酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)課件

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響二、米氏公式的導(dǎo)出三、米氏方程的討論四、米氏常數(shù)的求法五、多底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)一、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響21345678002

4

68底物濃度mmole生成物濃度806040200S+E↓P(固定酶的濃度在固定時(shí)間內(nèi)反應(yīng))（單底物酶促反應(yīng)）酶與底物先絡(luò)合成一個(gè)中間產(chǎn)物，然后中間產(chǎn)物進(jìn)一步分解成產(chǎn)物和游離的酶。酶的底物飽合現(xiàn)象——中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)非酶催化劑酶催化劑中間產(chǎn)物假說(shuō)證據(jù)Michaelis與

Menten提出酶催化動(dòng)力學(xué)MichaelisMentenNelson&Cox(2000)LehningerPrinciplesofBiochemistry(3e)p.2581913年Ks為底物解離常數(shù)（底物常數(shù)）二、米氏方程的導(dǎo)出1、根據(jù)酶反應(yīng)的中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)：假定E+SES迅速建立平衡，底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度下，K3<<K2即K3反應(yīng)特別慢，可以忽略不計(jì)。

米式方程的導(dǎo)出：早年的米式方程基于快速平衡假說(shuō)①

在反應(yīng)的初始階段，[S]遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于[E]，因此，[S]可以認(rèn)為不變。②

因?yàn)檠芯康氖浅跛俣龋琍的量很小，由P+EES可以忽略不記。③

游離的酶與底物形成ES的速度極快（快速平衡），而ES形成產(chǎn)物的速度極慢，故，[ES]的動(dòng)態(tài)平衡與ESP+E沒(méi)有關(guān)系（既K1、K2

＞＞K3

）ES的生成速度：K1（[E]-[ES]）[S]ES的分解速度：K2[ES]K1（[E]-[ES]）[S]=K2[ES]反應(yīng)速度：KS現(xiàn)在稱(chēng)為底物常數(shù)

米氏推導(dǎo)酶促反應(yīng)速度公式時(shí)，認(rèn)為[ES]的積累是快速平衡的結(jié)果，而沒(méi)有考慮ESE+P這一步。而B(niǎo)riggs認(rèn)為應(yīng)當(dāng)考慮這一步，因?yàn)椴⒉豢偸荎3<<K2,ESE+P這一步也可能速度很快，這時(shí)，E，S和ES將不能處于一個(gè)平衡狀態(tài)。布氏提出穩(wěn)態(tài)理論。1925年Briggs和Haldane提出穩(wěn)態(tài)理論ES+P+ES的生成量與消失量相等，故平衡時(shí)

[ES]濃度成一穩(wěn)定狀態(tài)。SEESteadyState時(shí)

ES的濃度恒定SPEES反應(yīng)時(shí)間濃度穩(wěn)態(tài)理論(SteadyStatetheory)的假設(shè)穩(wěn)態(tài)理論下米氏方程的推導(dǎo)E+SESE+P(vo)k2k1k3

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]vo=Vmax

[S]Km

+

[S][E0]

=

[E]

+

[ES]vo=k3[ES]Vmax=k3[E0]酶必須先與底物結(jié)合ES的生成量等于其消失量[ES]濃度恒定SteadyState由上式出發(fā)可推得Michaelis-Menten公式[E0]

酶的總量穩(wěn)態(tài)理論下米氏方程的推導(dǎo)E+SESE+P(vo)k2k1k3S穩(wěn)態(tài)理論下米氏方程的推導(dǎo)[E0]

=

[E]

+

[ES]vo=k3[ES]Vmax=k3[E0][E0]

酶的總量當(dāng)[S]<<Km時(shí)當(dāng)[S]>>Km時(shí)當(dāng)[S]=Km時(shí)米氏方程定量的表達(dá)了反應(yīng)初速度與底物濃度之間的關(guān)系與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。三、米氏方程的討論

米氏方程的意義①物理意義:

當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度（Vmax)的一半時(shí)的底物濃度.②Km的引伸意義:Km是酶學(xué)研究中的重要研究數(shù)據(jù),表示了酶的一個(gè)基本性質(zhì).Km值是酶的特征常數(shù)之一,與酶的性質(zhì)有關(guān),而與酶的濃度無(wú)關(guān),不同的酶,其Km值不同.對(duì)于專(zhuān)一性不強(qiáng)的酶來(lái)說(shuō)對(duì)于每一個(gè)底物都有一個(gè)相應(yīng)的Km值.2、米式方程中各參數(shù)的意義

1)Km的意義三、米氏方程的討論Km與天然底物Km最小的底物稱(chēng)該酶的最適底物或天然底物。因?yàn)椋篕m愈?。ㄟ_(dá)到Vmax一半所需的底物濃度愈?。┍硎綱對(duì)△[S]越靈敏。V[S]1/2VmaxKm三、米氏方程的討論快速平衡假說(shuō)與穩(wěn)態(tài)平衡假說(shuō)的實(shí)質(zhì)區(qū)別當(dāng)K1、K2>>K3時(shí)，即ESP+E是整個(gè)反應(yīng)平衡中極慢的一步“穩(wěn)態(tài)平衡=快速平衡+慢速平衡”：當(dāng)ESP+E極慢（K3/K1極?。r(shí)，穩(wěn)態(tài)平衡基本等于快速平衡三、米氏方程的討論Km、Ks與底物親和力Km是ES分解速度（K2+K3）與形成速度（K1）的比值，它包含ES解離趨勢(shì)（K2／K1）和產(chǎn)物形成趨勢(shì)（K3／K1）。Ks是底物常數(shù)，只反映ES解離趨勢(shì)（底物親和力），1/Ks可以準(zhǔn)確表示酶與底物的親和力大小。只有當(dāng)K1、K2>>K3時(shí)，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物親和力的大小。底物親和力大不一定反應(yīng)速度大（反應(yīng)速度更多地與產(chǎn)物形成趨勢(shì)K3／K1有關(guān)）三、米氏方程的討論2)Km值的用途——根據(jù)Km推測(cè)代謝的方向及程度根據(jù)正逆反應(yīng)Km的差別及細(xì)胞內(nèi)正逆兩相底物的濃度推測(cè)酶促反應(yīng)的正逆方向。根據(jù)代謝途徑中各個(gè)酶的Km及其相應(yīng)底物濃度判斷限速步驟（Km最大的步驟不一定是限速步驟）根據(jù)Km值的大小判斷分支代謝的流向酶工程與代謝工程中改造酶的Km調(diào)控代謝途徑（強(qiáng)化則降低Km，弱化則提升Km

）三、米氏方程的討論3)米式方程的用途（1）根據(jù)[S]求V（2）根據(jù)V（或相對(duì)速度a）求[S]三、米氏方程的討論設(shè)定達(dá)到最大反應(yīng)速度的0.9倍時(shí)，所需底物濃度為[S]0.9[S]0.9=9Km同理有：[S]0.8=4Km[S]0.7=2.33Km[S]0.6=1.5Km[S]0.5=1Km[S]0.1=1/9Km[S]0.9/[S]0.1=81[S]0.7/[S]0.1=21三、米氏方程的討論（3）根據(jù)相對(duì)速度推測(cè)酶活性中心飽和度當(dāng)v=Vmax時(shí)，表明酶的活性部位已全部被底物占據(jù)。當(dāng)v=1/2Vmax時(shí)，表示活性部位有一半被占據(jù)。3)米式方程的用途4)、Vmax與K3（

Kcat）的意義Vmax不是一個(gè)常數(shù)，它取決于酶的濃度，它是一個(gè)酶反應(yīng)體系的速度的極限值。Vmax=K3[E0]K3代表酶被底物飽和時(shí)每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，稱(chēng)為轉(zhuǎn)換數(shù)（或催化常數(shù)，Kcat），表明酶的最大催化效率三、米氏方程的討論5)、Kcat/Km

表示酶的實(shí)際催化效率

三、米氏方程的討論在生理?xiàng)l件下，大多數(shù)酶并不被底物所飽和，在體內(nèi)[S]/Km的比值通常介于0.01到1之間[S]<<Km時(shí)：Kcat/Km的上限是K1，既生成ES復(fù)合物的速度(酶促反應(yīng)的速度不會(huì)超過(guò)ES的形成速度K1，在水相中不會(huì)超過(guò)108~109）只有Kcat/Km可以客觀地比較不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率1、

Lineweaver-Burk

雙倒數(shù)作圖法四、米氏常數(shù)的求法選底物濃度應(yīng)考慮能否得到1/[S]的常數(shù)增量[S]為1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10時(shí)1/[S]為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常數(shù)增量。[S]為常數(shù)增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10時(shí)，1/[S]為0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常數(shù)增量，點(diǎn)多集中在1/v軸附近。該作圖的缺點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)點(diǎn)過(guò)分集中在直線的左下方，而低濃度S的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)又因倒數(shù)后誤差較大，往往偏離直線較遠(yuǎn)。從而影響Km和Vmax的準(zhǔn)確測(cè)定。四、米氏常數(shù)的求法2、Eadie-HofsteeV—V/[S]作圖法3、Hanes-Woolf作圖法

4、Eisenthal作圖法

5、Hill作圖法（寡聚酶）-LogKmLog[S]四、米氏常數(shù)的求法（一）雙底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)理序列反應(yīng)或單一置換反應(yīng):有序反應(yīng)Orderedreaction(orderedBiBi)隨機(jī)反應(yīng)Randomreactions(randomBiBi)乒乓反應(yīng)或雙置換反應(yīng)五、多底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1、有序反應(yīng)機(jī)理只有先導(dǎo)底物A(Leadingsubstrate)首先與酶結(jié)合，然后B才能與酶結(jié)合，形成的三元復(fù)合物EAB（ternarycomplex)轉(zhuǎn)變?yōu)镋PQ，B的產(chǎn)物P先釋放，A的產(chǎn)物Q后釋放?！裨谌鄙貯時(shí)，B不能與E結(jié)合五、多底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQ反應(yīng)的總方向決定于A、Q的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù)NAD與NADH相互競(jìng)爭(zhēng)E上的NAD結(jié)合部位2、隨機(jī)反應(yīng)機(jī)理底物A、B與酶結(jié)合的順序是隨機(jī)的，形成的三元復(fù)合物AEB→QEP，產(chǎn)物P、Q的釋放順序也是隨機(jī)的。五、多底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)限速步驟是AEB→QEPA與Q相互競(jìng)爭(zhēng)E上的底物結(jié)合部位A，B與P相互競(jìng)爭(zhēng)E上的底物結(jié)合部位B反應(yīng)的總方向決定于A、B、Q、P的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù)3、乒乓反應(yīng)機(jī)理五、多底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)整個(gè)反應(yīng)歷程中只有二元復(fù)合物形式，沒(méi)有三元復(fù)合物形式谷氨酸：草酰乙酸氨基轉(zhuǎn)移酶符合雙置換、雙底物機(jī)制的酶（二）雙底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程1、乒乓機(jī)制的動(dòng)力學(xué)方程KmA：[B]達(dá)到飽和濃度時(shí)A的米氏常數(shù)KmA’：A的表觀米氏常數(shù)Vmax：[A][B]都達(dá)到飽和濃度時(shí)的最大反應(yīng)速度五、多底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2、序列機(jī)制的底物動(dòng)力學(xué)方程五、多底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)六、pH值對(duì)酶反應(yīng)速度的影響七、溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響八、酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響九、激活劑對(duì)酶活性的影響十、抑制劑對(duì)酶活性的影響第四節(jié)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（二）

大多數(shù)酶的活性受pH影響顯著，在某一pH下表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，酶活力顯著下降。酶表現(xiàn)最大活力的pH稱(chēng)為酶的最適pH。典型的酶速度-pH曲線是較窄的鐘罩型曲線。六、pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響2.最適pH(optimumpH)2.pH影響酶活力的因素①影響酶蛋白構(gòu)象，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)使酶變性。②影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。③影響酶和底物分子中另外一些基團(tuán)解離，這些基團(tuán)的離子化狀態(tài)影響酶的專(zhuān)一性及活性中心構(gòu)象。3.pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響酶的提純及測(cè)活時(shí)要選擇酶的穩(wěn)定pH，通常在某一pH緩沖液中進(jìn)行。一般最適pH總是在該酶的穩(wěn)定pH范圍內(nèi)，故酶在最適pH附近最為穩(wěn)定。六、pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響4.酶活力——pH曲線的類(lèi)型最適pH與底物種類(lèi)、濃度及緩沖液成分有關(guān)。雖然大部分酶的pH—酶活曲線是鐘形，但也有半鐘形甚至直線形。六、pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響1．最適溫度及影響因素溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響有兩個(gè)方面：①提高溫度，加快反應(yīng)速度。

溫度系數(shù)Q10：溫度升高10℃，反應(yīng)速度與原來(lái)的反應(yīng)速度之比，大多數(shù)酶的Q10一般為1~2。②提高溫度，酶變性失活。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度稱(chēng)為該酶促反應(yīng)的最適溫度（optimumtemperatureTm）.七、溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響最適溫度不是酶的特征常數(shù)，因?yàn)橐环N酶的最適溫度不是一成不變的，它要受到酶的純度、底物、激活劑、抑制劑、酶反應(yīng)時(shí)間等因素的影響。因此，酶的最適溫度與其它反應(yīng)條件有關(guān)。八、酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

v===在一定溫度和pH下，酶促反應(yīng)在底物濃度大大超過(guò)酶濃度時(shí)，速度與酶的濃度呈正比。酶濃度對(duì)速度的影響機(jī)理：酶濃度增加，[ES]也增加，故反應(yīng)速度增加。激活劑（activator):凡是能提高酶活性的物質(zhì)。1、

無(wú)機(jī)離子的激活作用（1）金屬離子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+（2）陰離子：Cl-、Br-、PO43-（3）氫離子不同的離子激活不同的酶。不同離子之間有拮抗作用和可替代作用，如Na+與K+、Mg2+與Ca2+之間常常拮抗，但Mg2+與Zn2+?？商娲?。激活劑的濃度要適中，過(guò)高往往有抑制作用，1~50mM九、激活劑對(duì)酶活性的影響2、簡(jiǎn)單有機(jī)分子的激活作用①還原劑（如Cys、還原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。②金屬螯合劑（EDTA）能去除酶中重金屬離子，解除抑制作用。3、蛋白酶對(duì)酶原的激活酶原可被一些蛋白酶選擇性水解肽鍵而被激活，這些蛋白酶也可看成為激活劑。九、激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響抑制作用(inhibition):

酶的必需基團(tuán)化學(xué)性質(zhì)的改變，但酶未變性，而引起酶活力的降低或喪失。變性作用(denaturation):

由于酶分子的次級(jí)鍵(酶分子結(jié)構(gòu)）受到破壞而使酶活性下降或失活的現(xiàn)象.抑制劑:

不引起酶蛋白變性但能與酶分子的必需基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而引起酶活力的下降甚至喪失,能引起這種酶活力下降或喪失的物質(zhì)叫抑制劑.變性劑:

不專(zhuān)一作用于某一類(lèi)化學(xué)基團(tuán),而只是破壞蛋白分子中次級(jí)鍵的化學(xué)物質(zhì).叫變性劑.失活:

是指酶活力的喪失.變性劑和抑制劑均可使酶失活.十、抑制劑對(duì)酶活性的影響十、抑制劑對(duì)酶活性的影響抑制作用變性作用抑制與變性的結(jié)果是酶失活抑制作用：酶的結(jié)構(gòu)與功能，催化機(jī)制、代謝途徑研究的基本手段，藥物設(shè)計(jì)的理論依據(jù)（一）抑制程度的兩種表示方法相對(duì)活力分?jǐn)?shù)相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)2、抑制率抑制分?jǐn)?shù)抑制百分?jǐn)?shù)1、相對(duì)活力十、抑制劑對(duì)酶活性的影響（二）抑制作用的類(lèi)型不可逆的抑制作用:這一類(lèi)抑制劑通常以比較牢固的共價(jià)鍵與酶蛋白中的基團(tuán)結(jié)合,而使酶分子失活.不能用透析,超濾等物理方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活性.可逆抑制劑作用:這類(lèi)抑制劑與酶蛋白的結(jié)合是可逆的,可用透析,超濾等物理方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活性.競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibition)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(noncompetitiveinhibition)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制(uncompetitiveinhibition)

十、抑制劑對(duì)酶活性的影響（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制抑制劑具有與底物類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，并與酶形成可逆的EI復(fù)合物，阻止底物與酶結(jié)合?？梢酝ㄟ^(guò)增加底物濃度而解除此種抑制。十、抑制劑對(duì)酶活性的影響（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制底物和抑制劑可以同時(shí)與酶結(jié)合，但是，中間的三元復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此，酶的活性降低。抑制劑與酶活性中的以外的基團(tuán)結(jié)合，其結(jié)構(gòu)可能與底物無(wú)關(guān)。不能通過(guò)增加底物的濃度的辦法來(lái)消除非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用某些重金屬離子對(duì)酶的抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+十、抑制劑對(duì)酶活性的影響（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合。E+S→ES+I→ESI≠P常見(jiàn)于多底物的酶促反應(yīng)中十、抑制劑對(duì)酶活性的影響EnzymeInhibition(Mechanism)CompetitiveNon-competitiveUncompetitiveEEDifferentsiteCompeteforactivesiteInhibitorSubstrateCartoonGuideEquationandDescription[I]bindstofree[E]only,andcompeteswith[S];increasing[S]overcomesInhibitionby[I].[I]bindstofree[E]or[ES]complex;Increasing[S]cannotovercome[I]inhibition.[I]bindsto[ES]complexonly,increasing[S]favorstheinhibitionby[I].E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EI

←

↑E+S

→

ES

→

E+P++

I

I↓↓EI

+

S

→EIS

←

↑

↑E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EIS

←

↑X（三）可逆抑制作用動(dòng)力學(xué)十、抑制劑對(duì)酶活性的影響1、競(jìng)爭(zhēng)性抑制：酶濃度恒等:由米氏學(xué)說(shuō):十、抑制劑對(duì)酶活性的影響Vmax不變Km變大，而且隨[I]濃度的增大而增大交于y軸十、抑制劑對(duì)酶活性的影響2、

非競(jìng)爭(zhēng)性抑制抑制程度決定于[I]和Ki，與底物的Km和[S]無(wú)關(guān)動(dòng)力學(xué)方程：十、抑制劑對(duì)酶活性的影響交于x軸Km不變，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）十、抑制劑對(duì)酶活性的影響3、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制Km及Vmax都變小。一組平行直線十、抑制劑對(duì)酶活性的影響動(dòng)力學(xué)方程：抑制程度決定于Km、Ki、[S]、[I]KmEnzymeInhibition(Plots)CompetitiveNon-competitiveUncompetitive

DirectPlotsDoubleReciprocalVmaxVmaxKmKm’[S],mMvo[S],mMvoIIKm[S],mMVmaxIKm’Vmax’Vmax’VmaxunchangedKmincreasedVmaxdecreasedKmunchangedBothVmax&KmdecreasedI1/[S]1/Km1/vo1/

VmaxITwoparallellinesIIntersectatXaxis1/vo1/

Vmax1/[S]1/Km1/[S]1/Km1/

Vmax1/vo

IntersectatYaxis=

Km’（四）一些重要的抑制劑十、抑制劑對(duì)酶活性的影響1、不可逆抑制劑：

(1)非專(zhuān)一性不可逆抑制劑與酶活性中心及活性中心外某一類(lèi)或幾類(lèi)必需基團(tuán)反應(yīng)①有機(jī)磷的?；锒惐柞７―FP）和許多有機(jī)磷農(nóng)藥。抑制機(jī)理：與蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂鍵。強(qiáng)烈抑制乙酰膽堿脂酶（神經(jīng)毒劑）。解毒劑：PAM（解磷定）可以把酶上的磷?；鶊F(tuán)除去。十、抑制劑對(duì)酶活性的影響②有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物

抑制機(jī)理：使酶的巰基(-SH)烷化解毒劑：二巰基丙醇（BAL）、Cys、GS