淺析信號肽課件

編寫：張浩周丹2011.9月信析淺肽號EndoplasmicreticulumsecretionGolgicomplexCellmembrane不同類型蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)合成后如何轉(zhuǎn)運到應(yīng)該去的部位?

信號斑信號肽分選信號引導(dǎo)蛋白質(zhì)到達(dá)正確的地點

信號肽研究背景1結(jié)構(gòu)及作用機理2信號肽捕獲系統(tǒng)3應(yīng)用實例45展望背景發(fā)現(xiàn)探索延伸

1972年Milstein等發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白IgG輕鏈的前體要比成熟的IgG在N-端多20氨基酸。他們推測這20個氨基酸可能和其通過ER進(jìn)而分泌有關(guān)

Blobel從內(nèi)分泌性蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運入手研究蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的機制,發(fā)現(xiàn)了3條重要線索:1.被轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)的初生肽(即其前身物)比成熟肽大

被轉(zhuǎn)運的分泌性蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程與其生物合成的過程是平行進(jìn)行的

3.信號肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)被切除。信號假說(signalhypothesis)

信號假說信號肽的發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)了“信號識別蛋白”1999年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎

信號肽之父背景信號肽序列的特點（1）一般帶有10-15個疏水氨基酸；（2）在靠近該序列N-端常常有1個或數(shù)個帶正電荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位點處常常帶有數(shù)個極性氨基酸，離切割位點最近的那個氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（丙氨酸或甘氨酸）。信號肽研究背景1結(jié)構(gòu)及作用機理2信號肽捕獲系統(tǒng)3應(yīng)用實例45展望信號肽捕獲系統(tǒng)酵母細(xì)胞篩選系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞篩選系統(tǒng)基因組DNA文庫篩選方法使用文庫免疫反應(yīng):Tac-SST酶活性細(xì)胞生死;SST-REXcDNA文庫sue2-SST系統(tǒng)分類酵母細(xì)胞篩選系統(tǒng)(Y-SST):sue2-SST用sue2作為報道基因構(gòu)建粘粒載λRK18，插入胚胎cDNA文庫后轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞YT455，用蔗糖進(jìn)行篩選。由于酵母YT455在蔗糖培養(yǎng)基中生長依賴于sue2基因編碼的蔗糖轉(zhuǎn)換酶向細(xì)胞外的分泌，所以篩選的指標(biāo)是：酵母的存活與否。信號肽捕獲系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞篩選系統(tǒng)(M-SST):Tac-SST信號肽捕獲系統(tǒng)該系統(tǒng)以人IL一2RoL(hTac)為報道基因構(gòu)建信號肽篩選載體。其基本原理是，將待篩選的cDNA片段與hTac(信號肽序列已被去除)的5’端相連，得到的表達(dá)載體文庫轉(zhuǎn)染COS-7，然后用抗Tac抗體鑒定能夠?qū)Tac表達(dá)在細(xì)胞膜表面的克隆，從陽性克隆中得到插入的cDNA片段，理論上這些cDNA片段是能夠編碼信號肽的，這樣就實現(xiàn)了對分泌蛋白質(zhì)的篩選。哺乳動物細(xì)胞篩選系統(tǒng)(M-SST):SST-REX該系統(tǒng)利用一種生長依賴IL-3存在的細(xì)胞系一Ba／F3進(jìn)行篩選。由于篩選是在哺乳動物細(xì)胞而不是酵母細(xì)胞中進(jìn)行，所以得到的信號肽的數(shù)量和可信度相對于suc2-SST要更高。該系統(tǒng)是目前從cDNA文庫中篩選信號肽編碼序列最好的系統(tǒng).信號肽捕獲系統(tǒng)信號肽研究背景1結(jié)構(gòu)及作用機理2信號肽捕獲系統(tǒng)3應(yīng)用實例45展望pBE-SDNA(5,938bp)pUBoriKanrColE1oriAmpraprEpromoteraprESPMulticloningsite（MCS）His-Tag目的基因?qū)⒛康幕虿迦雙BE-SDNA中MluIEco52I雙酶切將Plasmid線形化

MluIEco52I使用In-Fusion反應(yīng)插入SPDNAmixtureSP轉(zhuǎn)染E.coliHST08E.ColiCell37℃ONE.ColiCellE.ColiCellE.ColiCellE.ColiCellE.ColiCellE.ColiCellE.ColiCellE.ColiCell0.5ml50ulLB培養(yǎng)基制備B.subtilis感受態(tài)細(xì)胞宿主菌株37℃16hrLB培養(yǎng)液2mL37℃16hr150-180rpmLB培養(yǎng)液2mLSPImudium5mLSPIImudium4.5mL37℃90min90-100rpm37℃170-180rpm50ul100mMEGTA5-10min37℃90-100rpm熒光法底物：4-甲基傘形酮Barush和Swiain法底物：水楊苷比色法底物：對硝基苯基β-D-葡萄糖苷……β-糖苷酶：可以使糖苷或寡糖的糖苷鍵水解新比色法底物：京尼平苷β-糖苷酶的活性測定隨機選取470個克隆的培養(yǎng)上清進(jìn)行β-糖苷酶的活性測定根據(jù)活性測定結(jié)果，挑選24個菌落進(jìn)行精制，測序，結(jié)果表