植物組培實(shí)驗(yàn)報告-高睿VIP

植物組培實(shí)驗(yàn)報告-高睿不同激素配比對煙草葉片外植體分化的影響摘要:培養(yǎng)基是調(diào)控?zé)煵萑~片外植體分化途徑的一個重要因素，以不同激素配比的培養(yǎng)基比較其對煙草葉片外植體分化的影響，研究不同激素濃度配比對外植體分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在NAA/6-BA激素配比中，MS+NAA(0.5mg/L)+6-BA(1.5mg/L)為出芽最優(yōu)培養(yǎng)基;在IAA/6-BA激素配比中，MS+IAA(Omg/L)+6-BA⑵Omg/L)是最優(yōu)生根培養(yǎng)基。得出一結(jié)論：當(dāng)NAA濃度低時(即6-BA濃度高時)有利于芽的分化，當(dāng)IAA濃度高時(即6-BA濃度低時)有利于根的分化。關(guān)鍵詞:激素配比，煙草葉片，外植體，愈傷組織刖g煙草(Nicotianatabacum)屬茄科煙草屬的一年生草本植物，原產(chǎn)于美洲和大洋洲|。煙草作為重要的經(jīng)濟(jì)作物和工業(yè)原料作物，具有藥用、工業(yè)用、保健美容等價值，不僅對國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展起著重要作用，而且作為模式植物在植物研究中得到廣泛應(yīng)用。目前，煙草一般采用有性繁殖，但繁殖的煙苗不均衡，易發(fā)生變異，而且易感病菌，造成多種病害發(fā)生，品質(zhì)退化，從而影響經(jīng)濟(jì)收入。而通過組織培養(yǎng)技術(shù)，可以保持煙草優(yōu)良品種的優(yōu)良性狀，減少病蟲害，從而達(dá)到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的目的[2,4,5]。由于其易進(jìn)行組織培養(yǎng)得到再生植株，被廣大學(xué)者譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的理想植物，也是研究植物細(xì)胞分化和脫分化的理想材料，故此煙草在植物組織分化研究中占據(jù)了重要的地位。激素是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，調(diào)節(jié)激素水平和配比，已成為提高組織分化頻率的有效手段，人們利用植物愈傷組織研究激素調(diào)節(jié)工作已有許多報道[4,6,7]。但在具體試驗(yàn)中，激素的種類、濃度和配比，十分錯綜復(fù)雜。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中需對培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，以求得最適激素種類、濃度和配比。本實(shí)驗(yàn)以煙草葉片組織為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，主要研究不同植物激素配比的MS培養(yǎng)基上煙草愈傷組織誘導(dǎo)的情況。材料方法1實(shí)驗(yàn)材料無菌煙草苗葉片2實(shí)驗(yàn)試劑MS培養(yǎng)基母液，NAA,6-BA,IAA,70%乙醇，Imol/LNaOH,1mol/LHClo3實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺，高壓滅菌設(shè)備，手術(shù)剪、長柄剪子，解剖刀，酒精燈，電子天平，無菌吸水紙，標(biāo)簽紙，記號筆，燒杯，培養(yǎng)皿，三角瓶，線繩，，封口膜，移液搶等。4實(shí)驗(yàn)設(shè)計表1不同激素配比5試驗(yàn)方法(1)MS培養(yǎng)基配制取一個大燒杯，加入一定量的水，再分別加入四種MS培養(yǎng)基母液、蔗糖30g/L,瓊脂7g/L,進(jìn)行加熱溶解。用蒸儲水定容至1000ml,再用1mol/L的NaOH和HCl將pH調(diào)至5.8。將培養(yǎng)基平均分裝入10個100ml三角瓶內(nèi)，貼上標(biāo)簽。(2)將培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋,0.11Mpa,121?下滅菌20min。(3)接種a、接種前打開超凈工作臺紫外燈照射30min,之后關(guān)閉紫外燈打開送風(fēng)開關(guān)并通風(fēng)lOmin;b、用70%乙醇溶液擦拭超凈工作臺臺面和手，將培養(yǎng)基及接種工具放入超凈工作臺臺面兩側(cè);C、根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計表1植物激素配比添加激素，倒板（超凈工作臺下進(jìn)行）；d、取無菌煙草苗的嫩葉片作外植體。將無菌煙草葉片放入無菌碟子中,每片葉子用解剖刀切去邊緣后再切成5mm見方小塊,在火焰上方接入到各個培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)皿中可接種3-4個小塊（超凈工作臺下進(jìn)行）；e、將各個培養(yǎng)基貼上標(biāo)簽，放到培養(yǎng)室中培養(yǎng)。（4）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察記錄，并照相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過30天的觀察，對不同的激素配比外植體的發(fā)育情況進(jìn)行了記錄。.愈傷組織分化的形態(tài)發(fā)生接種培養(yǎng)1周后，培養(yǎng)基內(nèi)的葉片邊緣慢慢上卷，葉片外植體明顯膨大，培養(yǎng)2周后，切口邊緣處形成淡綠或淺黃色的愈傷組織，；愈傷組織首先發(fā)生在葉片邊緣，為淡綠色顆粒狀，隨著進(jìn)一步培養(yǎng)，出愈傷不斷加大。但多是葉片邊緣形成的愈傷不斷擴(kuò)增，葉片中央形成少量愈傷。培養(yǎng)3周后，形成大塊的，質(zhì)地緊密的淺綠色半透明的愈傷組織，并且愈傷組織上出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。再繼續(xù)培養(yǎng)至30天，進(jìn)行觀察。.激素對愈傷組織分化的影響本實(shí)驗(yàn)以MS培養(yǎng)基為對照，對3種激素設(shè)置了兩種組合，每種激素組合含5個濃度配比，每組處理3次重復(fù)。在MS對照培養(yǎng)基上，葉片慢慢變黃，枯萎至死，未形成愈傷組織（圖1）。圖1MS對照培養(yǎng)基2.2在第1組NAA與6-BA激素配比中，葉片外植體均產(chǎn)生了愈傷組織9愈傷組織誘導(dǎo)率為100%。其中，編號1號和2號培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)分化出莖芽，2號培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化出的莖芽要多于1號培養(yǎng)基(圖;3號和4號培養(yǎng)基愈傷組織無任何分化，5號培養(yǎng)基其愈傷組織誘導(dǎo)分化出少量的根(圖3)。AB圖2A為1號培養(yǎng)基:NAA?6-BA為0?2.0((mg/L)B為2號培養(yǎng)基:NAA?6-BA為0.5?1.5(mg/L)CDE圖3c為3號培養(yǎng)基:NAA?6-BA為1.0?1.0(mg/L)D為4號培養(yǎng)基:NAA?6-BA為1.5?0.5(mg/L)E為5號培養(yǎng)基:NAA?6-BA為0?2.0(mg/L)2.3在第2組IAA與6-BA激素配比中，葉片外植體均產(chǎn)生了愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%。其中，編號1號培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)分化出莖芽，2號、3號和4號培養(yǎng)基愈傷組織無任何分化，5號培養(yǎng)基其愈傷組織誘導(dǎo)分化出大量的根(圖4)。12345圖41、2、3、4、5分別代表培養(yǎng)基編號，與表1中2組IAA/6BA的配比相對應(yīng)。討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源激素對愈傷組織的分化有著至關(guān)重要的作用，適量的外源激素能夠在外植體分化初期和內(nèi)源激素相互作用誘導(dǎo)外植體分化，外源激素量過高或者過低都能阻礙轉(zhuǎn)基因煙草外植體分化。本試驗(yàn)中，在不含任何激素的MS對照培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)煙草葉片外植體慢慢變黃至死亡，不能形成愈傷組織。在NAA/6-BA與IAA/6-BA激素配比不同的情況下，培養(yǎng)基均產(chǎn)生了愈傷組織，并具有愈傷組織誘導(dǎo)分化出莖芽和根的現(xiàn)象。其中，在NAA/6-BA激素配比影響下，MS+NAA(Omg/L)+6-BA(2.Omg/L)與MS+NAA(0.5mg/L)+6-BA(1.5mg/L)適合愈傷組織誘導(dǎo)分化出莖芽，且MS+NAA(0.5mg/L)+6-BA(l.5mg/L)為出芽最優(yōu)培養(yǎng)基;MS+NAA(2.Omg/L)+6-BA(Omg/L)能夠誘導(dǎo)愈傷組織分化出少量的根，根具有白色的根毛。在IAA/6-BA激素配比中，MS+IAA(0mg/L)+6-BA(2.0mg/L)中誘導(dǎo)分化出莖芽，被認(rèn)為是最優(yōu)生芽培養(yǎng)基;MS+IAA(0mg/L)+6-BA(2.Omg/L)中誘導(dǎo)分化出大量的具白色根毛的根，被認(rèn)為是最優(yōu)生根培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)基中NAA/6-BA比值高時促進(jìn)根的分化，比值低時促進(jìn)芽的分化，2種激素濃度相當(dāng)時\誘導(dǎo)愈傷組織占優(yōu)勢或不分化。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)NAA濃度高時，有利于根的分化，當(dāng)6-BA高時，有利于芽的分化。曾有研究表明:6-BA對芽器官形成有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用[8],但附加2mg/L的NAA后，則抵消BA對芽形成的促進(jìn)作用而明顯促進(jìn)愈傷組織的形成。本文的研究結(jié)果與其一致。據(jù)報道，在培養(yǎng)過程中，當(dāng)IAA的相對濃度較高時，則有利于根的分化和細(xì)胞增殖[9]。本實(shí)驗(yàn)中，IAA/6-BA的激素配比中，最大IAA濃度下產(chǎn)生了大量的根，這與報道相一致。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在植物激素誘導(dǎo)愈傷組織形成和莖芽分化中，激素的配比是很重要的，不同的激素配比，對外植體材料產(chǎn)生愈傷組織和根芽分化影響很大[10]o在該試驗(yàn)中，一些培養(yǎng)皿中的外植體無分化，還有一些外植體感染了細(xì)菌。因此，要想減少外界因素的干擾，應(yīng)注意以下4點(diǎn)：(1)接種用的工具要在酒精燈火焰上灼燒。應(yīng)盡量使外植體切口接觸培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿邊緣應(yīng)斜向火焰，在酒精燈火焰附近操作。(2)封口時用封口膜將培養(yǎng)皿封緊密，以免微生物進(jìn)入，造成污染，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。滅菌工作至關(guān)重要。(3)在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)前，將培養(yǎng)基和接種所需的物品放在高壓蒸氣滅菌鍋中滅菌。(4)接種前，操作者要用肥皂清洗雙手，擦干，再用酒精棉球擦拭雙手和超凈工作臺。參考文獻(xiàn)[1]周仕順，掏志章.煙草的組織培養(yǎng)[J].云南農(nóng)業(yè)科技，2005,(1).[2]肖軍,張云霄，劉伯峰.煙草的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].泰山學(xué)院學(xué)報,2009,06:94-98.[3]施和平,等.煙草葉片組織培養(yǎng)及植株再生[J].亞熱帶植物科學(xué)，2003,32(4).[4]康實(shí).煙草的組織培養(yǎng)研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J].楚雄師專學(xué)報，1999,14(3).[5]何川生，王曉云，雷永和.煙草快速繁殖及培養(yǎng)的研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998(4):392-395.[6]崔澄.植物激素與細(xì)胞分化及形態(tài)發(fā)生的關(guān)系.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1983,5⑵：「5[7]陳輝，姚志恒.煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)的驗(yàn)證[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,14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