鎳酶介紹課件

第九章鎳酶第一節(jié)概述第二節(jié)尿素酶及其模擬第三節(jié)氫化酶及其模擬第四節(jié)一氧化碳脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶第五節(jié)超氧化物岐化酶第六節(jié)甲基輔酶M還原酶第一節(jié)鎳及其鎳酶的概述鎳Nickel原子序數(shù)：28，位于過(guò)渡系的中央，主要穩(wěn)定氧化數(shù)+2,能和許多生物學(xué)上感興趣的物質(zhì)相結(jié)合、螯合或鍵合形成配位數(shù)為4、5、6的配合物。地殼中的豐度為0.018%,排在21位。土壤中含量約在40mg/kg，海水中含量3納克/L。物種mg/g(干重）物種mg/g(干重）萵苣3.5±2.9歐芹2.7±1.7合葉子草1.9±1.3玉米1.1±0.5洋白菜1.2±0.8甜菜類1.5±0.6一些植物中的鎳含量Ni的概述

在化學(xué)化工領(lǐng)域，鎳具有獨(dú)特的催化氧化還原作用，在生物體內(nèi)，鎳存在于多種氫化酶中，催化氫的氧化還原反應(yīng)，另一方面，鎳是多種酶的激活源，參與多種酶蛋白的合成。

1855年，F(xiàn)orehhammer首次在植物中找到鎳。1925年Berg、Bertrand和Macheboeuf發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)含鎳。人們很早就猜測(cè)鎳是動(dòng)物(包括人)所必需的微量元素，但由于早期研究對(duì)飲食中金屬量的控制技術(shù)不完善，結(jié)果不可靠，因而未得到肯定的結(jié)論;隨著分析技術(shù)的發(fā)展，到1974年已基本證明了鎳的必需性。

吸煙與肺癌

在香煙中含有49種微量元素，其中含量較高，危險(xiǎn)最大的是鎳和鎘。煙中的鎳能與煙霧中的一氧化碳結(jié)合成為強(qiáng)致癌性的羰基鎳。同時(shí)，煙中鎳及其氧化物對(duì)肺和呼吸道有刺激和損害作用，它們顯然與肺癌，喉癌、舌癌和鼻咽癌等有密切的關(guān)系。許多國(guó)家的肺癌死亡率正在迅速上升。根據(jù)近20個(gè)國(guó)家的資料證明，吸煙是明顯引起肺癌的一個(gè)重要原因。

鎳與鼻咽癌

鼻咽癌在我國(guó)南方人群中發(fā)病率較高。廣東省是世界上突出的鼻咽癌高發(fā)中心。而廣東的鼻咽癌死亡率的分布有非常明顯的地區(qū)性。廣東省地質(zhì)礦產(chǎn)局研究了地質(zhì)地理環(huán)境中微量元素與鼻咽癌死亡率分布的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌高發(fā)區(qū)的河水中的鎳含量比相對(duì)低發(fā)區(qū)高，鎳含量與鼻咽癌死亡率呈正相關(guān)。

鎳可能是白血病致病因素之一!!!

急性和慢性白血病患者血清鎳含量均明顯高于健康人。急性白血病初期便有血清鎳明顯升高，隨著病情進(jìn)展而持續(xù)增高，當(dāng)病情緩解時(shí)則明顯降低。血清鎳含量與慢性白血病的病情變化始終呈正相關(guān)。急性白血病血清鎳升高比慢性白血病更明顯，且血清鎳含量過(guò)高的患者生存時(shí)間較短，提示鎳可能是急性白血病的促發(fā)因素。血清鎳測(cè)定可作為急性白血病病因診斷輔助指標(biāo)并可作為病情嚴(yán)重程度及預(yù)后判斷指標(biāo)。鎳在動(dòng)物體內(nèi)的主要作用

鎳的生物功能主要是參與代謝及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。鎳具有刺激生血機(jī)能的作用，能促進(jìn)紅細(xì)胞的再生，也發(fā)現(xiàn)鎳對(duì)凝血過(guò)程中易變因子的穩(wěn)定性也有一定的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，鎳大量存在于DNA和RNA中，其作用可能是通過(guò)與DNA中的磷酸酯結(jié)合，使DNA結(jié)構(gòu)處于穩(wěn)定狀態(tài)，影響DAN的合成，RNA的復(fù)制及其它蛋白質(zhì)的合成。鎳在植物中的主要作用

鎳最明確的生物功能是在脲酶中的作用。脲酶存在于許多植物、藻類、真菌及細(xì)菌中。脲酶種類繁多，都含有鎳，但含鎳的數(shù)量互相有差異。Ni的生物功能早在1975年就引起了人們的廣泛關(guān)注，因?yàn)楫?dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)尿素酶的活性中心含有Ni，自然界選擇鎳作為酶的活性中心非常令人驚奇，因?yàn)閆n是比Ni更能好的Lewis酸，而Fe和Cu的單電子氧化還原在生物學(xué)中也極為普遍。在大氣中O2變得豐富以前，許多過(guò)渡金屬都以硫化物的形式存在，而在這些過(guò)渡金屬硫化物中NiS更可溶，這也許是自然界選擇鎳作為酶的活性中心的原因之一。1926年就結(jié)晶分離出尿素酶，但50年之后人們才通過(guò)分光技術(shù)測(cè)得酶活性中心二價(jià)Ni的存在。此后又有一系列含鎳的酶被發(fā)現(xiàn)，下面僅簡(jiǎn)要介紹幾種常見(jiàn)的鎳酶：①尿素酶;②氫化酶;③一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合成酶;④甲基輔酶M還原酶;⑤鎳超氧化歧化酶Activesiteofurease

Ni2:

Ni-Ni(3.5?);Ni1:2His,1Lys(bridge);Ni2:2His,1Lys(bridge),1Asp;

1995，Unclear

1999，rightStructure，1999,7:205–216Bacilluspasteuriiureaseisatrimeroftrimers

Hydrolysismechanismofurea乙酰氧肟酸乙酰氧肟酸

脲酶抑制劑

脲酶抑制劑是指能夠直接或間接抑制脲酶活性的一類物質(zhì)，大體上可分為天然和人工合成兩大類，目前使用較多的屬人工合成的有機(jī)化合物。常用的有乙酰氧肟酸（AcetohydroxamicacidAHA）和辛酰氧肟酸（CaprylohydroxamicacidCHA），其中AHA是目前認(rèn)為最有效的一種脲酶抑制劑，國(guó)內(nèi)外已有工業(yè)化合成AHA的成熟技術(shù)，我國(guó)已批準(zhǔn)AHA作為飼料添加劑使用。在目前家畜的營(yíng)養(yǎng)中，蛋白質(zhì)是最短缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。由于反芻動(dòng)物能利用非蛋白氮（NPN）合成微生物蛋白（MCP）供機(jī)體利用，因此尿素可用作反芻動(dòng)物的蛋白質(zhì)資源。但尿素在瘤胃內(nèi)的分解速度很快，極大地限制了反芻動(dòng)物對(duì)其的利用，為提高尿素等NPN的利用率，國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了大量工作。通過(guò)使用脲酶抑制劑，延緩尿素的釋放，提高其利用率以充分利用氮源。為什么使用脲酶抑制劑？第一，添加尿素可代替部分價(jià)格較貴的餅粕類蛋白質(zhì)飼料，節(jié)約了蛋白質(zhì)飼料，降低飼料成本。脲酶抑制劑的使用可提高尿素的利用率。第二，即使日糧中不含尿素，使用脲酶抑制劑，同樣具有增加微生物蛋白質(zhì)合成量，節(jié)約蛋白質(zhì)飼料的效果。這是因?yàn)榧s80％的蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)降解成氨，同樣也受脲酶催化，而瘤胃微生物利用氨的速度相對(duì)較慢，導(dǎo)致兩種速度不協(xié)調(diào)而使大量氨不能被微生物利用造成氮源浪費(fèi)。第三，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，脲酶抑制劑的使用同樣可提高植物對(duì)尿素的利用率。脲酶抑制劑的種類及其抑制機(jī)理1.1氧肟酸類化合物1.2二胺、三胺類化合物1.3重金屬類1.4絲蘭提取物1.5醌類化合物1.6異位酸類化合物1.7多聚甲醛大體分為兩個(gè)途徑：一是使脲酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而使脲酶變性失活，此類抑制劑包括重金屬鹽類和多聚甲醛；二是與脲酶的活性中心相結(jié)合，使之失活，從而達(dá)到控制氨氣釋放的作用。尿酶的模擬尿素酶的模型化合物已有不少報(bào)道，雖然從羧酸根橋連雙核鎳結(jié)構(gòu)特征來(lái)看與活性中心的結(jié)構(gòu)相似，但在生物催化功能方面仍有很大差距，這方面的工作仍有很大空間。兩個(gè)尿素酶模擬物的結(jié)構(gòu)：[Ni2(OAc)2(tmen)2](OTf)[Ni2(Hshi)(H2shi)(Py4)(OAc)]第三節(jié)氫化酶(hydrogenase)1931年，Stephenson和Stickland首先發(fā)現(xiàn)了氫化酶。它們廣泛存在于原核生物及低等真核生物體內(nèi)。其催化作用是可逆分裂和重組氫分子。氫化酶自20世紀(jì)70年代以來(lái)就引起科學(xué)家的高度重視。酶的模擬工作寄希望于得到燃料細(xì)胞（電池），或利用類似的功能模型化合物通過(guò)光的作用產(chǎn)生氫能源。因此對(duì)這類酶活性中心結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理方面的研究一開始就引起廣泛關(guān)注。各種氫化酶在它們的蛋白結(jié)構(gòu)和所利用的電子載體的種類（如鐵氧化還原蛋白，紅素氧化蛋白和奎寧等）上有著很大的差異。目前發(fā)現(xiàn)的氫化酶有：NiFeSe，NiFe，F(xiàn)eonlyandMetalfree其中對(duì)鎳鐵氫化酶研究的最為深入。鎳鐵氫化酶

四類氫化酶中NiFe氫化酶的研究最為廣泛和深入。迄今為止其活性中心結(jié)構(gòu)已基本弄清楚，對(duì)其催化機(jī)理也提出很多合理方案，但還有待進(jìn)一步確證。在化學(xué)模擬方面，雖做了大量研究，也取得了很多成果，但要達(dá)到利用類似結(jié)構(gòu)的功能模擬配合物通過(guò)光作用產(chǎn)生氫能源H2的目的，還有很長(zhǎng)的路要走。這一節(jié)將主要介紹國(guó)際上對(duì)NiFe氫化酶的活性中心結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及化學(xué)模擬研究的一些成果。CoordinationChemistryReviews249(2005)1609

鎳鐵氫化酶為異二聚酶，兩個(gè)亞基緊密相連形成一個(gè)近乎球星的分子。較大的亞基含有兩個(gè)Cys-X-X-Cys氨基酸序列，一個(gè)在N端附近，另一個(gè)在C端附近,都含有Cys并與活性中心成鍵;而較小的亞基是鐵蛋白類物質(zhì)，含有幾種在排列上非常適合構(gòu)成Fe/S簇的半胱氨酸殘基序列。小亞基有三個(gè)不同的類型的Fe/S簇，它們呈線性排列，相距1.2nm，遠(yuǎn)端為Fe4S4簇，中間為Fe3S4簇，近端為Fe4S4簇，距鎳中心1.3nm。Fe/S簇和活性中心的位置顯示在活性中心和小亞基表面有一個(gè)易于電子運(yùn)輸?shù)耐ǖ?。NiFe活性中心在大亞基上，也含有鐵離子簇。Ni-Fe相距0.29nm,兩個(gè)Cys通過(guò)硫橋連兩個(gè)金屬。另外，O2

或H2O所提供的氧原子作為橋連配體的可能性也是存在的。Nickel-ironhydrogenasestructure

[Fe4S4]dist=bottom,[Fe3S4]=middle,[Fe4S4]prox=top,Ni-Fecentre=toprightX=SorO;Y=OorNSpeciesNiterminalligandsNi-FebridgingligandsFeterminalligandsDesulfovibriogigasS

(Cys-65,Cys-530)S

(Cys-68,Cys-533);O;(Hˉ)CO,CNˉ,·NO,N2orCCHˉDesulfovibriovulgarisMiyazakiS

(Cys-81,Cys-546)S

(Cys-84,Cys-549);SorO;(Hˉ)L1=SO;L2,L3=COorCNˉSchematicshowingthereactionofhydrogenandoxygenwithinahydrogenasemolecule.Thestudyofgaspathwaysinproteinscouldbeimportantforfutureapplicationsinareassuchasrenewableenergysources,butitiscurrentlynotwellunderstoodandrequirestheanalysisoflargenumbersofproteins.Howarethereadyandunreadystatesofnickel-ironhydrogenaseactivatedbyH2?Phys.Chem.Chem.Phys.,2006,

8,4086-4094

FeFe

hydrogenase

SynthesisoftheH-clusterframeworkofiron-onlyhydrogenase,Nature,2005,433,610

第四節(jié)一氧化碳脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶

一氧化碳脫氫酶(CODH)實(shí)際上有兩種類型：一種含有一氧化碳脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶(ACS)兩種亞基，雖然兩個(gè)亞基可以分開，但分開的ACS亞基不具有活性；另一種只含有CODH亞基。一氧化碳脫氫酶催化CO的雙電子氧化還原反應(yīng)：

CO+H2OCO2+2H++2e

對(duì)于這種酶的，Ni不是必需的。需氧微生物使用一種含有Mo,Fe和黃素的酶在呼吸時(shí)氧化CO，而厭氧微生物則利用含有Ni和Fe/S簇的酶去氧化CO。產(chǎn)乙酸菌利用CO和一種提供甲基的化合物(CH3CoFeSP)及輔酶A去合成乙酰輔酶A。

CH3-CoFeSP+CO+CoAacetyl-CoA+CoFeSP

需氧細(xì)菌中的一氧化碳脫氫酶是一類含鉬（Mo）金屬蛋白，需氧細(xì)菌利用它們?cè)诤粑饔弥醒趸谎趸紒?lái)獲得能量。而在厭氧微生物，包括厭氧細(xì)菌和古菌中，其屬于含鎳（Ni）金屬蛋白，在不同種屬的微生物中發(fā)揮著不同的作用。特別在厭氧微生物固定一氧化碳和二氧化碳的Wood-Ljungdahl代謝途徑中，一氧化碳脫氫酶可以與乙酰輔酶A合成酶（同為鎳蛋白）結(jié)合形成雙功能酶，共同發(fā)揮作用，將一氧化碳和二氧化碳轉(zhuǎn)化為重要的代謝中間物乙酰輔酶A。

由于一氧化碳脫氫酶能夠高效地催化對(duì)動(dòng)物和人體有很高毒性的一氧化碳氧化為二氧化碳，因此對(duì)于其催化機(jī)理的研究有助于治理環(huán)境中的一氧化碳污染。

Ni-CODH廣泛存在于以一氧化碳為碳源和能源的厭氧微生物中，如乙酸生成細(xì)菌（acetogenicbacteria）、光養(yǎng)細(xì)菌（phototrophicbacteria）、氫氣生成細(xì)菌（hydrogenogenicbacteria）、硫酸還原細(xì)菌和古菌（sulfate-reducingbacteriaandarchaea）以及甲烷生成古菌（methangenicarchaea）。

不同來(lái)源的Ni-CODH差別很大：既有單功能的一氧化碳脫氫酶只負(fù)責(zé)催化CO的氧化；又有雙功能酶，即同時(shí)具有一氧化碳脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶（ACS）的活性，生理狀態(tài)下需要Ni-CODH與ACS結(jié)合共同發(fā)揮功能。因此，又常常以CODH/ACS復(fù)合物的名稱來(lái)代替Ni-CODH。與Mo-CODH相似的是，CODH/ACS也需要形成二聚體來(lái)發(fā)揮催化作用。

從熱醋酸棱菌中提純得到的一氧化碳脫氫酶研究得較為清楚，它包括有6個(gè)鎳離子，三個(gè)鋅離子、32～40個(gè)鐵和硫化物硫原子。一氧化碳脫氫酶是從甲烷菌和醋酸菌中兩個(gè)碳碎片合成乙酰輔酶A的關(guān)鍵催化劑，這種酶也是醋酸營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中醋酸酯碎片降解作用過(guò)程的中心，這一過(guò)程到CH4和CO2終止。ACSisolatedfromM.thermoaceticaisa310kDa*α2β2tetramer(itismadeoffourstrandsofprotein:twoidenticalstrandscalled'alpha'andtwocalled'beta').

Eachαβdimercontainsthreemetal-sulfurclusterscalledA,B,andC.

TheA-clusterislocatedinthe81kDaαsubunitwhiletheB-andC-clustersarefoundinthe71kDaβsubunit.一氧化碳脫氫酶(CODH)一氧化碳脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)分析表明，它是有兩個(gè)完全相同的相互纏繞的亞基共價(jià)連接而成。每個(gè)亞單位都含有Ni,Fe和S組成的雜金屬簇(C簇)，整個(gè)酶分子呈蘑菇狀。在C簇中，一個(gè)鎳原子，四個(gè)鐵原子和五個(gè)易變的硫原子排列為不對(duì)稱的[Ni-4Fe-5S]簇。C簇中的金屬離子與五個(gè)半胱氨酸殘(Cys295,Cys333,Cys446,Cys476,Cys526)和一個(gè)組氨酸殘基(His261)通過(guò)共價(jià)鍵相連。所有的鐵原子都與硫原子形成四面體配位方式，鎳與四個(gè)硫原子配位通過(guò)μ2-S和μ3-S與鐵橋連。鎳中心為畸變平面四方形配位方式。第五節(jié)鎳超氧化物歧化酶Ni-SOD主要從各種細(xì)菌中分離得到。Ni-SOD與其他SOD的主要區(qū)別在于氨基酸組成上的不同。它除了含有大量的甘氨酸外，半胱氨酸殘基也有所不同。

Ni是催化超氧化物歧化反應(yīng)的中心，如果將Ni從酶中除去，酶蛋白只剩下了殘基活性。NiSOD的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)報(bào)道。其中6個(gè)螺旋束以頭尾-頭尾的形式