脲酶的測定方法

一、脲酶測定（比色法）脲酶是對尿素轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用的酶，它的酶促反應(yīng)產(chǎn)物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用來表示土壤供氮能力。1、試劑配制：（1）pH6.7檸檬酸鹽溶液：取368g檸檬酸溶于600mL蒸餾水中，另取295g氫氧化鉀溶于水，再將兩種溶液合并，用1N氫氧化鈉將pH調(diào)至6.7，并用水稀釋至2L。（2）苯酚鈉溶液：稱取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀釋至100mL（A液），保存再冰箱中。稱取27g氫氧化鈉溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B兩液各20mL混和，并用蒸餾水稀釋至100mL備用。（3）次氯酸鈉溶液：用水稀釋制劑至活性氯的濃度為0.9%,（1.9g次氯酸鈉溶于1L水中）溶液穩(wěn)定。（4）10%尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。（5）N的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水稀釋至1L，則得1mL含0.1mgN的標(biāo)液，再將此液稀釋10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。2、操作步驟稱取5g土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯處理,加塞塞緊輕搖15min;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的檸檬酸鹽緩沖液（pH6.7）,仔細(xì)混勻。在37°C恒溫箱中培養(yǎng)24h。然后用熱至38°C的蒸餾水稀釋至刻度（甲苯應(yīng)浮在刻度以上），搖蕩，將懸液過濾。取濾液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至10mL,然后加入4mL苯酚鈉溶液,并立即加入3mL次氯酸鈉溶液，加入每一試劑后，立即將混合物搖勻,20min后，將混合物稀釋至刻度,在波長578nm處測定吸光值。服酶活性以樣品所得的吸光值減去對照樣品吸光值之差，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出氨態(tài)氮量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸餾水至20mL，再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，20min后顯色，定容。1h內(nèi)再分光光度計上于578nm處比色。3、結(jié)果計算

以24小時后1g土壤中NH3-N的質(zhì)量（mg）表示脲酶活性（Ure）Ure=a?V,n/m式中:a為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的N^-N濃度（mg/mL）；V為顯色液體積（50mL）；n為分取倍數(shù)；m為烘干土重（g）。補充：1）1h內(nèi)在（（青定）酚的藍色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）在分光光度計上用1cm液槽，于578nm處將顯色液進行比色測定。2）無土對照：不加土樣，其他操作與樣品實驗相同。以檢驗試劑純度，整個實驗設(shè)置一個對照3）無基質(zhì)對照：以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同。每個土樣都設(shè)此對照。過氧化氫酶測定（容量法）過氧化氫酶也叫接觸酶，能促進過氧化氫對各種化合物的氧化。幾乎在所有的生物體內(nèi)部有過氧化氫酶，在某些細(xì)菌里，其數(shù)量約為細(xì)胞干重的1%。土壤的過氧化氫酶活性，與土壤呼吸強度和土壤微生物活動相關(guān)，在一定程度上反映了土壤微生物學(xué)過程的強度。原理過氧化氫酶的測定有測壓法和滴定法。測壓法是測定過氧化氫分解時析出的氧量（反應(yīng)式為：h2o2+h2o過氧化氫酶o2+h2O,方法簡單，但準(zhǔn)確性較差。后者則是定量滴定酶促反應(yīng)后剩余的過氧化氫量，反應(yīng)式為2KMnO4+5H2O2+3H2SO4>2MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2，此法測定結(jié)果較好。試劑（1）0.3%H2O2:按1：100將30%的H2O2用水稀釋。（2）3NH2SO4（也就是1.5mol/lH2SO4）:以配1000ml為例，需要的濃硫酸的體積為1.5*98.08/1.83=80.39ml，可以取80ml。KMnO4的分子量=158.026，當(dāng)量=31.605.高錳酸鉀水溶液受到水中還原物和雜質(zhì)以及受

日光直射等影響能分解析出棕色的含水的二氧化錳沉淀，而有濃度的改變。因此在配制其標(biāo)準(zhǔn)溶液時必須使用棕色瓶盛裝，以防日光直射作用.配制后并應(yīng)放置一段時間，待與水中還原物完全作用后，濾去沉淀，然后進行標(biāo)定，才能得到基本穩(wěn)定不易變化的標(biāo)準(zhǔn)溶液。(3)0.1NKMnO4溶液：稱取化學(xué)純高錳酸鉀3.161克，溶于l升無CO2蒸餾水(沸水)中，溶解后，在暗處放置一周，然后用虹吸管將上部澄清溶液移于棕色瓶中(或用玻璃棉濾過)保存，以備標(biāo)定.注：C(1/5KMnO4)=0.1mol/l表示的就是0.1NKMnO4溶液。0.1NKMnO4溶液標(biāo)定(GB/T601-2002)稱取0.2g(準(zhǔn)至0.0001g)于105?110°C烘至恒重的基準(zhǔn)草酸鈉。溶于100mL(8+92)硫酸溶液中，用配制好的高錳酸鉀溶液[(1/5KMnO4)=0.1mol/l]滴定，近終點時加熱至65C，繼續(xù)滴定至溶液呈粉紅色保持30s，同時作空白試驗(不加草酸鈉，其他一樣)。高鎰酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)濃度按下式計算c(1/5KMnO4)=m*1000/[(V1-V2)*M]式中c(1/5KMnO4)一高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液之物質(zhì)的量濃度，mol/L；m——草酸鈉之質(zhì)量，g;V1—一滴定草酸鈉消耗的高錳酸鉀溶液之用量，mL；V2——空白試驗用高錳酸鉀溶液之用量，mL；M——草酸鈉的摩爾質(zhì)量的數(shù)值,單位為(g/mol)，[M(1/2Na2C2O4)=66.999]或者c(1/5KMnO4)=m/(V1-V2)*0.067000.06700——與1.00mL高錳酸鉀溶液c(1/5KMnO4)=0.1mol/1相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜牟菟徕c的質(zhì)量。操作步驟：取2.0g土，置于100mL(或150ml)三角瓶中，并注入40mL蒸餾水和5mL0.3%H2O2溶液。(B)同時設(shè)置對照，即三角瓶中注入40mL蒸餾水和5mL0.3%過氧化氫溶液，而不加土樣。(A)將三角瓶放在往返式振蕩機上120r/min振蕩20min后，加入5mL3N硫酸，以穩(wěn)定未分解的過氧化氫。再將瓶中懸液用慢速濾紙過濾。吸取25mL濾液，用0.1NKMnO4滴定至淡粉紅色終點。結(jié)果計算用于滴定土壤濾液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為B,用于滴定25mL原始的過氧化氫混合液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為A。以20min后1g土壤消耗的0.1NKMnO4溶液的毫升數(shù)表示（以20min后1g土壤中的過氧化氫的毫克數(shù)表示？）。土壤過氧化氫酶活性=（A-B）XT/dwt式中，T——為高錳酸鉀滴定度的校正值。dwt烘干土質(zhì)量（g）滴定度：分析化學(xué)專屬名詞單位：g/ml、mg/ml表示符號：Ts：每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含滴定劑（溶質(zhì)）的克數(shù)。例如：THci=0.001012g/ml的HCl溶液，表示每毫升此溶液含有0.001012g純HCl。Ts/x:指每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于的待測組分的質(zhì)量。S：代表滴定劑（標(biāo)準(zhǔn)溶液）的化學(xué)式。X：代表被測物的化學(xué)式。例如：THCl/Na2CO3=0.005316g/mlHCl溶液，表示每毫升此HCl溶液相當(dāng)于0.005316gNa2Co3。例：用T（EDTA/CaO）=0.5mg/ml的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定含鈣離子的待測溶液，消耗了5ml,則待測溶液中共有CaO2.5mg。計算方法：T=n*M/V或T=C*M土壤蔗糖酶活性測定（3,5-二硝基水楊酸比色法）一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性，如與土壤有機質(zhì)、氮、磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強度有關(guān)，一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）酶促反應(yīng)試劑：基質(zhì)8%蔗糖，pH5.5磷酸緩沖液：1/15M磷酸氫二鈉（11.876gNa2HPO4-2H2O溶于1L蒸餾水中）0.5ml加1/15M磷酸二氫鉀（9.078gKH2PO4溶于1L蒸餾水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL）預(yù)先將分析純葡萄糖置80°C烘箱內(nèi)約12小時。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻(冰箱中4°C保存期約一星期)。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。3)3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS試劑)稱0.5g二硝基水楊酸，溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋定容至100ml(保存期不過7天)。三、操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別吸1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于試管中，再補加蒸餾水至1mL，加DNS試劑1mL混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min(從試管放入重新沸騰時算起)取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長508nm處比色，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。土壤蔗糖酶測定稱取1g土壤，置于50mL三角瓶中，注入3ml8%蔗糖溶液，1mlpH5.5磷酸緩沖液和200uL甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37C下培養(yǎng)24h。到時取出，迅速過濾。從中吸取濾液1ml，注入50ml容量瓶中，加1mlDNS試劑，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min，隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸餾水稀釋至7ml，并在分光光度計上于508nm處進行比色。為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無基質(zhì)對照，整個試驗需做無土壤對照；如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。四、結(jié)果計算：蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性=(a樣品一a無土一a無基質(zhì))Xn/ma樣品、a無土、a無機質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)；n為分取倍數(shù)；土壤多酚氧化酶活力的測定試劑配制1%鄰苯三酚溶液乙醚0.5N鹽酸（4）重銘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液——0.75g重銘酸鉀溶于1升0.5NHCl（相當(dāng)于50mI醚中含5mg紫色沒食子素）（5）pH4.5檸檬酸——磷酸緩沖液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取重銘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.5NHCI稀釋成各種不同濃度。定容后，在分光光度計上于430nm處比色測定。以光密度位為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。投作步驟取1g土樣（過0.25mm篩），置于50ml三角瓶中，然后注入10ml1%鄰苯三酚溶液，將瓶內(nèi)含物搖蕩后放在30度恒溫掐小培養(yǎng)2h。取出后加4mlpH4.5檸檬酸——磷酸緩沖液，再加35ml乙醚，用力搖蕩數(shù)次，萃取30min。最后，將含溶解的紫色沒食子素的著色乙醚相進行比色。比色時用波長為430nm的濾光片。為防止因乙醚引起的誤差，每比色一次用元水乙醇洗滌比色液槽一次。為了消除土壤中原有的醚溶性有機物質(zhì)而引起的誤差及校正。沒食子酚的純度，需設(shè)無基質(zhì)的土壤和無土壤的基質(zhì)作對照。在無基質(zhì)的土壤的對照中，用水代替基質(zhì)進行培養(yǎng)。活性表示紫色沒食子索的量，根據(jù)用重銘酸鉀繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查知。多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色沒食子素的毫克數(shù)表示。纖維素酶活性測定一、試劑：1）醋酸緩沖液（pH5.5）：164.08g無水醋酸鈉（C2H3O2Na）溶于700ml去離子水，用醋酸（C2H4O2）調(diào)節(jié)pH至5.5，用去離子水稀釋至1L。2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7g羧甲基纖維素鈉鹽溶于1L醋酸緩沖液，45°C下攪拌2h，此溶液在4C下可存放7天。3）還原糖試劑：試劑A：16g無水碳酸鈉（Na2CO3）和0.9g氰化鉀（KCN）溶于去離子水并稀釋至1L。試劑B：0.5g六氰鐵鉀（K4Fe（CN）6）溶于去離子水并稀釋至1L，貯于棕色瓶中。試劑C：1.5g硫酸鐵銨（NH4SO4Fe2（SO4）2?H2O）、1g十二烷基硫酸鈉（C12H2sO4SNa）和4.2ml濃硫酸溶于50°C去離子水，冷卻后稀釋至1L。4)水合葡萄糖溶液：28mg水合葡萄糖溶于少量去離子水中，并定容至1L。二、儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱，水浴鍋，分光光度計，攪拌器，三角瓶三、操作步驟取10.00g(耕地)或5.00g(林地)新鮮土壤(V2mm)于100ml三角瓶中，加15ml醋酸緩沖液和15mlCMC溶液，蓋上塞子，于50C下培養(yǎng)24h，過濾。同時做空白對照，但在培養(yǎng)結(jié)束時才加入15mlCMC溶液，并迅速過濾。取2.00ml濾液于50ml容量瓶中，并用去離子水定容至刻度。吸取2.00ml稀釋液于20ml試管中，加2.00ml還原糖試劑A和2.00ml還原糖試劑B，蓋緊混勻，在100C水浴中加熱15min后，立即至于20C水中冷卻5min。加10.00ml還原糖試劑C，混勻，20C下靜置顯色60min，于690nm波長處比色測定(要求在30min內(nèi)完成)。標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0ml水合葡萄糖溶液，用去離子水稀釋至2ml，同上加入還原糖試劑A、B、C后，比色測定還原糖含量。c)空白：無土空白：不加土樣，其余操作與樣品試驗相同，整個試驗設(shè)置一個，重復(fù)一次。無基質(zhì)空白：以等體積水代替基質(zhì)，每個土樣設(shè)置一個。四、結(jié)果計算土壤纖維素酶活性(gg-g-1-(24h)-1)=(C*V*f)/dwt式中C為樣品的葡萄糖含量(gg-ml-1)；V為土壤溶液體積(30ml)；f為稀釋倍數(shù)(25)；dwt為烘干土壤質(zhì)量(g)五、注意事項此