán)素通過細胞膜進入細菌細胞內(nèi)。v）四環(huán)素（Tetracycline，Tet）b）細菌抗性原63基因工程的質粒載體課件64基因工程的質粒載體課件65②

遺傳標記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。②遺傳標記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。66基因工程的質粒載體課件67當帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌才能生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。（2）抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素當帶有抗菌素抗性基因的載體進入受體菌后，受體菌才能生長。不帶684.人工構建的質粒載體的類型（1）高拷貝數(shù)的質粒載體ColE1、pMB1派生質粒具有高拷貝數(shù)的特點。而且在沒有菌體蛋白質合成的條件下（蛋白質合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復制，達到每個細胞的拷貝數(shù)1000—3000個！適合大量增殖克隆基因、或需要表達大量的基因產(chǎn)物。4.人工構建的質粒載體的類型（1）高拷貝數(shù)的質粒載體Col69（2）低拷貝數(shù)的質粒載體

但有特殊用途:由pSC101派生來的載體特點是分子量小，拷貝數(shù)低。當有些被克隆的基因的表達產(chǎn)物過多時會嚴重地影響寄主菌的正常代謝活動，導致寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等不適合大量擴增DNA用。適合于克隆含量過高對寄主代謝有害的DNA。（2）低拷貝數(shù)的質粒載體但有特殊用途:由pSC101派生來70（3）失控的質粒載體（runawayplasmidvectors）這是一類溫度敏感型復制控制質粒。溫度低（低于37oC），拷貝數(shù)很少；溫度增加（>40oC）時，拷貝數(shù)會很快增加到1000個以上。1979年B.E.Uhlin等構建。如pBEU1、pBEU2。在這種高溫環(huán)境下，細胞的生長蛋白質的合成可按正常的速率持續(xù)2～3小時。這期間編碼在質粒載體上的基因產(chǎn)物便超過了常量。最后，細胞生長受到了抑制，并失去了存活的能力，但在這個階段質粒DNA可累積到占細胞總DNA的50%。（3）失控的質粒載體（runawayplasmidvec71（4）

插入失活型質粒載體載體的克隆位點位于其某一個選擇性標記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐酝庠碊NA無抗菌素抗性選用插入失活型質粒，將外源DNA片段插入在會導致選擇記號基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位點，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度地提高獲得陽性克隆的幾率。（4）插入失活型質粒載體載體的克隆位點位于其某一個選擇性標72（5）正選擇的質粒載體(Directselectionvectors)如pUR2、pTR262等。只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。具有直接選擇記號并賦予寄主細胞相應的表型。通過選擇具這種表型特征的轉化子，便可大大降低需要篩選的轉化子的數(shù)量，從而減輕了實驗的工作量，提高了選擇的敏感性。目前通用的絕大部分質粒載體都是正選擇載體。（5）正選擇的質粒載體(Directselectionv73（6）

表達型質粒載體主要用來使外源基因表達出蛋白質產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉錄—翻譯信號控制之下。注意啟動子的性質，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。使克隆在大腸桿菌中特定位點的外源真核基因的編碼序列置于大腸桿菌的轉錄-轉譯信號控制之下，并能在大腸桿菌細胞中正常轉錄并轉譯成相應蛋白質的克隆載體特稱為表達載體（expressionvectors）。它分為表達型質粒載體和表達型噬菌體載體兩種不同的類型。（6）表達型質粒載體主要用來使外源基因表達出蛋白質產(chǎn)物。如74復制起始點ORI、選擇標記、多克隆位點MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I操縱基因O啟動基因P核糖體結合位點序列（SD）轉錄終止信號區(qū)。1）普通載體元件①表達載體的結構復制起始點ORI、2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I1）75基因工程的質粒載體課件76五、重要的大腸桿菌質粒載體

1.pSC101第一個成功地用于克隆實驗的大腸桿菌質粒載體。（1）類型天然質粒，屬低拷貝型。（2）長度9.09kb。（3）選擇標記四環(huán)素抗性Tetr五、重要的大腸桿菌質粒載體1.pSC101第一個成功地776個克隆位點：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3個位于選擇標記Tetr的內(nèi)部）（4）克隆位點6個克隆位點：（其中HindIII、BamHI、Sal78基因工程的質粒載體課件792.ColE1（1）類型天然質粒，屬高拷貝型。（2）長度6.3kb。（3）選擇標記大腸桿菌素（colicin）E1和對E1免疫的基因（immE1）特點是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細菌蛋白質合成后，質粒仍然能復制達到每個細胞1000-3000拷貝之多！2.ColE1（1）類型天然質粒，屬高拷貝型。（2）長度80①colicinE1基因的結構ceaimmkil結構基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細菌的原因cea+kil基因產(chǎn)物③

不被其他細菌的colicinE1所殺死的原因imm基因①colicinE1基因的結構ceaimmkil結構基因81EcoRI位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會導致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位點ColicinE1外源DNA無ColicinEcoRI位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會導致E1失活，使受82用對外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作選擇，操作非常繁雜。對colicinE1敏感的細菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗colicinE1的頻率很高?。?）ColE1的選擇缺陷ColE1抗colicinE1殺ColE1-仍抗colicinE1不殺ColE1-插入片斷ColE1用對外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colic83基因工程的質粒載體課件84目前在基因克隆中廣泛使用的一種大腸桿菌質粒載體。（1）pBR322質粒載體的構建縮小基因組的體積移去一些對基因克隆載體無關緊要的DNA片段，限制酶識別位點，使質粒同存在任何易位子統(tǒng)統(tǒng)失去功能。易位子的轉移（即易位）有可能導致選擇記號的喪失，甚至也有可能使克隆的DNA片段喪失或重排。構建pBR322質粒的還必須通過體內(nèi)易位或體外重組加入可選擇的抗藥性記號。3.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構建載體。目前在基因克隆中廣泛使用的一種大腸桿菌質粒載體。3.pBR85Ampr來源Tn3易位8.3kb13.3kb2.6kbEcoRI*活性消化tetr來源5.3kbTn3易位10.2kbTn3易位8.8kbEcoRI*活性消化4.3kb構建關鍵：體內(nèi)易位或體外重組加入可選擇的抗藥性標記；除去非必要的區(qū)段降低分子量。帶控制大腸桿菌素E1合成的基因和Ampr基因帶五個抗藥性基因和帶Ampr基因的易位子Tn3pMB8:帶控制大腸桿菌素E1免疫性基因和EcoRI單一識別位點pMB9:帶ColE1質粒復制特性，含對大腸桿菌素E1免疫性基因，EcoRI單一識別位點和四環(huán)素抗性基因pBR312：具雙重抗性pBR313：Tn3易位子上的BamHI位點消失，不再易位Ampr來源Tn3易位8.3kb13.3kb2.6kbEco86pBR322質粒是由三個不同來源的部分組成的：來源于R7268質粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；來源于pSC101質粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點（ori）.pBR322質粒是由三個不同來源的部分組成的：87pSP2124質粒的Ampr基因pBR322元件來源①復制起點

oripMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復制起點②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。pSP2124質粒的Ampr基因pBR322元件來源①復制88（2）長度4363bp（3）選擇標記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點其中9個會導致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個會導致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個克隆位點。（2）長度4363bp（3）選擇標記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。89基因工程的質粒載體課件90（5）pBR322的優(yōu)點①雙抗菌素抗性選擇標記

插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。（5）pBR322的優(yōu)點①雙抗菌素抗性選擇標記插入失活，91外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因92氯霉素擴增之后，每個細胞可達1000~3000copy④安全失去了轉移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉移。③

高拷貝數(shù)②分子小，克隆能力大載體越小越好。>10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。氯霉素擴增之后，每個細胞可達1000~3000copy④安93Mob基因已經(jīng)缺失，但保留了轉移蛋白（mob）的作用位點。（6）pBR322的缺點能夠被ColK質粒編碼的mob蛋白識別，如果再有F質粒的參與，就有可能轉移！從生物安全的角度出發(fā)，不希望載體具易位能力及接合轉移的功能Mob基因已經(jīng)缺失，但保留了轉移蛋白（mob）的作用位點。（94①刪除mob識別位點（如質粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識別位點，又增加質粒的拷貝數(shù)。（7）PBR322的改進①刪除mob識別位點（如質粒pBR327、pAT153等）95pBR325：在pBR322位點上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也帶一個EcoRI位點。使EcoRI也成為插入失活型位點。②

改造EcoRI位點pBR325：在pBR322位點上接入一段來自噬菌體PICm964.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19pUC載體是在pBR322質粒載體的基礎上，組入了一個在其5′-端帶有一段多克隆位點的lacZ′基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。4.pUC系列UniversityofCaliforn97orilacZ’Ampr多克隆位點orilacZ’Ampr多克隆位點98①

復制起點pBR322質粒的復制起點ori但其上失去了克隆位點。②

Ampr基因（1）元件來源③lacZ的啟動子及l(fā)acZ’基因大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結構特稱為lacZ′基因④多克隆位點（MCS）區(qū)段pBR322的氨芐青霉素抗性基因位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段，它不破壞該基因的功能①復制起點pBR322質粒的復制起點ori但其上失去了克99（2）長度約2.7kb（3）克隆位點10個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于lacZ’基因的5’端。（2）長度約2.7kb（3）克隆位點10個連續(xù)的單一限制酶切100第一，具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)

如pUC8為2750bP，pUC18為2686bP。pUC8質粒平均每個細胞即可達500～700個拷貝。

第二，適用于組織化學方法檢測重組體

在應用pUC8質粒為載體的重組實驗中，可用Xgal顯色的組織化學方法一步實現(xiàn)對重組體轉化子克隆的鑒定。

第三，具有與M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點MCS區(qū)段可在這兩類載體系列之間來回“穿梭”?？寺≡贛CS當中的外源DNΑ片段，可以方便地從pUC8質粒載體轉移到M13mp8載體上，進行克隆序列的核酸測序工作。同時，也正是由于具有MCS序列，可以使具兩種不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到pUC8質粒載體上。（2）pUC質粒載體的優(yōu)點第一，具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)（2）pUC質粒載體的101第六節(jié)質粒載體的穩(wěn)定性問題

一．質粒載體不穩(wěn)定性的類型質粒的不穩(wěn)定性（plasrnidinstability）中包括分離的不穩(wěn)定性（segregationalinstability）和結構的不穩(wěn)定性（structuralinstability）兩個方面。（1）結構的不穩(wěn)定性：是指由轉位作用和重組作用所引起的質粒DNΑ的重排與缺失。

DNΑ的缺失、插入和重排都是造成質粒載體結構不穩(wěn)定性的原因。

（2）分離的不穩(wěn)定性：是指在細胞分裂過程中，有一個子細胞沒有獲得質粒DNΑ拷貝，并最終增殖成為無質粒的優(yōu)勢群體；

質粒的缺陷性分配（defectivePartitioning）所造成的質粒的丟失現(xiàn)象。第六節(jié)質粒載體的穩(wěn)定性問題一．質粒載體不穩(wěn)定性的類型102由此分離頻率的控制，質粒亦能夠得到穩(wěn)定的遺傳。隨機分配，它是指在細胞分裂過程中質?？截悢?shù)在兩個子細胞之間是隨機分配的.每個子細胞剛好獲得一半數(shù)目的質?？截愔灰粚|粒呈主動分配，其余是隨機分配質?？截惙峙涞阶蛹毎耐緩?主動分配（activePartition）和隨機分配（randomdistribution）。存在著有效的質粒拷貝數(shù)控制系統(tǒng)，從而保證了質粒的高度穩(wěn)定性。由此分離頻率的控制，質粒亦能夠得到穩(wěn)定的遺傳。隨機分配，它是103（1）新陳代謝負荷對質粒載體穩(wěn)定性的效應

含有質粒載體的寄主細胞加重了代謝的負荷，降低了生長的速度。

盡管在細胞分裂過程中，因隨機分配而產(chǎn)生無質粒載體細胞的機率相當?shù)停捎谶@些細胞生長速度快，經(jīng)過初始的緩慢累積之后，最終便會取代具質粒載體的細胞，成為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢群體。

（2）拷貝數(shù)差度對質粒載體穩(wěn)定性的影響

不同細胞個體之間的質粒載體拷貝數(shù)的差異程度，簡稱差度（variance），可影響質粒載體丟失的速率，也是造成質粒載體不穩(wěn)定性的原因之一。

具低差度分布（lowvariancedistribution）特性的質粒載體相當穩(wěn)定，而具有高差度分布（highvariancedistribution）特性的質粒載體，穩(wěn)定性則較差。

二．影響質粒載體穩(wěn)定性的主要因素（1）新陳代謝負荷對質粒載體穩(wěn)定性的效應

含有質粒載體的104（3）寄主重組體系對質粒載體穩(wěn)定性的效應

在野生型的大腸桿菌細胞中，質粒重組的重要結果是形成質粒寡聚體（plasmidoligomer），它同樣是造成質粒載體不穩(wěn)定性的原因之一。

決定大腸桿菌培養(yǎng)物中含質粒寡聚體細胞的比例有兩種主要的因素：其一是質粒DNΑ分子間的重組頻率，其二是含質粒寡聚體細胞的生長速率。重組的質粒二聚體一旦形成，便會以高出質粒單體分子兩倍的速度進行復制，從而導致出現(xiàn)質粒寡聚體的克隆增殖，即所謂的二聚體災難（dimercatastrophe）?；蚬こ痰馁|粒載體課件1053.隨機分配的分子機理4.主動分配的分子機理自學部分3.隨機分配的分子機理自學部分106第四章基因工程的質粒載體第四章基因工程的質粒載體107載體通論（一）基本概念載體：在基因工程中，用于承載、克隆、轉移目的基因(DNA片段)，能自我復制的DNA分子。（二）分類

克隆載體表達載體質粒載體噬菌體載體人工染色體按載體功能分按載體性質分載體通論（一）基本概念按載體功能分按載體性質分108在基因克隆時：將目的片段轉移到宿主細胞中進行復制克隆——克隆載體；在基因導入受體時：將目的片段轉移到受體細胞中并進行使之表達——轉化載體或表達載體。常用基因工程載體有：細菌質粒(克隆)；λ噬菌體(克隆)；柯斯質粒(克隆)；穿梭質粒(克隆/表達)；細菌人工染色體(克隆/表達)；酵母人工染色體(克隆/表達)；Ti質粒及其衍生載體(轉化)。常用基因工程載體有：109表達體載體宿主第一代原核生物表達體系質粒、噬菌體細菌第二代酵母表達體系穿梭質粒酵母第三代哺乳類細胞表達體系病毒、脂質體培養(yǎng)動物細胞第四代基因直接導入DNA本身生殖細胞、體細胞、個體表達體載體宿主第一代原核生物表達體系質粒、噬菌體細菌第二代110（三）基因工程載體必須具備的條件：

※（1）有復制起點

※（2）具有若干個限制性內(nèi)切酶的單一識別位點

※（3）具備合適的篩選標記

※（4）具備合適的拷貝數(shù)目（5）分子量要相對較?。?）在細胞內(nèi)穩(wěn)定性要高（7）易分離純化※表示載體必須具備的條件（三）基因工程載體必須具備的條件：111（四）基因工程中常用的載體

基因工程中常用的載體有5類：

質粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體M13

噬菌體的衍生物柯斯質粒（cosmid）

動物病毒（virus）

（四）基因工程中常用的載體基因工程中常用的載體有5112質粒*受體細胞結構插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒載體的種類和特征質粒*受體細胞結構插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pU113第一節(jié)

質粒載體

一、質粒（plasmid）是獨立于染色體以外的能自主復制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。第一節(jié)質粒載體一、質粒（plasmid）114大腸桿菌的質粒大腸桿菌的質粒115在大腸桿菌的各種菌體中找到了許多種不同類型的質粒，其中已經(jīng)作了比較詳盡研究的主要有F質粒、R質粒和Col質粒。

①F質粒又叫F因子或性質粒（sexplasmid）。它們能夠使寄主染色體上的基因和F質粒一道轉移到原先不存在該質粒的受體細胞中去。

②R質粒通稱抗藥性因子。它們編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且通常能夠將此種抗性轉移到缺乏該質粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。

③Col質粒即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌是一類可以使不帶有Col質粒的親緣關系密切的細菌菌株致死的蛋白質。在大腸桿菌的各種菌體中找到了許多種不同類型的質粒，其中已經(jīng)作116（1）分子?。?.質粒的一般生物學特性1—200kb（2）編碼基因少：2—3個中等大小的蛋白質。（3）環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀DNA。（酵母的“殺傷質?！笔荝NA）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細菌一些額外的特性（非必須）。（1）分子?。?.質粒的一般生物學特性1—200kb（1171．當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結構時，稱之為共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA），這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構型；

2．如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結構，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口時，稱之為開環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構型；

3．若質粒DNA經(jīng)過適當?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后，發(fā)生雙鏈斷裂形成線性分子（IDNA），通稱L構型（4）質粒的空間構型：1．當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結構時，稱之為共價閉118（5）質?？臻g構型與電泳速率在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構型的同一種質粒DNA，盡管分子量相同，仍具有不同的電泳遷移就緒。其中走在最前沿的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNASCOCL（5）質粒空間構型與電泳速率在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構型的同119（1）質粒的類型：在大腸桿菌中的質粒，可以分為：接合型質粒:非接合型質粒能自我轉移不能自我轉移2質粒DNA的轉移（1）質粒的類型：在大腸桿菌中的質粒，可以分為：接合型質粒120按接合轉移功能分類主要基因按抗性記號分類非接合型質粒自主復制基因，產(chǎn)生大腸桿菌素基因Col質粒自主復制基因，抗菌素抗性基因R質粒(R因子)接合型質粒自主復制基因，轉移基因，細菌染色體區(qū)段F質粒（F因子）自主復制基因，轉移基因，大腸桿菌素基因Col質粒自主復制基因，轉移基因，抗菌素抗性基因R質粒(R因子)自主復制基因，轉移基因，大腸桿菌素基因Ent質粒按接合轉移功能分類主要基因按抗性記號分類非接合型質粒自主復制121除了帶有自我復制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌配對和質粒接合轉移的基因。如：F質粒（性質粒、或F因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉移到原先不存在該質粒的受體菌中。又叫自我轉移型質粒。（1.1）接合型質粒不符合基因工程的安全要求。除了帶有自我復制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌配對和質122（2）F質粒(Fplasmid)又稱F因子、致育因子或性因子，是大腸桿菌等細菌決定性別并有轉移能力的質粒。分子量約為大小94kb，共編碼19個轉移基因。F質粒在寄主細胞中有三種存在形式：以染色體外環(huán)形雙鏈質粒DNA形式存在，不帶來自寄主染色體的基因或DNA區(qū)段。以染色體外環(huán)形雙鏈質粒DNA形式存在，攜帶著細菌的染色體基因或DNA區(qū)段。以線性DNA形式從不同位點整合到寄主染色體上。（2）F質粒(Fplasmid)123F質粒結構：tra區(qū)（轉移區(qū)，與質粒轉移和性菌毛合成有關）oriT（轉移起始點）oriS復制起始點）inc（不相容群）rep（復制功能）轉座因子F質粒結構：124根據(jù)F質粒在細胞中的存在方式，可把大腸桿菌分成四種不同接合型菌株。（1）F+菌株F+菌株即“雄性”菌株，指細胞內(nèi)存在一至幾個F質粒，并在細胞表面著生一至幾條性菌毛的菌株。（2）F-菌株F-菌株即“雌性”菌株，指細胞中無F質粒、細胞表面也無性菌毛的菌株。根據(jù)F質粒在細胞中的存在方式，可把大腸桿菌分成四種不同接合型125（3）Hfr菌株（高頻重組菌株）在Hfr菌株（高頻重組菌株）細胞中，因質粒由游離態(tài)轉為在核染色體組特定位點上的整合態(tài)，故Hfr菌株與F-菌株相接合后，發(fā)生基因重組的頻率比單純用F+與F-接合后的頻率高出數(shù)百倍。（4）F’菌株當Hfr菌株細胞內(nèi)的F質粒因不正常切離而脫離核染色體組時，可重新形成游離的、但攜帶整合位點鄰近一小段核染色體基因的特殊F質粒，稱F’質粒或F’因子。（3）Hfr菌株（高頻重組菌株）126在合適的條件下，將雄性細胞和雌性細胞混合培養(yǎng)，由于性須的作用，就會形成雌-雄細胞配對，這種過程稱為細菌的接合作用（conjunction）。F因子DNA拷貝，需1分鐘時間從雄性細胞轉移到雌性細胞在合適的條件下，將雄性細胞和雌性細胞混合培養(yǎng)，由于性須的作用127（3）質粒DNA的接合轉移

①細胞交配對的形成雄性細胞的性須頂端與受體細胞表面接觸之后，便會迅速收縮，把給體細胞與受體細胞拉在一起。因此，性須在確立配對細胞表面間的緊密接觸方面，起著至關重要的作用。

大腸桿菌雄性細胞是不會同其它的亦帶有F質粒的細胞發(fā)生配對作用的，因為traS和traT編碼的“表面排斥”蛋白質，使此種細胞無法成為接合作用的受體。這就決定了雄性細胞只能同不具F因子的雌性細胞配對的特異性。

②質粒DNA的轉移F質粒DNA的轉移是從轉移起點oriT開始的。當細胞交配對建立之后，TraY和TraI蛋白質首先在oriT位點作單鏈切割，隨后缺口鏈在其游離的5′-端的引導下轉移到受體細胞，并作為模板合成互補鏈，形成新的質粒分子。于是受體細胞便轉變成為具有F因子的雄性細胞。（3）質粒DNA的接合轉移

①細胞交配對的形成128基因工程的質粒載體課件1292.非接合型質粒：雖然帶有自我復制所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質粒接合轉移的基因，因此不能從一個細胞轉移到另一個細胞。（1）R質粒（抗性質粒）：帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。2.非接合型質粒：雖然帶有自我復制所必需的遺傳信息，但失去130基因工程的質粒載體課件131帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col質粒：大腸桿菌素對不帶Col質粒的大腸桿菌有毒。Col質粒或R質粒如果帶有轉移基因，也可以成為接合型質粒。帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col132

非接合型的質粒，由于分子小，不足以編碼全部轉移體系所需要的基因，因而不能夠自我轉移。但如果在其寄主細胞中存在著一種接合型的質粒，那么它們通常也是可以被轉移的。這種由共存的接合型質粒引發(fā)的非接合型質粒的轉移過程，叫做質粒的遷移作用（mobilization）。

ColE1是一種可以遷移但是屬于非接合型的質粒。需要質粒自己編碼的兩種基因參與。一個是位于ColE1DNA上的特異位點bom；另一個是ColE1質粒特有的彌散的基因產(chǎn)物，即mob基因（mobilizationgene）編碼的核酸酶。3質粒DNA的遷移作用非接合型的質粒，由于分子小，不足以編碼全部轉移體系所需要133基因工程的質粒載體課件134相容性的兩種質粒F和ColE1共存于同一細菌細胞中，F(xiàn)質粒可以為ColE1質粒提供其所缺乏的結合功能，這樣使得ColE1質粒也能夠發(fā)生轉移作用。（a）表示位于F-細胞中的ColE1質粒的狀，它的mob基因進行了轉錄，其產(chǎn)物使bom位點發(fā)生單鏈斷裂而出現(xiàn)缺口，于是ColE1DNA便從超盤旋的的結構轉變成為缺口環(huán)狀的構型。但ColE1質粒缺乏形成性須的能力，無力進行結合配對，所以它的DNA也就不能從一個細胞轉移到另一個細胞。正是由于不能夠發(fā)生轉移，這種從超盤旋到缺口環(huán)狀的構型轉變過程，就有可能被回復，所以就出現(xiàn)這兩種構型之間的平衡狀態(tài)。（b）中的細胞同時含有F和ColE1兩種質粒。F因子能夠導致性須的合成，為其DNA轉移提供了轉移裝置，因此ColE1可以被轉移。而在F質粒提供的這種轉移裝置被分離掉的情況下，ColE1的mob-突變體便不能夠轉移。遺傳分析證明，mob-突變是隱性的，mob基因編碼一種蛋白質。而且當這種突變體質粒被分離出來時，并不是以松弛復合物的形式存在。（c）所示，F(xiàn)質粒無力幫助mob-突變體進行轉移，其中F性須和轉移裝置雖已形成，但ColE1DNA并沒有發(fā)生缺口。（d）表示另一種具mob+表型并帶有一個順式顯性突變的ColE1突變體，它缺失了bom位點。在這樣的寄主細胞中，雖然能夠合成mob蛋白質，但由于不能發(fā)生缺口，因此仍然不能夠轉移。相容性的兩種質粒F和ColE1共存于同一細菌細胞中，F(xiàn)質?？?354質粒DNA的復制類型1.低拷貝數(shù)的質?？截悢?shù)少，只有1—3份拷貝，也稱為“嚴緊型”復制控制的質粒（stringentplasmid）2.高拷貝的質?？截悢?shù)多，有10—60份拷貝，也稱為“松弛型”復制控制的質粒（relaxedplasmid）（非接合型質粒分子量小，一般屬松弛型）。根據(jù)寄主細胞所含的拷貝數(shù)的多少，將質粒分為低拷貝數(shù)的質粒和高拷貝數(shù)的質粒4質粒DNA的復制類型1.低拷貝數(shù)的質?？截悢?shù)少，只有1—136質?？截悢?shù)：每條細菌染色體所平均具有的質粒DNA分子數(shù)目。質粒的結合轉移能力，同它們的分子大小及復制類型間存在一定的相關性。接合型質粒，分子量大，一般屬嚴緊型非接合型質粒分子量小，一般屬松弛型質?？截悢?shù)：每條細菌染色體所平均具有的質粒DNA分子數(shù)目。137基因工程的質粒載體課件138（1）質粒的不親和性現(xiàn)象

所謂質粒的不親和性（plasmidincompatibility），有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質粒稱為不親和質粒

不親和群（incompatibilitygroup），指具有親緣關系，但彼此之間是互不相容的質粒。

5質粒的不親和性（1）質粒的不親和性現(xiàn)象

5質粒的不親和性139（2）質粒不親和性的分子基礎

質粒不親和性的分子基礎，主要是由于它們在復制功能之間的相互干擾造成的。

大多數(shù)質粒都會產(chǎn)生出一種控制質粒復制的阻遏蛋白質，其濃度是與質粒的拷貝數(shù)成正比的。阻遏蛋白質通過同其靶序列間的相互作用，使雙鏈DNA中的一條鏈斷裂，從而導致質粒DNA復制的啟動，并建立起一種調(diào)節(jié)質?？截悢?shù)的負反饋環(huán)（negativefeedbackloop）。當質粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白質時，其復制活動便被抑制；而當質粒處于低拷貝和低濃度遏蛋白質的條件下，它的復制反應便會繼續(xù)進行。

由于每一種質粒的復制速率和拷貝數(shù)控制，都是由一對不相容質粒產(chǎn)生的阻遏蛋白質總濃度聯(lián)合調(diào)控的，這種交叉抑制的結果，使細胞中質?？截悢?shù)，比其單獨感染狀態(tài)下的正?？截悢?shù)減少許多。（2）質粒不親和性的分子基礎

質粒不親和性的分子基礎，主140同一細胞中含有兩種不相容的質粒，其產(chǎn)生的阻遏蛋白質不僅調(diào)節(jié)自身的復制，也會調(diào)節(jié)另一種與之共存的不相容質粒的復制同一細胞中含有兩種不相容的質粒，其產(chǎn)生的阻遏蛋白質不僅調(diào)節(jié)自141一．質粒DNA復制的多樣性不同質粒DNA的復制在如下幾個方面存多樣性：（i）對寄生酶的依賴性

有的完全利用寄主細胞所提供的核酸酶，有的自身也編碼若干核酸酶，參加DNA復制（ii）DNA聚合酶的利用

多數(shù)利用polIII,有的質粒利用polI（iii）復制的方向性

有純單向的，純雙向的，有既有單向又又雙向的（iv）復制的終止

單向復制，在起點處終止復制雙向復制，在復制叉到達同一位點時終止，或有一固定的終止位點（v）復制型

蝶狀復制第二節(jié)質粒DNA的復制與拷貝數(shù)的控制一．質粒DNA復制的多樣性第二節(jié)質粒DNA的復制與拷貝數(shù)的142ColE1質粒DNA的復制，是從一個特定的復制起點（ori）開始，并沿著環(huán)DNA分子單向性地進行?？刂拼朔N質粒DNA復制啟動的兩種關鍵因素RNAI和RNAⅡ兩種RNA分子，都是由ColE1DNA轉錄產(chǎn)生的。RNAⅡ也叫做復制引物。RNAⅡ分子在轉錄起點附近同互補的模板DNA形成一種雜交分子，被RnaseH酶所切割，從而釋放出3′-OH末端，作為供DNA聚合酶Ⅰ合成DNA的引物。RNAⅠ可以通過同RNAⅡ結合，以阻止其與模板DNA發(fā)生雜交作用。

從本質上講，ColE1質粒的復制啟動顯然是受一種負反饋機理控制的。根據(jù)這種模型，細胞中RNAⅠ分子的濃度是隨著質?？截悢?shù)的多寡而增減的。例如，若細胞中質?？截悢?shù)下降到正常數(shù)值以下的水平，RNAⅠ的濃度也就相應降低，于是質粒的復制也就受到較少的抑制，結果導致其拷貝數(shù)的上升。二．ColE1質粒DNA復制的啟動ColE1質粒DNA的復制，是從一個特定的復制起點（ori）143三．質粒復制控制的分子模型質粒DNA復制控制機理的分子模型有兩種：自體阻遏蛋白質模型（autorepressormodel）：