細(xì)胞分離課件

細(xì)胞與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離

SeparationofCell&Organelles北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)系李莉

生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究一般涉及：

整體、器官、組織、細(xì)胞、細(xì)胞器及分子水平。 其中，細(xì)胞、細(xì)胞器及分子水平的研究，均需分離細(xì)胞或細(xì)胞器。

一、從動(dòng)物組織游離細(xì)胞一)步驟二)方法1、非酶法2、酶法二、細(xì)胞器的游離內(nèi) 容一、從動(dòng)物組織游離細(xì)胞

細(xì)胞的微環(huán)境:細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)Nocellslivesinisolation.Celljunction,celladhension.

細(xì)胞連接的功能分類封閉連接(occludingjunctions) 緊密連接(tightjunction)

錨定連接(anchoringjunctions)

通訊連接(communicatingjunctions) 間隙連接(gapjunction)； 神經(jīng)細(xì)胞間的化學(xué)突觸(chemicalsynapse)；

細(xì)胞粘附與細(xì)胞粘附分子細(xì)胞粘附（或細(xì)胞粘合，Celladhesion)：細(xì)胞通過(guò)其表面的粘附分子與其它細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生的特異相互作用（細(xì)胞連接的概念著重有穩(wěn)定的形態(tài)特征）。細(xì)胞粘附分子(Celladhesionmolecules,CAM):

介導(dǎo)細(xì)胞粘附的細(xì)胞表面分子。為跨膜糖蛋白，由較大的胞外域、疏水的跨膜區(qū)及短小的胞內(nèi)域構(gòu)成。細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)細(xì)胞的識(shí)別與粘附，維系粘合連接，并通過(guò)參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、行為和功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。機(jī)體的各種組織和器官都是由細(xì)胞與ECM共同組成的；ECM是機(jī)體發(fā)育過(guò)程中由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的各種大分子，常在細(xì)胞的周圍構(gòu)成高度水合的凝膠或纖維性網(wǎng)絡(luò)；ECM對(duì)細(xì)胞不僅起著支持、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)作用，而且對(duì)細(xì)胞的分裂、分化、識(shí)別、黏著、運(yùn)動(dòng)遷移、細(xì)胞通訊以及基因的表達(dá)等都有重要作用；ECM還與許多病理過(guò)程有關(guān)，例如創(chuàng)傷的修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移、老年病、膠原病、心血管病、骨關(guān)節(jié)病及糖尿病等。ECMECM結(jié)構(gòu)示意圖

一、從動(dòng)物組織游離細(xì)胞媒介：二價(jià)陽(yáng)離子(尤其是Ca2+，如橋粒的中央層)；大分子(如糖蛋白和蛋白聚糖)不同組織具有不同的細(xì)胞間質(zhì)成分，不同組織中，參與細(xì)胞粘合與細(xì)胞連接的大分子成分也各不相同，所以，在游離細(xì)胞時(shí)，不同組織的細(xì)胞對(duì)不同試劑和不同方法具有不同的敏感性。------游離技術(shù)復(fù)雜，游離方法多樣。

有時(shí)，同一種組織可用不同的方法游離出單個(gè)細(xì)胞，但所獲得的細(xì)胞在表明性質(zhì)、激素反應(yīng)狀態(tài)及物質(zhì)和能量代謝上可能各有不同。------應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇游離方法。游離方法成功-----細(xì)胞活率與產(chǎn)量均高，并盡可能地保留細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的完整性。

注意游離條件：1、游離劑的種類2、游離劑的濃度與作用時(shí)間3、緩沖液的成分4、pH5、溶液的滲透壓與鹽成分6、酶終止劑對(duì)不同動(dòng)物、不同組織或不同年齡的組織，有時(shí)游離方法不能通用。

一)步驟1、用利剪剪碎組織或切成0.3~0.4mm的薄片，必要時(shí)勻漿。------組織塊應(yīng)盡量細(xì)小，保證細(xì)胞的供氧。2、用游離劑處理，破壞細(xì)胞之間及細(xì)胞與ECM之間的聯(lián)系------在組織與游離劑保溫前，保持低溫以降低氧的消耗；選用適當(dāng)直徑的容器，以便液面的高度適宜，利于組織塊的氧供給。

二)游離細(xì)胞的方法1、非酶法------較溫和1)螯合劑(chelatingagent)----常用于游離 上皮組織細(xì)胞常用：EDTA(依地酸)---結(jié)合Ca2+，Mg2+ EGTA（依他酸）---結(jié)合Ca2+的能力與EDTA 相似，但在中性或堿性條件下結(jié)合Mg2+的能力大大小于EDTA。

去除Ca2+，Mg2+-----EDTA

去Ca2+留Mg2+-----EGTA

2)甘氨酸(glycine)-----可與EDTA聯(lián)合應(yīng)用。3)糖類(saccharide)----細(xì)胞表面的凝集素可識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞粘合分子和細(xì)胞連接分子的糖鏈結(jié)構(gòu)，這種作用能被相應(yīng)的單糖、雙糖或寡糖所抑制。4)升高pH----改變細(xì)胞表面電荷如，胚胎組織，0.5%KOH溶液調(diào)至pH9.8，3~5分鐘5)機(jī)械力游離-----玻璃勻漿器，注射器(6#針頭)。注意輕緩，減少膜撕裂。

2、酶法----蛋白水解酶，輔助酶 幾種酶或酶與非酶試劑聯(lián)合使用，效果較好。1)蛋白水解酶(proteolyticenzyme)粗胰酶(pancreatin)----混合酶，含胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、RNA酶、脂酶、淀粉酶及磷酸酶。不同批號(hào)和來(lái)源的產(chǎn)品，其組成成分及各成分的活性變化很大----應(yīng)根據(jù)需要選擇不同來(lái)源的產(chǎn)品。

#37℃/R.T.，Trypsin長(zhǎng)時(shí)間(>1hr)消化纖維性組織時(shí)，組織塊表層細(xì)胞可隨時(shí)從纖維網(wǎng)架中脫落下來(lái)，每隔20~30分鐘需用不銹鋼網(wǎng)/銅網(wǎng)(20~50μm)濾過(guò)一次，離心收集這些細(xì)胞，以免細(xì)胞受過(guò)度消化而被破壞。

膠原酶(collagenase)-----20多種，常與胰蛋白酶聯(lián)合使用，適于消化堅(jiān)硬癌組織中結(jié)締組織的纖維成分。最適pH中性屬于金屬酶(可能含Zn2+)，被Ca2+活化，被Mg2+抑制。牛血清不能使其滅活，其作用緩和，可用離心淘洗去除酶。商業(yè)上提供的膠原酶批號(hào)之間常有很大差異，購(gòu)買時(shí)，先試幾種不同來(lái)源的制品，選擇效率高的，再按其批號(hào)一次足量購(gòu)買。

溶菌酶(lysozyme)------作用于細(xì)胞表面糖蛋白的某些糖苷鍵。彈性蛋白酶(elastase)----最適pH10，pH8~9活性也較高，pH6失活。木瓜蛋白酶(papain)---是-SH酶，使用時(shí)應(yīng)加入螯合劑，以防重金屬與酶的-SH結(jié)合。鏈霉蛋白酶(pronase)---廣譜，Ca2+對(duì)其有保護(hù)作用，血清無(wú)終止作用。

2)輔助酶(subsidiaryenzyme)DNA酶----部分細(xì)胞受損，DNA-蛋白質(zhì)釋放出來(lái)形成凝膠，凝集細(xì)胞。

透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)-----對(duì)熱穩(wěn) 定，并具廣泛的最適pH。配制酶溶液----用BSS（平衡鹽溶液） 或培養(yǎng)液。

終止蛋白酶作用的方法：(a)洗滌細(xì)胞，清除蛋白酶；(b)加入蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性地與酶結(jié)合，常用BSA等；(c)加入蛋白酶抑制劑----廣泛存在于動(dòng)、植物組織及血清中。

穩(wěn)定劑(protectiveagent)----隔離劑:防止從組織游離下來(lái)的單個(gè)細(xì)胞發(fā)生聚合或粘附于瓶壁上，常用Methocel(一種甲基纖維素)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、明膠(gelatin)及BSA等。成功地游離細(xì)胞-----精心選擇游離試劑，注意pH、溫度、離子種類和強(qiáng)度、作用時(shí)間及輔助試劑。方法的建立必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索。不同來(lái)源、不同批號(hào)的酶制劑可能有差異二、細(xì)胞器的游離 通過(guò)機(jī)械或化學(xué)的方法破壞細(xì)胞界膜和細(xì)胞內(nèi)膜的連續(xù)性----制備組織或細(xì)胞勻漿。常用方法： 1、Dounce玻璃勻漿器---手動(dòng)，適于培養(yǎng)細(xì)胞和軟組織細(xì)胞制備勻漿。 2、Potter-Elvehjem勻漿器----電動(dòng)或手動(dòng)，適于軟組織(如肝)的勻漿。 3、葉片刀勻漿器(blader)---電動(dòng)，適于較堅(jiān)硬組織(如肌肉、心臟等)的勻漿。 4、超聲波勻漿器 5、用爆發(fā)的負(fù)壓破碎細(xì)胞界膜---適于細(xì)菌勻漿。

三、細(xì)胞與細(xì)胞器的分離細(xì)胞的分離：

大小、密度---密度梯度沉降 表面電荷---電泳 表面特殊成分---親和吸附細(xì)胞器的分離： 差速離心 密度梯度沉降

一)沉降法純化細(xì)胞或細(xì)胞器1、差速離心(differentialcentrifugation)離心是研究如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及各種大分子基本手段。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速超過(guò)25Kr/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100Kr/min，離心力超過(guò)500Kg。1、差速離心(differentialcentrifugation)在密度均一的介質(zhì)中，分別在不同大小離心力場(chǎng)(從小到大)的作用下沉降而分離。由于各種顆粒于離心沉降前在介質(zhì)中均均勻分布，所以，某些慢沉降顆粒被快沉降顆粒裹到后者的沉淀塊中，而使分離不夠完全-----可重復(fù)2~3次，進(jìn)一步純化。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀由于連續(xù)離心會(huì)損傷細(xì)胞，只用于分離大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。細(xì)胞器在差速離心中的沉降順序：核----線粒體----溶酶體與過(guò)氧化物酶體----內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體----核蛋白體1、差速離心(differentialcentrifugation)由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，所以，差速離心分離得到的組分常不只一種，尤其是質(zhì)膜常與各種細(xì)胞器混雜沉降。差速離心可將細(xì)胞器初步分離，再進(jìn)一步通過(guò)密度梯度沉降進(jìn)行分離純化。分離的細(xì)胞器還需經(jīng)過(guò)鑒定。各種細(xì)胞器都有其標(biāo)志物，如溶酶體的標(biāo)志物為酸性磷酸酶。1、差速離心(differentialcentrifugation)

2、密度梯度沉降(densitysedimentation) 用一定的介質(zhì)在試管中形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部或底部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用，使細(xì)胞分層分離。 分為速度沉降和等密度沉降平衡。（1）速度沉降(velocitysedimentation)

細(xì)胞或細(xì)胞器在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中，按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。介質(zhì)密度較低，最大密度小于被分離生物顆粒的最小密度。分離亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，需加離心力場(chǎng)。在沉降最快的生物顆粒達(dá)到管底前停止沉降，并將各部分別收集。低溫下進(jìn)行，保護(hù)細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能。（1）速度沉降(velocitysedimentation)

分離純化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)：(a)大多數(shù)細(xì)胞密度相差不多，而大小差別明顯----分離效果較好；(b)介質(zhì)密度低-----不需高速；(c)時(shí)間短，外力輕-----保持生物材料在結(jié)構(gòu)與功能上的完整性；(d)可在無(wú)菌條件下進(jìn)行全部操作----分離的細(xì)胞可進(jìn)行培養(yǎng)（1）速度沉降(velocitysedimentation)

（2）等密度沉降平衡

(isopycnicsedimentation)細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力、足夠長(zhǎng)時(shí)間，或沉降或飄浮到與自身密度相等的介質(zhì)處。適于分離密度不等的顆粒。介質(zhì)密度較高，其最大密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度。介質(zhì)梯度要求有較高的陡度，不能太平緩。高速或超速離心，時(shí)間也較長(zhǎng)-----對(duì)細(xì)胞不利。（2）等密度沉降平衡

(isopycnicsedimentation)A等速度沉降，B等密度沉降密度梯度沉降法分離細(xì)胞常用的介質(zhì)必須符合的條件：(a)能產(chǎn)生一定陡度的密度梯度，且密度高時(shí)粘度不高；(b)pH中性或易調(diào)為中性；(c)濃度不同時(shí)滲透壓的變化不大（sucrose只能用于分離細(xì)胞器）；(d)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。常用的介質(zhì)：清蛋白、Ficoll（polysucrose，速度沉降或重力沉降）、Percoll等。Percoll為PVP硅膠，廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒；既適于少量細(xì)胞的分離，又適于區(qū)帶大批量分離細(xì)胞；可分離死、活細(xì)胞，30%Percoll一般可截住死細(xì)胞。UV有吸收。為防止細(xì)胞粘附于管壁，可使用聚碳酸酯試管。

二)電泳法分離細(xì)胞 細(xì)胞表面帶正負(fù)電荷，在一定pH環(huán)境下，細(xì)胞表面帶凈電荷，在外加電場(chǎng)中向一定方向泳動(dòng)。 具有不同表面電荷的細(xì)胞器也可通過(guò)電泳達(dá)到分離。

三)親和吸附法分離細(xì)胞 親和吸附是一種特異性吸附反應(yīng)。吸附劑被共價(jià)交聯(lián)到直徑較大、珠粒范圍較窄的瓊脂糖凝膠上，當(dāng)細(xì)胞混懸液通過(guò)柱內(nèi)珠粒時(shí)，與吸附劑結(jié)合的細(xì)胞被留在凝膠床上，而不與吸附劑作用的細(xì)胞則穿過(guò)凝膠柱流出，然后，用適當(dāng)?shù)娜ノ絼⒈晃降募?xì)胞洗脫下來(lái)。1、抗原---抗體(吸附劑)前提：細(xì)胞表面存在特異性抗原。 無(wú)相應(yīng)抗原的細(xì)胞----很快流過(guò)吸附柱(高活率，高回收率) 有相應(yīng)抗原的細(xì)胞----抗原與抗體結(jié)合力強(qiáng)，且難以得到足量的抗原用于洗脫(回收率不高)適合從細(xì)胞懸液中去除某種細(xì)胞。如，從骨髓細(xì)胞中去除白血病細(xì)胞，使用白血病細(xì)胞特有的抗原的抗體作為吸附劑1、抗原---抗體(吸附劑)2、糖蛋白---凝集素(吸附劑)細(xì)胞表面存在著多種糖蛋白，其糖鏈結(jié)構(gòu)因細(xì)胞種類、分化階段及功能狀態(tài)而異，因此，可用此法分離不同種類、不同分化階段或不同功能狀態(tài)的細(xì)胞。糖基與凝集素的結(jié)合可逆性大，此法可得到高活率、高產(chǎn)量的特定細(xì)胞，方便、重復(fù)性好。常用單糖、雙糖或寡糖作為去吸附劑，經(jīng)濟(jì)易得，對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷。避免凝集素與細(xì)胞接觸時(shí)間超過(guò)30分鐘，否則用相關(guān)的糖不能使細(xì)胞與凝集素脫離，此外，也易發(fā)生非特異性結(jié)合或內(nèi)吞，刺激有絲分裂或引起編程性死亡。2、糖蛋白---凝集素(吸附劑)

特異識(shí)別 去吸附劑

花生凝集素(PNA) D-Gal D-Gal 大豆凝集素(SBA) GalNAc GalNAc 蝸牛凝集素(HPA) GalNAc GalNAc 麥胚凝集素(WGA) GlcNAc GlcNAc 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用數(shù)據(jù)手冊(cè)

吳冠蕓、潘華珍主編，科學(xué)出版社，1999年第一版

P220，“常用外源凝聚素的糖特異性”

3、受體---配體(吸附劑) 常用過(guò)量的配體或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑作為洗脫劑。（四）根據(jù)細(xì)胞的生物學(xué)特性分離細(xì)胞如巨噬細(xì)胞可粘著于鋪有LN的、甚至裸露的玻璃或塑料表面，而其它血細(xì)胞則不能。腹水液→鋪有LN的培養(yǎng)瓶，保溫一定時(shí)間→巨噬細(xì)胞粘著

五)流式細(xì)胞術(shù)分離細(xì)胞

流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometer）是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過(guò)程中，包在鞘液中的細(xì)胞通過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。用流式細(xì)胞計(jì)分選細(xì)胞

免疫磁性分離法(ImmunomagncticSeparation)免疫磁性微球(Immunomagncticbeads,IMB)是免疫學(xué)和磁載體技術(shù)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一類新型材料。IMB是包被有單克隆抗體的磁性微球，可與含有相應(yīng)抗原的靶物質(zhì)特異性地結(jié)合形成新的復(fù)合物。通過(guò)磁場(chǎng)時(shí)，這種復(fù)合物可被滯留，與其它組分相分離,該過(guò)程稱為免疫磁性分離法。免疫磁性分離簡(jiǎn)便易行，分離純度高，保留靶物質(zhì)活性，且高效、快速、低毒，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分離和提純、免疫檢測(cè)、核酸分析和基因工程、作靶向釋藥的載體等領(lǐng)域。免疫磁性分離法(ImmunomagncticSeparation)磁性微球結(jié)構(gòu)

磁性物質(zhì)高分子層功能配基

磁性微球由載體微球和配基結(jié)合而成。理想的磁性微球?yàn)榫鶆虻那蛐?、具有超順磁性及保護(hù)性殼的粒子。磁性材料：γ-Fe2O4、Me-Fe2O4（Me=Co，Mn，Ni）、Fe3O4、Ni、Co、Fe、Fe-Co和Ni-Fe合金等，目前被研究最多且應(yīng)用最廣泛的是鐵及其氧化物（Fe、Fe2O4和Fe3O4等）。高分子材料：聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、多糖(纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖等)和牛血清白蛋白等。表面常帶有化學(xué)功能的基團(tuán),如-OH、-NH2、-COOH和-CONO2等，使得磁性微載體就幾乎可以偶聯(lián)任何具有生物活性的蛋白。功能配基：配基必須具有生物專一性的特點(diǎn),而且載體和微球與配基結(jié)合后不影響或改變配基原有的生物學(xué)特性，保證微球的特殊識(shí)別功能。免疫磁性微球的分離原理

直接法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類抗CD3磁球磁球結(jié)合T細(xì)胞加入B和T細(xì)胞中負(fù)向選擇正向選擇磁架進(jìn)行分離間接法對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行分離單克隆抗體CD3羊抗鼠修飾磁球BiomagT細(xì)胞T細(xì)胞免疫磁性微球的應(yīng)用

1、用于細(xì)胞分離和提純使用IMB進(jìn)行分離細(xì)胞有兩種方式；直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞的方法，稱為陽(yáng)性分離；用免疫磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以純化的方法稱為陰性分離。免疫磁珠技術(shù)可用來(lái)分離人類各種細(xì)胞如紅細(xì)胞、外周血嗜酸/堿性粒細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞、造血細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、γδT淋巴細(xì)胞，人類關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞、及多種腫瘤細(xì)胞等。2、體外細(xì)胞擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DC)、造血干、祖細(xì)胞等細(xì)胞在科研及臨床上都具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，但是在體內(nèi)含量較少而且分布廣泛，難以獲得大量高純度的細(xì)胞，限制了該領(lǐng)域的發(fā)展。體外擴(kuò)增輔以免疫磁珠技術(shù)有望解決這一難題。在這一過(guò)程中，用免疫磁性微球分離純化出待擴(kuò)增的細(xì)胞，用特定的因子組合培養(yǎng)，許多研究者用這樣的方法尋找擴(kuò)增的最佳細(xì)胞因子組合和移植的最佳時(shí)機(jī)。免疫磁性微球的應(yīng)用（續(xù)）1

3、免疫檢測(cè)免疫磁性微球可以簡(jiǎn)單快速地從血液或者骨髓中富集、清除癌細(xì)胞，廣泛地應(yīng)用于疾病檢測(cè)、癌癥治療和自身骨髓移植中，還被用于從母體外周血中分離胎兒細(xì)胞進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。免疫磁珠分離技術(shù)用在微生物檢測(cè)方面能準(zhǔn)確快速地檢測(cè)出樣品中的ColiO157，這對(duì)于食品衛(wèi)生和預(yù)防疾病的傳播具有重要的意義。PCR技術(shù)與免疫磁珠技術(shù)結(jié)合在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)等方面有非常重要的作用，這方面的研究在醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的應(yīng)用，可以簡(jiǎn)便快速地診斷膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、腹膜胃癌、上皮腫瘤細(xì)胞等，使免疫磁性分離技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛。4、在核酸與基因工程上的應(yīng)用免疫磁球可以看作是親合層析技術(shù)中的微型配基裁體，借助親合素-生物素（Biotin-Avidin）系統(tǒng)免疫磁球可與非蛋白質(zhì)結(jié)合，生物素和親合素間有著高度的親和力，兩者的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定，在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫組織化學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，與生物磁珠技術(shù)結(jié)合后，更是產(chǎn)生了誘人的發(fā)展前景，并廣泛地應(yīng)用于分離純化RNA、mRNA、核酸片段等及相關(guān)研究。免疫磁性微球的應(yīng)用（續(xù)）2

5、用于分型免疫磁珠法可被應(yīng)用于臨床器官移植供受者的快速選配。在高梯度磁場(chǎng)下,用免疫磁珠法分離靜脈或腹腔血中T、B淋巴細(xì)胞，并利用分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行HLA-ⅠⅡ類抗原分型。如采用磁珠技術(shù)和單抗試劑建立起可在1.5h完成HLA-ⅠⅡ類抗原一類分型的新方法，還可應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)進(jìn)行腎移植供受體的HLA分型、探討血液病患者反復(fù)血小板輸注的治療效果與HLA之間的相關(guān)性。6、

用作靶向釋藥系統(tǒng)的載體免疫磁性微球作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體可使免疫磁性微球上的抗癌藥物更易與癌細(xì)胞接觸，服用這種制劑后，在體外適當(dāng)部位用一適宜強(qiáng)度的磁鐵，將磁性微球引導(dǎo)到體內(nèi)特定靶區(qū)，提高了殺傷癌細(xì)胞的效果。很多研究者使用不同的方法制成了針對(duì)不同癌細(xì)胞的免疫磁性微球，作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體并在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)這種釋藥載體具有良好的功效。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞免疫功能首先要從人或動(dòng)物外周血或組織中獲取有活性的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等。取得有活性的細(xì)胞應(yīng)根據(jù)不同目的，采用不同方法，考慮(1)細(xì)胞純度；(2)細(xì)胞獲得量；(3)細(xì)胞活力；(4)使用方法的簡(jiǎn)易程度和本室條件等。目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞。

(一)原理:

常用來(lái)分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分層液比重是1.077±0.001的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2g／ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過(guò)生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(二)方法:

1.在短中管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。

2.取肝素抗凝靜脈血與等量Hank‘s液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。

3.離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank’s液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞4.用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細(xì)胞兩次。5.末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2％臺(tái)盼蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。

6.細(xì)胞活力檢測(cè)：死的細(xì)胞可被染成蘭色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞。計(jì)算出活細(xì)胞百分率。

用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達(dá)80～90％，活細(xì)胞百分率在95％以上。Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化

淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞

(一)原理Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm／kgH２O),粘度也很小，可形成高達(dá)1.3g／ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力(200～1000g)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外