核酸提取經(jīng)驗(yàn)及原理課件

核酸提取經(jīng)驗(yàn)及原理總結(jié)

主辦單位：螺旋網(wǎng)主講人：wsuquan時(shí)間：2008.4.21主要內(nèi)容一、核酸的發(fā)現(xiàn)、核酸的分類和功能、核酸的理化性質(zhì)二、細(xì)胞裂解三、核酸提取四、核酸純化五、核酸檢測六、核酸除雜質(zhì)

核酸的發(fā)現(xiàn)核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，他當(dāng)時(shí)稱之為核素。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認(rèn)識其酸性后，定名為核酸。核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。核糖核酸（RNA）RNA主要是負(fù)責(zé)DNA遺傳信息的翻譯和表達(dá)，分子量要比DNA小得多。RNA為單鏈分子，根據(jù)RNA的功能，可以分為三種：信使核糖核酸（mRNA）；轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸（tRNA）；核蛋白體核糖核酸（rRNA）。核酸的理化性質(zhì)RNA的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。細(xì)胞裂解裂解原理細(xì)胞的裂解方法裂解方法的評價(jià)樣品與裂解液的比例細(xì)胞裂解-裂解原理經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑和鹽。鹽的作用，除了提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時(shí)，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。細(xì)胞裂解-裂解方法的評價(jià)含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組DNA的首選。高濃度蛋白質(zhì)變性劑(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首選。含CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細(xì)菌、植物的基因組DNA抽提的首選裂解方法。SDS堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組DNA污染的特點(diǎn)。核酸提取提取是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程。RNA提取總RNA的試劑盒快速提取

蛋白酶－熱酚法氯化鋰法提取總RNA核酸純化-方法經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)密度梯度離心法使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)核酸純化-純化方法評價(jià)針對不同的用途，選擇不同的純化方法，任何一種方法他都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在試驗(yàn)中，沒有錯(cuò)誤的方法，只是選擇的方法不正確。核酸純化-醇的沉淀沉淀的原理目的沉淀劑的選擇沉淀溫度的選擇核酸純化-醇的沉淀-目的目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽的分離。核酸純化-醇的沉淀-溫度如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時(shí)，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時(shí)，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時(shí)，效果不明顯，但卻會導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。核酸純化-核酸的洗滌洗滌目的方法首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時(shí)間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(shí)(使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。核酸純化-核酸保存核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。一般的我們選擇，-20℃或70℃保存的穩(wěn)定。如果溫度不合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個(gè)原因則是保存核酸溶液的pH值不合適導(dǎo)致的水解。還有一個(gè)不為人重視的，就是EP管對核酸的影響。核酸純化-核酸的濃縮應(yīng)用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價(jià)陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收?；厥盏暮怂峥砂此铦舛?，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。關(guān)于紫外分光光度儀的檢測在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。關(guān)于電泳檢測觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。核酸中雜質(zhì)的去除肝糖元、淀粉及粘多糖蛋白質(zhì)的除去不同類型核酸的分離同類核酸的分離核酸中除雜質(zhì)-蛋白質(zhì)的除去①加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可反復(fù)使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結(jié)合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質(zhì)在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復(fù)使用。③苯酚水溶液抽提，在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，DNA或RNA都可以進(jìn)入水相，蛋白質(zhì)則沉淀于酚層，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，殘余的酚可用葡聚糖凝膠G-10或G-25除去。核酸中除雜質(zhì)-不同類型核酸的分離在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是較有效和常用的方法。在DNA中加核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA，是