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僅供個(gè)人參考Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;notforcommercialuse堿磷酸酶氏數(shù)測(cè)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^(guò)堿性磷酸酶alkaline,)氏常數(shù)的測(cè)定,了解其測(cè)定方法和意義會(huì)用標(biāo)準(zhǔn)曲線定酶的活性及觀察抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響深對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的理解?!緦?shí)驗(yàn)原理】本實(shí)驗(yàn)以磷酸苯二鈉為底物,由堿性磷酸酶催化水解,生成游離酚和磷酸鹽。酚在堿性條件下與氨基安替比林作用,經(jīng)鐵氰化鉀氧化,生成紅色的醌衍生物,顏色深淺和酚的含量成正比據(jù)光的大小可以計(jì)算出酶的活性可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查知酚的含量,進(jìn)而算出酶活性的大小?!緦?shí)驗(yàn)步驟底濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響(1)取支管,作好標(biāo)記。按下表操作加制組另取6試/ml
管123456
支試管,做好標(biāo)底物酸緩液0.700.70蒸水37水中溫5鐘
記下表操作:(高精氨組)AKP酶最底物濃(試/ml
0.51.01.52.00.0管123456底物0.100.30精酸液0.100.100.10酸緩液0.700.70蒸水0.850.3537水中溫5分AKP酶0.100.10最底物濃(0.51.50.0(2)加酶(0.05μg/ml)后,各混勻并立即記錄時(shí)間,將上述各管置37水浴中準(zhǔn)確保溫15分。(3)保結(jié)束,立即加堿性溶液1.1ml終反應(yīng)。(4)各分別加入0.3%4-氨基替比林1.0ml0.5%鐵氰化鉀2.0ml,充分混勻,放置10分,以6號(hào)空管作對(duì)照,510nm波處比色,根據(jù)酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。(5)以管基質(zhì)濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)各管吸光度值的倒數(shù)或者以酶活性單位的倒數(shù)為1/V做坐標(biāo),作圖求出Km值。2.酚準(zhǔn)曲線的繪制(1)取凈干燥試管6支按下表依次加入試劑:(2)混后室溫放置15分鐘于510nm波長(zhǎng)處比色。(3)以含量(μg)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。試/ml不得用于商業(yè)用途
管
僅供個(gè)人參考mg/ml酚標(biāo)溶0.0
3560.100.40蒸水℃水保分
1.901.60堿溶
1.101.101.101.10氨基安比林1.0
鐵氰鉀
2.02.02.0【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】1.未抑劑底物濃度(mmol/L)0.5001.0001.5002.0004.000濃度倒數(shù)1/S吸光度吸光度倒數(shù)1/V
2.0001.0000.6670.5000.2500.1290.2460.2880.3870.7527.7524.0653.4722.5841.330得到擬合直線方程:y=3.5275x+0.7246根據(jù)=1/0.7246=1.382,=*3.5275=4.871
可得到:2.高氨組底物濃度(mmol/L)0.5001.0001.5002.0004.000濃度倒數(shù)1/S吸光度吸光度倒數(shù)1/V
2.0001.0000.6670.5000.2500.1300.2590.3030.4460.6247.6923.8613.3002.2421.603得到擬合直線方程:=3.4764x0.6688根據(jù)=1/0.6688=1.495,=*3.4764=5.198
可得到:3.酚準(zhǔn)曲線分析:由上述圖表來(lái)看,在加入高精氨酸抑制酶活性后,酶的Km值大,值增大【實(shí)驗(yàn)討論】1.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,滴加試劑和反應(yīng)時(shí)間的控制一定要準(zhǔn)確,以保證得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.Km值最大反應(yīng)速率一半時(shí)物濃度只與酶的結(jié)構(gòu)反應(yīng)物和環(huán)境有關(guān)而酶的濃度沒(méi)有關(guān)系;所以Km值以示酶與底物之間的親和力Km值越,親和力越高,越容易反應(yīng);反之,值越大,親和力余地,越不易反應(yīng)。不得用于商業(yè)用途
僅供個(gè)人參考僅供個(gè)用學(xué)習(xí)、究不得用商業(yè)用。Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;forcommercialuse.Nurfürdenpers?nlichenfürStudien,Forschung,zukommerziellenZweckenverwendetwerden.Pourl'étudeetlarechercheuniquementàdesfinspersonnelles;àdesfinscommerciales.только
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